黄牛LYST基因InDel检测及其与生长性状的关联分析

以LYST基因作为候选基因,基于GeneBank提供的序列,以鲁西牛、南阳牛、秦川牛、郏县红牛4个品种共计602个个体为试验材料,利用DNA池测序结合聚丙烯酰胺凝胶电泳对LYST基因的插入缺失(InDel)进行探索验证,并对不同个体进行基因分型,再结合体尺数据分析不同基因型与生长性状的关系。结果表明:(1)黄牛LYST基因的第44内含子上检测到一段InDel,片段长度为22bp;(2)LYST基因内含子区P2InDel突变位点在郏县红牛、秦川牛、鲁西牛群体中均存在II、ID、DD共3种基因型,而在南阳牛群体中仅存在野生纯合基因型DD和杂合子ID两种基因型,无II基因型存在;(3)LYST基因第28号内含子区InDel位点多态性与郏县红牛的体高、胸围、体重、重高比及体躯指数之间存在显著相关性,可以作为候选分子标记用于郏县红牛分子标记辅助选择。结论:本研究在LYST基因第28内含子发现一个能显著影响郏县红牛生长性状的22bp插入突变,该突变可作为郏县红牛生长性状的潜在分子标记。     

禾本科8种牧草DNA条形码通用序列筛选

DNA条形码技术是利用DNA保守片段对物种进行快速准确鉴定的新兴技术。本研究根据GenBank中禾本科牧草matK和rbcL基因的核苷酸序列,设计4对通用引物,建立并优化了针对禾本科7个主要牧草属8种牧草11个样品[高丹草(Sorghum bicolor×S.sudanense)、玉米(Zea mays)、针茅(Stipa capillata)、"贝克"多年生黑麦草(Lolium perenne‘Plxie)、"凯帝莎"多年生黑麦草(L.perenne‘Caddieshack’)、甘肃羊茅(Festuca kansuensis)、"百琪"紫羊茅(F.rubra‘Bargena’)、"梦神"紫羊茅(F.rubra‘Maxima’)、"百胜"草地早熟禾(Poa pratensis‘Barvictor’)、"钻石"草地早熟禾(P.pratensis‘Diamond’)和芨芨草(Achnatherum splendens)]的目的片段的扩增条件。对扩增产物进行测序和分析,经分别比对,筛选出8种牧草的4个标记位点5’端和3’端保守序列。对各标记位点保守区内的核苷酸进行单核苷酸多态性(SNPs)的单倍型分析。结果表明,matK1、matK2、matK3分别有6个单倍型(H1~A、H1~B、H1~C、H1~D、H1~E和H1~F)、7个单倍型(H2~A、H2~B、H2~C、H2~D、H2~E、H2~F和H2~G)和3个单倍型(H3~A、H3~B和H3~C),rbcL基因有5个单倍型(H4~A、H4~B、H4~C、H4~D和H4~E)。根据matK(matK1、matK2、matK3)和rbcL基因筛选的4个标记位点为8种牧草建立了相对应的特异DNA识别码。本研究可为混合禾本科牧草饲料中的高粱属、玉蜀黍属、芨芨草属、针茅属、黑麦草属、羊茅属和早熟禾属的8种牧草准确识别提供分子水平上的科学依据。     

草原红牛生长激素基因遗传多态性研究

为寻找可用于标记辅助选择的分子标记,研究以草原红牛为试验群体,采用单链构象多态性（PCR—SSCP）方法检测了GH基因遗传多态性,并对GH基因多态片段进行了克隆、测序,确定了多态位点的变异位置和碱基类型。检测结果表明：在GH基因5’末端、第3内含子、第4内含子、外显子5和3’末端存在多态性位点,其中在5’上游431处有一个A→G碱基的突变,在1435处发生了T→C的突变,第4内含子1918处发生了C→A的突变;外显子5的2291处发生了碱基A→C突变;3’末端2639处发生了碱基C→G突变,并导致一个HaeⅢ酶切位点的增加;同时与GenBank中序列（accession numberM57764）相比较,草原红牛在1692处有C→T的突变,在2735处有碱基T→C突变,这些突变位点为草原红牛所特有。     

羊RBP4基因DNA池测序分析

选择黔北麻羊、内蒙古白绒山羊、关中奶山羊3个山羊品种构建品种DNA池。对RBP4基因部分CDS区和3’UTR进行PCR产物扩增，并采用直接测序法进行测序。结果表明：所选山羊品种RBP4基因分CDS区和3’UTR区，无突变位点存在。序列分析表明，山羊与其他物种RBP4基因的同源性很高，其中以牛最高，达到98．8％。系统进化分析表明，羊和牛在同一进化支上。生物信息分析表明：RBP4基因所表达蛋白氨基酸序列中有5个磷酸化位点。因此，山羊RBP4基因在进化过程中是高度保守的。研究结果可为进一步分析山羊RBP4基因功能遗传变异提供借鉴。     

伪狂犬病病毒鄂A株TK—／LacZ＋突变株的构建

本研究以地高辛标记的含TK基因的BamHI/KpnI片段为探针，通过Southern杂交确定伪狂犬病病毒鄂A株基因组中一大小约5．9kb的KpnI片段中含有TK基因，回收该片段并克隆于PUC18铁KpnI位点，然后进一步克隆其中含TK基因的PstI/KpnI片段，并将LacZ表达盒插入到该片段中的BamHi位点，构建转移质粒pUEKPZ，该将质粒与伪狂犬病病毒鄂A株基因组共转染PK－15细胞，待完全病变后在X－gal存在下筛选蓝斑，蓝斑纯化3次后，经PCR扩增，Southern杂交证实获得的病毒为伪狂犬病病毒鄂A株TK－／LacZ 突变株。     

杂花苜蓿叶绿体基因组特征及系统发育分析

本研究以‘草原3号’杂花苜蓿(Medicago varia‘Caoyuan No.3’)为材料，采用第二代高通量测序技术，对叶绿体基因组序列进行分析、组装及注释，以探究杂花苜蓿在系统发育中的位置及在分子水平上与其近缘物种的关系。结果表明：杂花苜蓿绿体基因组全长125 317 bp,为典型四分体结构，不存在IR区缺失的情况，GC含量为33.87%。叶绿体基因组共编码106个基因，其中蛋白质编码基因54个，涉及36 498个密码子。3种不同类型的88个SSR位点分布不均衡，在LSC,SSC,IR区域的SSR数量各自为79,7和2个。对苜蓿属7个植物进行共线性分析发现其重排现象严重。系统发育分析发现杂花苜蓿与紫花苜蓿的亲缘关系最近。本研究可为苜蓿属植物遗传变异、特异基因挖掘以及品种选育改良等研究提供参考。     

山羊PMEL基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在筛选调控山羊毛色基因PMEL的启动子活性区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为彩色山羊的育种和改良提供思路。以山羊基因组DNA为模板,PCR扩增PMEL基因不同长度的启动子缺失片段,定向克隆至pGL3-basic载体,将重组质粒转染到293T和A375细胞,通过双荧光素酶检测系统测定相对荧光素酶活性值;利用生物信息学方法对PMEL基因核心启动子区的转录因子结合位点进行预测,随后利用重叠延伸PCR分别对pGL3-327质粒上预测的转录因子结合位点进行点突变并构建突变载体,利用双荧光素酶检测系统进行活性验证。结果显示,本研究成功构建了7个不同长度的启动子片段,其中6个片段具有明显的启动子活性。经过双荧光素酶活性检测发现山羊PMEL基因-251/+76区域为核心启动子区域。通过不同长度的启动子片段的活性比较发现,-251/-62区域的缺失造成启动子活性从最高到消失,表明该区域对山羊PMEL基因转录调控有重要影响,生物信息学分析发现该区域存在5个转录因子结合位点,利用点突变构建了5个突变载体,经过双荧光素酶检测发现5个突变载体的活性均显著下降。提示这5个转录因子是山羊PMEL基因转录的正调控元件。本研究确定了山羊PMEL基因启动子核心区域为-251/+76,NF-1(-206/-197)、Sp1(-186/-174)、Sp1(-151/-139)、CREB(-91/-82)和Sp1(-82/-71)结合位点为山羊PMEL基因转录的正调控元件。     

大白猪MYOD1、AKT3基因启动子区多态性及生物信息学分析

为探究MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性及其可能存在的影响基因表达的分子调控机制,试验采用PCR直接测序的方法对大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性进行检测,同时利用生物信息学分析方法预测了大白猪MYOD1和AKT3基因的核心启动子区、CpG岛和转录因子结合域。结果显示,MYOD1基因共预测到5个核心启动子区、1个CpG岛区域和10个转录因子结合域,且第5个核心启动子区位于CpG岛区域内;AKT3基因共预测到6个核心启动子区,未发现CpG岛的存在。通过直接测序的方法检测到MYOD1基因在G-361T处存在1个SNP突变,但在本试验群体中只发现1种基因型,同时该突变位点位于第1个核心启动子区内;AKT3基因在启动子区T-1709C处存在1个SNP突变,包括TT、TC和CC 3种基因型,其中TT基因型为优势基因型,T为优势等位基因。遗传多态性分析提示,该突变位点多态信息含量(PIC)介于0.25～0.5之间,表现为中度多态。本研究初步探究了大白猪MYOD1和AKT3基因启动子区的多态性并预测了启动子区可能的调控因子和调控元件,为进一步研究MYOD1、AKT3基因对肌肉生长发育的调控机制及将突变位点作为遗传标记用于分子选育提供指导和依据。     

广东桑(Morus atropurpurea)叶绿体基因组高通量测序及结构分析

叶绿体基因组的结构和组成较为保守且其序列片段的变异速率适中,适合用于研究植物的系统进化。以我国主要栽培桑种广东桑(Morus atropurpurea)的品种一串红为实验材料,利用Illumina高通量测序平台进行广东桑叶绿体全基因组测序,分析基因组结构,并且与已报道近缘物种的叶绿体基因组进行比较。广东桑叶绿体基因组长159 113 bp,2个反向重复区(IRa和IRb)长度均为25 707 bp,被大单拷贝区(LSC)和小单拷贝区(SSC)分隔开,LSC和SSC大小分别为87 824 bp、19 875bp;叶绿体基因组共有130个基因,包含85个蛋白质的编码基因、37个t RNA基因和8个r RNA基因,其中含有内含子的基因数量是24个,有22个基因只含有1个内含子,2个基因(ycf3和clp P)含有2个内含子。广东桑叶绿体基因组的基因数目、种类以及CG含量与其它桑属植物的叶绿体基因组类似。通过生物信息学分析在广东桑叶绿体基因组得到83个简单重复序列(SSR)位点,单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸和五核苷酸重复基序的数量分别是60、8、3、10、2个,未发现六核苷酸重复序列,大多数位点都偏向A或T组成。用MEGA 6.0软件通过最大似然法和邻近法基于叶绿体全基因组序列对包括4个桑种在内的14个物种进行聚类分析,其中广东桑和蒙桑(Morus mongolica)聚在一起,印度桑(Morus indica)和川桑(Morus notabilis)聚在一起。研究结果对于叶绿体基因组工程研究以及桑属种间的分子标记开发和优良品种培育具有一定参考价值。     

Novel insertion mutation of ABCB1 gene in an ivermectin-sensitive Border Collie

P-glycoprotein (P-gp) is encoded by the ABCB1 gene and acts as an efflux pump for xenobiotics. In the Border Collie, a nonsense mutation caused by a 4-base pair deletion in the ABCB1 gene is associated with a premature stop to P-gp synthesis. In this study, we examined the full-length coding sequence of the ABCB1 gene in an ivermectin-sensitive Border Collie that lacked the aforementioned deletion mutation. The sequence was compared to the corresponding sequences of a wild-type Beagle and seven ivermectin-tolerant family members of the Border Collie. When compared to the wild-type Beagle sequence, that of the ivermectin-sensitive Border Collie was found to have one insertion mutation and eight single nucleotide polymorphisms (SNPs) in the coding sequence of the ABCB1 gene. While the eight SNPs were also found in the family members'' sequences, the insertion mutation was found only in the ivermectin-sensitive dog. These results suggest the possibility that the SNPs are species-specific features of the ABCB1 gene in Border Collies, and that the insertion mutation may be related to ivermectin intolerance.     

Identification and characterization of polymorphisms within the 5' flanking region, first exon and part of first intron of bovine GH gene

The aim of the present study was to identify and characterize polymorphisms within the 5′ flanking region, first exon and part of first intron of the bovine growth hormone gene among different beef cattle breeds: Nelore (n = 25), Simmental (n = 39), Simbrasil (n = 24), Simmental × Nelore (n = 30), Canchim × Nelore (n = 30) and Angus × Nelore (n = 30). Two DNA fragments (GH1, 464 bp and GH2, 453 bp) were amplified by polymerase chain reaction and then used for polymorphism identification by SSCP. Within the GH1 fragment, five polymorphisms were identified, corresponding to three different alleles: GH1.1, GH1.2 and GH1.3 (GenBank: AY662648 , AY662649 and AY662650 , respectively). These allele sequences were aligned and compared with bovine GH gene nucleotide sequence (GenBank: M57764 and AF118837 ), resulting in the identification of five insertion/deletions (INDELs) and five single nucleotide polymorphisms (SNPs). In the GH2 fragment two alleles were identified, GH2.1 and GH2.2 (GenBank: AY662651 and AY662652 , respectively). The allele sequences were compared with GenBank sequences ( M57764 , AF007750 and AH009106 ) and three INDELs and four SNPs were identified. In conclusion, we were able to identify six new polymorphisms of the bovine GH gene (one INDEL and five SNPs), which can be used as molecular markers in genetic studies.     

Rapid identification and differentiation of pathogenic clostridia in gas gangrene by polymerase chain reaction based on the 16S-23S rDNA spacer region

In cattle, sheep, and other ruminants, clostridial myonecrosis (gas gangrene) is mostly caused by Clostridium chauvoei, C septicum, C novyi and C sordellii. A polymerase chain reaction (PCR) system using common primers designed from multiple alignment of the 16S rRNA and 23S rRNA genes of Clostridium species was developed to identify pathogenic clostridia. The PCR was performed with total DNA from 26 strains which included seven different Clostridia species. These bacteria were differentiated at species level by the different PCR product patterns. To characterise the 16S-23S rDNA spacer regions of these clostridia further, most PCR products of these bacteria were sequenced. The smallest PCR products of each bacterium represented the fundamental 16S-23S rDNA spacer region; larger PCR products of each bacterium were caused by insertion sequences, i.e. tRNA gene sequences. The authors' observations indicate that the PCR patterns of the 16S-23S rDNA spacer regions have the potential to be used as an identification marker of pathogenic clostridia in gas gangrene.     

IS711和omp2作为布氏杆菌种属及种株间分子鉴别诊断标记的研究

布氏杆菌为世界性具重要公共卫生意义的人兽共患疫病原，分6个种。建立种间及种株间安全敏感、经济有效的快速鉴别诊断方法对布病防制及分子流行病学研究具有重要意义。布氏杆菌IS711和omp2基因具有种属特异性，可用于布氏杆菌的PCR分子诊断。其中IS711为转座因子，在不同种布菌种存在插入位置的多态性，外膜蛋白OMP2编码基因则存在反向重复序列及种株间的多态性。为此，分别采用复式-PCR、PCR和限制性酶切片段长多态性（RFLP）分析，对分属于B．mclitcnsis、B．suis和B．abortus的不同种布氏杆菌的不同种株，M5、M16、S2、S6和S19进行分子鉴别诊断。结果显示，根据IS711基因特定PCR扩增片段长多态性，可进行布氏杆菌种间的快速鉴别；而omp2编码基因PCR扩增片段PsrⅠ、KpnⅠ、NcoⅠ和Eco47 Ⅲ等4种限制酶片段长多态性，则可成为布氏杆菌菌株间特异的分子鉴别诊断标记，甚至疫苗株M5和野毒株M16之间的分子诊断标记。     

猪Calsarcin-2基因第1内含子遗传多态性分析

以大约克猪、长白猪、杜洛克猪和贵州白香猪杂交及回交的后代为研究对象,根据NCBI公布的序列设计了4对引物,采用测序、PCR-SSCP技术对Calsarcin-2基因第1内含子进行了单核苷酸多态性检测和基因型分析,探讨Calsarcin-2基因第1内含子多态性与肉质性状的关系。结果发现2个SNPs(T613C、C936G),群体遗传学分析表明,在所检测的各多态位点上,不同群体间不同基因型的分布都存在着极显著差异(P＜0.01),结合品种特性分析表明,613及936位点所检测的不同基因型和肉质可能具有一定的相关性。     

Association of polymorphisms for nuclear receptor coactivator 1 gene with egg production traits in the maternal line of Shaobo hens

1. The objectives of the study were to find polymorphic sites and elucidate the association between SNPs in the nuclear receptor coactivator 1 (NCOA1) gene and reproductive traits. 2. SNPs were detected by PCR-SSCP and DNA sequencing. Four SNPs were detected, including T10155007A, T10125838C, G10118492A and G10109315T. Three polymorphisms were associated with total egg production at the age of 300 d and the G10109315T polymorphism was associated with age at first egg. 3. In conclusion, the NCOA1 gene can be used as a molecular marker for reproductive traits in hens.     

SD大鼠转化生长因子α基因cDNA序列的分子克隆

试验参考了SD大鼠转化生长因子α（transforming growth factor alpha, TGFα）基因序列,用PCR方法对SD大鼠TGFα基因cDNA序列进行了克隆,获得了SD大鼠TGFα基因的970 bp的cDNA序列,提交GenBank,登录号：KF366251,其中CDS长度为483 bp,共编码了160个氨基酸。SD大鼠与BN大鼠、小家鼠、黄牛、野猪、猕猴、黑猩猩、人、原鸡、鹌鹑和斑马鱼的TGFα基因编码序列的同源性分别为98.6%、95.0%、85.5%、85.3%、85.5%、86.3%、86.3%、73.2%、73.2%和56.8%,其编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为98.8%、96.9%、90.6%、90.6%、91.2%、91.9%、91.9%、72.6%、72.6%和38.8%。这一结果表明了TGFα基因在进化过程中具有一定的保守性,但不同物种之间也具有功能上的特异性。通过比较SD大鼠与BN大鼠的TGFα基因编码序列,发现了7个SNPs位点,这一结果为TGFα基因的SNPs数据库提供了新的信息。     

马鹿特异性SNP分子标记的验证

试验旨在对基于基因分型测序（genotyping by sequencing,GBS）技术筛选出的马鹿特异性SNPs位点的准确性进行验证,为梅花鹿、马鹿及其杂交后代的鉴别提供可靠的分子遗传标记。随机选取30个马鹿特异性SNPs位点,根据SNPs位点前后各200 bp的序列,利用Primer Premier 6.0软件设计特异性引物,以随机选取的验证样本DNA作为模板进行PCR扩增,并进行Sanger测序,对测序结果利用BioEdit软件进行峰图的观察,利用Mega 6.0软件对测序得到的序列进行比对分析并观察每个特异性SNP位点在不同验证群体中的基因型,对每一个马鹿特异性位点的峰图和比对信息进行统计分析。结果表明,30个马鹿特异性位点中有28个和前期研究结果一致,其中1个SNP位点（SNP3）中G等位基因在梅花鹿中的基因频率为0.05,而G等位基因在马鹿中的基因频率为1,G等位基因在马鹿个体中的基因频率比在梅花鹿个体中高,同时,利用SPSS 22.0进行统计分析发现,该位点在马鹿和梅花鹿中基因型分布表现出显著性差异（P<0.05）;另外1个SNP位点（SNP5）中T等位基因在梅花鹿的基因频率为0.15,而在马鹿中的基因频率为1,且这个SNP位点在梅花鹿和马鹿中基因型分布差异显著（P<0.05）,所以这2个位点仍然可以作为马鹿的特异性SNPs位点。研究结果说明了GBS测序筛选出的马鹿特异性SNPs可以作为鉴定的分子标记,对梅花鹿、马鹿及其杂交后代的鉴别奠定了理论基础。     

贵州半细毛羊促生长激素分泌素受体基因SNPs筛查与变异分析

通过研究促生长激素分泌素受体（growth hormone secretagogue receptor,GHSR）基因多态性,为贵州半细毛羊选种选育提供进一步的分子生物学依据。试验选取36只贵州半细毛羊构建DNA池,设计1对引物扩增其GHSR基因第2外显子及第1、2内含子部分序列并进行双向测序,对SNPs位点等位基因频率进行估算,利用在线生物信息学软件分析SNPs位点对GHSR基因RNA二级结构的影响。结果发现,在贵州半细毛羊GHSR基因中筛选到2个SNPs：T70G和G229A,均为同义突变,SNPs位点导致GHSR基因mRNA二级结构发生变化。GHSR基因多态性可能影响贵州半细毛羊的生长。     

3个绵羊品种MSTN基因多态性的比较分析

对杜泊绵羊、小尾寒羊和晋中绵羊3个品种的MSTN基因编码序列进行克隆测序,并比较分析该基因编码区的SNPs。结果表明：在引物P1、P2、P3扩增的MSTN基因片段中存在10个SNPs,其中4个SNPs位于非编码区,6个SNPs位于编码区;编码区中有2个SNPs为无义突变,其他4个为错义突变。因此,绵羊MSTN基因在进化过程中保守性不强,可能存在较多的变异位点,为进一步群体遗传分析提供了基础。