青稞CHS基因的克隆及原核表达分析

为进一步研究查尔酮合酶（Chalcone synthase,CHS）在黄酮化合物代谢过程中的作用,以青稞94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHS基因,并对分离得到的CHS基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHS基因编码区长为1 197 bp,编码398个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为43.479 kDa,预测等电点(pI)为5.92,是酸性蛋白;该酶蛋白体外红细胞中的半衰期为30 h,不稳定系数(II)大于40,属于不稳定蛋白;平均亲水指数为-0.090,是亲水性的蛋白。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并在大肠杆菌BL21中表达,可得到64 kDa左右的融合蛋白,在IPTG诱导浓度为1.0 mmol·L^-1时,最佳诱导时间为3 h。     

大豆异黄酮合成关键酶基因的克隆及表达分析

采用RT-PCR法克隆了大豆异黄酮生物合成途径中查尔酮合酶(Chalcone synthase,CHS)和查尔酮异构酶(Chalcone Isomerase,CHI)2个关键酶基因,并利用SOE-PCR技术成功将2个基因融合,将其均构建成原核表达载体,在大肠杆菌中进行了初步的表达研究,为进一步研究CHS和CHI 2种关...     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因的克隆、表达及功能分析

茶树二氢黄酮醇4-还原酶(dihydroflavonol 4-reductase,DFR)是儿茶素合成途径中的关键酶。本研究采用RT-PCR技术,获得了茶树二氢黄酮醇4-还原酶基因(CsDFR)的开放阅读框,它编码含347个氨基酸的蛋白质,推测分子量为38.69 kD,等电点为6.02。成功地将该基因重组到表达载体SUMO上,并在大肠杆菌BL21中进行原核表达;优化了原核表达中诱导时间、诱导温度、IPTG浓度;纯化出目的蛋白。利用HPLC-MS方法对重组蛋白进行了体外酶活检测,结果表明目的蛋白具有DFR酶活性,可催化DHQ和DHM的还原反应。     

海南龙血树查尔酮合酶基因(DcCHS)的克隆及表达分析

利用RT-PCR和RACE技术对海南龙血树查尔酮合酶基因进行克隆,得到1条1 456 bp的cDNA序列,命名为DcCHS。DcCHS含有1 173 bp的阅读框架、99 bp的5′非编码区和184 bp的3′非编码区,编码390个氨基酸。DcCHS与其他植物的CHS氨基酸序列同源性高达84%以上,具有高度保守的CHS_like结构域、活性位点以及信号序列。推测DcCHS的分子量为42.7 ku,等电点pI为6.14,稳定性极差,具有15个磷酸化位点,无跨膜结构,无信号肽,亚细胞定位在细胞质的可能性较大,并预测了蛋白质的二级、三级结构。组织特异性分析结果表明,DcCHS在花中的表达远远高于根、茎、叶和果实。     

青稞CHI基因的克隆及原核表达分析

为了进一步了解CHI基因在青稞黄酮合成中所起的作用,以青稞品系94-19-1为材料,通过同源克隆技术分离CHI基因,并对分离得到的CHI基因进行生物信息学分析及原核表达。结果表明,从青稞94-19-1中克隆得到的CHI基因编码区长为696bp,编码231个氨基酸。序列分析表明,青稞CHI基因有4个碱基和大麦不同,导致1个氨基酸发生改变。SDS-PAGE检测结果表明,将该基因克隆到表达载体pET-32a上,并转化大肠杆菌BL21后,经诱导可成功表达出融合蛋白。     

木薯查尔酮合酶MeCHS基因家族特征与表达分析

查尔酮合酶（chalconesynthase,CHS）是类黄酮合成途径的第一个限速酶,在植物花色形成、生长发育以及非生物胁迫中发挥着重要作用。为明确木薯MeCHS基因家族的特性及在木薯块根采后腐烂（PPD）中的表达,本研究利用生物信息学方法对木薯MeCHS基因家族成员进行理化性质、蛋白质结构等分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测MeCHS基因在不同品种、不同组织及块根PPD过程中的表达情况,同时克隆并构建3个高表达的MeCHS基因的亚细胞定位载体并进行烟草瞬时转化以确定其定位。在木薯基因组中共鉴定出5个MeCHS基因家族成员,蛋白质二级结构以α-螺旋和不规则卷曲为主。qRT-PCR分析发现：MeCHS基因表达具有明显的组织特异性,在茎中表达水平最高;在木薯中主要表达的MeCHS基因为MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3,且3个基因随着SC8块根贮藏时间的延长表达量逐步升高。将成功克隆得到的MeCHS1、MeCHS2和MeCHS3基因经农杆菌介导瞬时转化烟草下表皮细胞,显微观察表明3个基因均定位于细胞质,与预测结果相符。该研究结果可为进一步揭示木薯MeCHS基因家族的功...     

玉米株型相关基因ZmDwarf2的克隆及表达分析

以玉米紧凑型自交系豫82、平展型自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆了与水稻Dwarf基因同源的玉米Dwarf2基因,该基因水稻上通过参与BR生物合成途径调控其株型形态建成。序列分析发现,玉米Dwarf2基因cDNA序列全长1 501bp,开放阅读框1 398bp,编码465个氨基酸。与水稻Dwarf基因的同源度达84%。实时荧光定量PCR分析表明,豫82、沈137中Dwarf2基因表达趋势基本一致,3～4叶期表达量低,8～12叶期处于表达高峰,13叶期后表达量逐渐下降。沈137中表达量较豫82高;就不同器官来说,沈137在叶片、叶枕、叶鞘、茎尖等器官中表达量较豫82高,其中,叶枕处ZmDwarf2表达量相对较高,而叶鞘上ZmDwarf2表达量相对较低。可以推测,基因ZmDwarf2可能参与玉米中BR生物合成途径,进而调控其相关株型形态建成。     

小麦BES1转录因子基因 TaBEH3的克隆及表达分析

BES1(油菜素内酯不敏感1-甲磺酸乙酯-抑制剂1)是一类植物特有的转录因子家族, TaBEH3基因是小麦 BES1基因家族成员之一,为进一步了解该基因的功能,以中国春为材料,克隆了 TaBEH3基因,将其3个同源基因分别命名为 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D。序列分析显示,3个同源基因均包含2个外显子,分别编码356、354和358个氨基酸,启动子区含有大量与植物生长发育、激素响应相关的顺式作用元件,其中,分生组织表达元件（CAT-box）和脱落酸响应元件（ABRE）在3个基因中普遍存在。系统进化树分析显示, TaBEH3基因在麦类作物中具有更近的亲缘关系。基于qRT-PCR进行的时空表达分析显示, TaBEH3基因在不同组织和不同器官间均有组成性表达,表明 TaBEH3基因在植物生长发育（特别是花器官的发育和形成）过程中具有重要的作用。 TaBEH3-A、 TaBEH3-B和 TaBEH3-D基因响应ABA激素胁迫处理,且3个基因的表达量变化趋势一致。     

小麦 TaWIN1基因的克隆和表达分析

14-3-3蛋白家族在植物生长发育和逆境胁迫响应中发挥着重要作用。 TaWIN1基因是小麦14-3-3基因家族成员之一,为了进一步了解该基因的功能,本研究以普通小麦中国春为材料克隆了 TaWIN1基因并进行了生物信息学分析和表达分析。结果表明, TaWIN1基因含有801 bp的开放阅读框,编码266个氨基酸,含有完整的14-3-3蛋白家族结构域;该基因的编码蛋白为酸性蛋白,不具有跨膜区,可能定位于细胞质;进化分析显示,小麦TaWIN1蛋白与大麦14-3-3E、二穗短柄草GF14-D的亲缘关系最近; TaWIN1基因在小麦不同发育时期和不同组织中均有表达,但在10 mm幼穗中的相对表达量最高,其次为苗期叶片和旗叶,在根中表达量最低;根中 TaWIN1基因在干旱、高温、低温和盐胁迫下均显著上调表达;叶片中 TaWIN1基因在干旱、低温和盐胁迫下均显著上调表达,而在高温下则显著下调表达。     

小麦TaPP2C59基因的克隆及表达分析

2C型蛋白磷酸酶(PP2C)是ABA信号途径的关键组分,在ABA信号转导及植物对非生物逆境胁迫的应答过程中发挥着重要作用。为给TaPP2C59基因功能的研究奠定基础,同时为小麦对非生物胁迫应答的信号转导机理研究提供参考,本研究从小麦中克隆了第一个PP2C基因TaPP2C59,并对其在逆境胁迫以及多种信号分子处理下的表达模式进行研究。序列分析表明,该基因开放阅读框(ORF)为855bp,编码284个氨基酸。进化树分析表明,该基因编码的蛋白与水稻OsPP2C45蛋白和拟南芥AtPP2C59蛋白的亲缘关系最近。多序列比对分析表明,TaPP2C59具有PP2C家族蛋白的保守结构特征。实时荧光定量PCR分析表明,该基因的表达显著受ABA、低温和高盐胁迫抑制。因此,可以推测TaPP2C59可能作为负调控因子参与ABA信号及非生物逆境胁迫应答。     

二穗短柄草2C型蛋白磷酸基因BdPP2C1的克隆及表达分析

从二穗短柄草中扩增得到一个2C型蛋白磷酸酶基因,命名为BdPP2C1。BdPP2C1与拟南芥中PP2C家族进行系统进化分析,结果表明,BdPP2C1与拟南芥A类PP2C家族成员的亲缘关系较近。利用实时荧光定量PCR表达分析系统,分析在非生物逆境胁迫及相关信号分子处理下BdPP2C1基因的表达情况。结果表明:该基因的表达受脱落酸(ABA)和双氧水抑制,并且受渗透和低温胁迫诱导。因此,BdPP2C1是非生物逆境胁迫中的一个应答因子,并且可能受相关信号分子调控。     

香蕉MaTPS4基因序列及表达特性分析

通过随机克隆测序法从香蕉根系c DNA文库中获得海藻糖合成酶基因,命名为MaTPS4,全长c DNA序列为2 930 bp,含一个完整的开放阅读框2 574 bp,编码857个氨基酸。生物学信息分析表明,MaTPS4蛋白属于不稳定、疏水性蛋白,pI5.59,结构域TPS和TPP。序列预测分析表明,MaTPS4蛋白定位于细胞质中,具有3个跨膜区域,不存在信号肽。与其他已知植物TPS氨基酸序列同源比对,同源性达到84.90%;进化关系分析表明,香蕉MaTPS4氨基酸与银杏TPS氨基酸序列(AAX16014.1)聚为一类,二者亲缘关系较近,同源性为99%。器官特异性分析表明,MaTPS4在香蕉根系、球茎、假茎、叶、花、果实各器官中均有表达,其中球茎、假茎、叶片和花中表达量较大,根及果实中表达量极少。q RT-PCR分析表明,MaTPS4在根系中的表达经干旱、盐胁迫后均增强,其中盐胁迫24 h时MaTPS4表达量较0 h时高5倍;冷胁迫下,MaTPS4表达量增加,并随时间延长下降,在6 h达到最大;ABA胁迫下,MaTPS4表达量增加,为0 h的5倍;在ACC和Foc TR4胁迫下,MaTPS4表达无变化。因此,MaTPS4可能通过依赖ABA途径调控抗逆胁迫相关基因表达,提高植株对非生物胁迫的抗逆性。     

龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

小麦耐盐相关基因TaHAK1的克隆与表达分析

为了解小麦品种山融3号耐盐性的基因状况,以大麦HvHAK1为探针,通过电子克隆和PCR方法,从该品种根的cDNA文库中克隆到一个小麦的耐盐相关基因TaHAK1（High Affinity K＋transporter1）。该基因ORF全长2 405bp,编码776个氨基酸,含有8个内含子。与已报道的大麦、水稻、玉米等单子叶植物的HAK基因具有较高的相似性。RT-PCR分析表明,TaHAK1在小麦根中表达量较高,且受钾饥饿和盐胁迫诱导表达。在200mmol.L-1 NaCl胁迫条件下,TaHAK1在耐盐小麦品种山融3号中的最高表达量高于在盐敏小麦品种济南177中的最高表达量。这些结果说明,在小麦中克隆到了大麦HvHAK1的同源基因,该基因参与了小麦对高盐、低钾等非生物胁迫的响应,可能对山融3号的耐盐性具有一定贡献。     

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。     

甘蔗TB1基因的克隆与生物信息学分析

以负调控禾本科植物分蘖的关键基因TB1为研究对象,根据水稻、玉米、高粱TB1同源基因保守序列设计引物,使用RT-PCR方法和RACE技术从甘蔗茎尖处克隆到该基因的同源基因ScTB1。ScTB1 cDNA全长1 668 bp,包含274 bp的5′ UTR,1 149 bp的CDS和245 bp的3′ UTR。生物信息学分析表明该基因可编码382个氨基酸残基,编码产物含有保守的SP区、TCP区和R区,属于TCP家族转录因子。其分子量为40.7 ku,理论等电点为8.55,蛋白亚细胞定位预测其主要定位于细胞质。系统进化分析表明ScTB1属于CYC/TB1亚族蛋白,与高粱TB1和玉米TB1聚为一个亚类。根据序列的保守性和预测结果可推测ScTB1很可能也参与了甘蔗分蘖性状的调控。     

玉米抗病相关基因ZmEDS1的克隆及表达分析

从玉米中克隆ZmEDS1基因的cDNA序列,全长2 164 bp,开放阅读框(Open reading frame,ORF)长1 860 bp,编码619个氨基酸。生物信息学分析表明,该基因编码的蛋白等电点为6.05,分子量为68.74 kDa,内部无信号肽结构,N端有一个酯酶结构域。系统进化树分析表明,玉米ZmEDS1蛋白和高粱EDS1L蛋白的亲缘关系最近,同源性高达94%。采用实时荧光定量PCR分析病毒侵染下该基因在感性材料郑58和抗性材料D863F中的表达模式,在两种材料中,ZmEDS1基因均在病毒侵染48 h的表达量最高,分别达到0 h对照组感、抗材料的1.56、3.47倍,在抗病材料D863F中的表达水平高于感病材料郑58。初步判断,ZmEDS1基因应答病毒的侵染过程,且在感病材料和抗病材料中的响应模式存在差异。     

芒果核苷二磷酸激酶(NDPK)基因克隆及表达分析

采用3′RACE和RT-PCR技术克隆芒果核苷二磷酸激酶基因全长c DNA序列,并用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式。结果表明:Mi NDPK1基因c DNA全长1 019 bp,开放阅读框为447 bp,编码148个氨基酸。Mi NDPK1蛋白定位于细胞质,无信号肽和跨膜区域,具有典型的核苷二磷酸激酶活性结构域和其他磷酸化活性位点;与麻疯树、橡胶树同源性最高为89%,与菠菜同源性最低为82%。Mi NDPK1在芒果各组织中均有表达,以叶片中表达最高,其次是花和果皮;在芒果进入生殖时期的花芽分化期表达量最高,此后在芒果果实发育进程中逐渐降低并趋于平稳。结合病害处理转录组样本中的差异性表达结果,推测芒果Mi NDPK1基因在花芽分化进程、抗病性诱导及免疫应答通路上发挥重要作用。