用18S rRNA序列探讨8种绿藻分子系统发育

测定了宽礁膜Monostroma latissimum、浒苔Enteromorpha prolifera、孔石莼Ulva pertusa的18S rRNA基因序列,并与肠浒苔E.intestinalis、穿孔石莼U.fenesrtata、石莼U.lactuca、礁膜M.nitidum和格氏礁膜Monostroma grevillei5种已知的大型海洋绿藻的同一基因序列合并进行比较,分析了核苷酸序列差异和碱基替换特点,并构建系统发生树。结果表明:浒苔与肠浒苔之间的Kimura双参数距离大于浒苔与石莼属3个物种之间的Kimura双参数距离;用UPGMA法和MP法构建的系统树基本一致,在构建的系统发生树中,浒苔与石莼属物种聚为一类,表现出与石莼属物种更近的亲缘关系。     

海南几种大型绿藻18S rRNA基因的克隆与序列分析

对海南沿岸采集到的团集刚毛藻(Cladophora glomerata)、细毛横丝藻(Acrochaete leptochaete)、石莼(Ulva reticulata)和长茎葡萄蕨藻(Caulerpa lentillifera)进行了形态学观察,采用18S rRNA通用引物,通过PCR技术,从这4种绿藻的基因组中扩增到各自的18S rRNA基因序列,并测序。与Genebank中已收录的6种绿藻18S rRNA基因序列进行比较分析,所得10种绿藻的18S rRNA基因长度为727 bp,变异位点为266个,保守位点为453个。刚毛藻目与蕨藻目的遗传距离最大,为0.376;刚毛藻属内的种间遗传距离最小,为0.010。采用NJ法构建的系统进化树的拓扑结构显示:细毛横丝藻、葡枝横丝藻、石莼、礁膜、羽状尾孢藻和皱溪菜聚为一支;团集刚毛藻与扭曲刚毛藻单独聚为一支;长茎葡萄蕨藻与总状蕨藻聚为一支。说明18S rRNA序列可以作为大型绿藻系统发育研究的分子标记。     

利用ITS序列探讨谷精草属5个种的系统发育

以谷精草属(Eriocaulon)的尼泊尔谷精草（Eriocaulon nepalense）、白药谷精草（E. cinereum）、高山谷精草（E. alperstre）、华南谷精草（E. sexangulare）、南亚谷精草（E. oryzetorum）等5个种为研究对象，通过PCR扩增技术获得了谷精草属5个种的内转录间隔区序列，并对ITS序列进行分析. 结果发现，供试谷精草属植物的ITS区长度并不完全一致，其ITS1的长度范围为171～306 bp，G+C含量为38.24%～55.04%；ITS2的长度范围为184～288 bp，G+C含量为 36.46%～57.02%. 在此基础上，采用Clustal W version 1.7对所得的ITS序列进行排序与分析，以灯心草属（Juncus）的一个种J. dregeanus为外类群，并使用PAUP 4.0 10 b软件采用最大简约法分析获得最简约的系统发育树. 结果表明，在检测的ITS序列的738个位点中稳定位点174个、变异位点564个 (包括276个信息位点). 另外，从发育树上平行分出两个大的总分支，其中E. nepalense、E. oryzetorum、E. alpestre和E. cinereum（云南宣威）为一支；E. sexangulare为一支. 上述二个分支与外类群聚在一起，bootstrap值为100％.      

基于18S rDNA序列的涡虫纲三肠目分子系统发育研究

采用18S rRNA对我国常见的4种三肠目涡虫的18S rDNA基因进行序列测定和分析,共获得三肠目2科3属4种的序列,同时结合GenBank中的三肠目18S rDNA序列(22条),以其姐妹群原序列目中的Archimonocelis crucifer为外群,采用MEGA3.0、PHYLIP、PAUP 4.0等分子生物学软件分别构建NJ树、ME树、MP树和ML树,分析三肠目的系统发育关系。结果表明,不同构树方法所得系统树的拓扑结构基本一致。     

亚洲玉米螟核糖体18S rRNA基因的序列分析及分子系统学研究

从鳞翅目亚洲玉米螟(Ostriniafunacalis(Guen6e))3龄幼虫提取基因组DNA.通过PCR扩增和测序,获得其核糖体小亚基18S rRNA基因(18S rDNA)的序列,利用ClustalW与六足总纲中22个目(纲)昆虫的18S rRNA基因序列进行多重联配.结果表明.昆虫18S rRNA有4段序列较为保守,其中第2区段最为保守.分别用全长序列和第2保守区段构建分子系统发育树,结果显示:保守区段构建的系统发育关系比较符合传统分类,所列各目(纲)中毛翅目与鳞翅目亲缘关系最近,昆虫纲中的衣鱼目、蜉蝣目、蜻蜓目与弹尾纲、双尾纲、原尾纲距离较近,属于比较古老的昆虫类群.     

牛瑟氏泰勒虫18S rRNA基因的克隆及分子分类学分析

为分析牛瑟氏泰勒虫延边株18SrRNA基因序列,根据GenBank上已发表的牛瑟氏泰勒虫18SrRNA基因序列设计2对特异性引物,通过PCR扩增目的基因片段,将扩增产物连接到pMD18一T载体中,经酶切鉴定和PCR鉴定为阳性的重组质粒进行测序,对测序结果用DNAMAN软件时其与GenBmlk上8个虫株相关序列进行同源性比较,建立系统发育树。结果显示,牛瑟氏泰勒虫中国延边株的18SrRNA基因大小为1744bp,瑟氏泰勒虫延边株、兰州株、日本株以及水牛泰勒虫中国株彼此之间亲缘关系最近;瑟氏泰勒虫延边株与突变泰勒虫亲缘关系较远：     

四种鱚属鱼类线粒体Cyt b基因的序列变异及系统发育研究

测定和分析了4种鱚属(Sillago)鱼类:斑鱚(Sillago aeolus)、亚洲鱚(S. asiatica)、多鳞鱚(S. sihama)和少鳞鱚(S. japonica)线粒体细胞色素b基因序列片段,比较了不同鱚属鱼类种间的序列差异,探讨了彼此间系统发育关系和分类地位。结果显示,4种鱼类平均核苷酸组成为T 29.9%、C 29.2%、A 21.5%、G 19.3%,种间平均净遗传距离在0.157到0.280之间。最大似然法构建的系统树显示,少鳞鱚和亚洲鱚首先聚类、再与多鳞鱚和斑鱚相聚,斑鱚是最晚分化出的鱼类。基于Cyt b基因序列核苷酸分歧速率计算得出4种鱼类发生遗传分化时间在距今785—1400年前的第三纪中新世(Miocene)。     

大型艾美耳球虫18S rDNA部分序列测定与系统发育分析

从河北某兔场分离大型艾美耳球虫卵囊,CTAB法提取基因组DNA。利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增大型艾美耳球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序。将测得的序列用DNAStar软件分析并与GenBank中公布的11种兔球虫的相应序列进行同源性比较,绘制系统进化树。结果表明,扩增出大小约为1522bp的18S rDNA片段,序列分析显示河北株大型艾美耳球虫18S rDNA与GenBank公布的大型艾美耳球虫18S rDNA比对,同源性达99.6%;与国外的11种兔球虫相应序列同源性在92.4%～99.6%之间。     

胡枝子属植物ITS序列研究与系统发育分析

用PCR产物直接测序法对10种胡枝子属植物和1个外类群的ITS序列进行了测定.结果表明,10种胡枝子ITS序列全长在612～622 bp之间,其中ITS1长度在243～228 bp之间,变异较大,ITS2长度在215～220 bp,5.8S的长度均为165 bp,比较保守.序列比对结果发现有76个变异位点,占比对序列长度的11.93%.构建了胡枝子属植物ITS序列的系统发育树,并探讨了参试胡枝子种质的亲缘关系.     

4个旋毛虫隔离种18S rRNA基因分子克隆及序列比较分析

【目的】旋毛虫的分类问题一直是众多学者关注的问题，笔者试图通过分子遗传机制来确定旋毛虫不同隔离种之间的关系，同时也为寄生虫学的分类研究奠定基础。【方法】通过RT-PCR方法，克隆4个不同旋毛虫隔离种的18S rRNA基因片段，并进行比较分析。【结果】序列分析结果表明，黑龙江省猪旋毛虫与T. spiralis的同源性为99.4%，犬旋毛虫与T. nativa的同源性为99.3%；猪旋毛虫与T. nativa的同源性为99.0%。犬旋毛虫与T. spiralis的同源性为99.1%。猪旋毛虫为旋毛形线虫（T. spiralis）；犬旋毛虫为本地毛形线虫（T. nativa）。【结论】这与传统的分类结果基本一致。在分子水平上为传统的分类学提供了更强的理论依据，为旋毛虫病的流行病学和防治提供奠定基础。     

基于18S rDNA V4区序列的16种蚜茧蜂系统发育关系(昆虫纲,膜翅目)

利用18S rDNA的V4区序列对蚜茧蜂科部分物种的分子系统进化关系进行了分析.利用MEGA3.1软件NJ、ME、MP和UPGMA 4种方法构建蚜茧蜂的分子系统,从总体上看,NJ树、ME树、MP树和UPGMA树基本一致,按照大的分类阶元,聚类大体上遵循了Aphidiini、Trioxini、Praini、Ephedrini等的界限,这与传统的形态分类结果大致相符.根据这些树所得的一致性指数(CI)和存留指数(RI)都较大,表明整棵树的置信度较高.其中,UPGMA树的CI值和RI值最大,分别为0.8092和0.7126.     

热带雨林土壤真菌18S rRNA基因多样性分析

[目的]探讨热带雨林土壤真菌群落结构,阐释微生物与植物之间的互作关系,以期为开发利用热带雨林这一特殊生态环境中丰富的微生物基因资源提供理论依据。[方法]运用扩增18S rDNA限制性分析(Amplified 18S ribosomal DNA restriction analysis,ARDRA)和18S rRNA基因序列分析技术,分析了热带雨林土壤真菌物种丰度、优势种群和进化关系等群落结构特征。试验采用PVPP洗涤-CTAB-溶菌酶-蛋白酶K-SDS热处理等方法,提纯微生物总DNA,构建真菌18S rRNA基因克隆文库,对阳性克隆进行ARDRA分析,选取有代表性的克隆测序,利用DOTUR软件将真菌序列按照97%相似性的标准分成若干个可操作分类单元(Operational taxonomic u-nit,OTU)。[结果]构建的克隆文库包含21个OTU,其中以子囊菌和担子菌为主,各占克隆文库的64.7%和15.5%。子囊菌中以盘菌为主,占到整个克隆文库的47.4%;担子菌中以伞菌为主,占到整个克隆文库的10.4%。接合菌和壶菌均有少量克隆出现在文库中。首次从海南岛热带雨林土壤中发现牛肝菌。研究显示该环境真菌多样性极其丰富,涵盖了真菌主要门的绝大多数。[结论]该研究结果为揭示热带雨林土壤真菌群落结构多样性、挖掘该环境样品的真菌基因资源提供了参考依据。     

用bioperl实现种子植物18S rRNA基因序列的大规模获取

基于bioperl设计了大规模获取基因序列的方法程序，成功实现了Genbank中种子植物18S rRNA基因序列的大规模获取，解决了构建种子植物18S rRNA基因序列二级数据库的大规模数据获取问题。同时，该程序为不同类型序列的大规模获取都提供了一种较好的解决办法。     

16S rRNA与Vitek-32对临床感染猪肠球菌鉴定结果比较

旨在利用两种常用的细菌分型方法对感染猪的肠球菌的鉴定结果进行比较和分析.将从河南洛阳、济源、许昌、南阳等地送检病猪体内分离的42株革兰阳性球菌纯培养后,分别用16S rRNA基因序列比较和Vitek-32全自动细菌鉴定系统进行鉴定.Vitek-32对42株分离茵中的34株鉴定到种的水平,分别是粪肠球茵(E.faecalis)10株、屎肠球菌(E.faecium)2株、铅黄肠球菌(E casseliflavus)22株;另有8株未成功鉴定.16S rRNA基因序列分析对42株分离菌成功的鉴定结果是为粪肠球菌12株,屎肠球菌30株.经比较发现,Vitek-32鉴定的10株粪肠球菌中除1株被16S rRNA鉴定为屎肠球菌外,其余9株均相同;Vitek-32鉴定的2株屎肠球菌与16S rRNA鉴定结果相同;Vitek-32鉴定的22株铅黄肠球菌除了1株被16S rRNA鉴定为粪肠球菌外,其余全部被鉴定为屎肠球菌;8株未能被Vitek-32鉴定的肠球菌被16S rRNA方法分别鉴定为粪肠球菌(2株)和屎肠球菌(6株).在感染猪的肠球茵分型鉴定中,Vitck-32对粪肠球菌鉴定结果与16S rRNA比较具有较高的一致性(75%);而对于屎肠球菌的鉴定结果与16SrRNA比较出现了较大的差异(93.3%).     

基于12S rRNA和16S rRNA序列的龟鳖类系统进化特征研究

[目的]研究龟鳖类的系统进化关系,为龟鳖类资源的保护和合理开发利用提供理论依据.[方法]采用PCR扩增和测序的方法,获得小鳄龟(Chelydra serpentina)的12S rRNA和16S rRNA序列,分别结合NCBI中其他龟鳖的同源性序列进行比对分析;基于Kimura双参数模型计算龟鳖类种间、属间、科间的遗传距离;采用邻接(NJ)法、最大简约(MP)法和最大似然(ML)法构建分子系统进化树.[结果]经比对后得到394 bp的12S rRNA-致序列和544 bp的16SrRNA一致序列,二者合并得到938 bp的联合序列.其中,可变位点327个,序列总变异率为34.9%,简约信息位点222个,单变异多态位点105个.T、C、A、G的平均含量分别为23.6%、24.1%、33.5%和18.7%,A+T含量为57.1%,G+C含量为42.8%.在327个可变位点中,转换数为61,颠换数为24,转换/颠换比率(R)为2.54.拟水龟属间的遗传距离为0.021~0.060,平均为0.467;淡水龟科8属之间的遗传距离为0.022~0.110,平均为0.0724;曲颈龟亚目7科(除平胸龟属外)间的遗传距离为0.071~0.123,平均为0.105.分子系统进化树显示,木纹龟属首先和陆龟科聚在一起,然后再与淡水龟科汇聚;中华花龟、大头乌龟与拟水龟属的成员相互镶嵌,聚成一支;鳄龟科、海龟科、棱皮龟科聚为一支;动胸龟科独成一支.[结论]应将龟亚科、淡水龟亚科提升为龟科、淡水龟科,并将大头乌龟、中华花龟并入拟水龟属,而平胸龟应从鳄龟科中分离出来,独立自成平胸龟科.     

肠艾美耳球虫河北株18S rDNA部分序列测定及系统发育分析

从河北某兔场单卵囊分离肠艾美耳球虫并接种无球虫兔进行增殖,CTAB法提取肠艾美耳球虫卵囊基因组DNA.利用艾美耳属球虫18S rDNA保守引物,PCR扩增肠艾美耳球虫18S rDNA片段,产物纯化后测序.测得的序列用DNAstar软件分析并与GenBank公布的11种兔球虫(EF694007-EF694017)的相应序列进行同源性分析,并绘制系统进化树.结果表明,扩增出的18S rDNA片段大小为1 521 bp.序列分析显示,肠艾美耳球虫河北株18S rDNA与GenBank公布的11种兔球虫相应序列同源性为92.6%～99.9%,肠艾美耳球虫河北株与国外肠艾美耳球虫(EF694012)18S rDNA相似性达99.9%.系统发育进化树显示,肠艾美耳球虫河北株与肠艾美耳球虫(EF694012)亲缘关系最近.     

中国南瓜内参基因18S rRNA的克隆及其引物开发

【目的】克隆获得中国南瓜18SrRNA,并设计合适的荧光定量PCR内参,为开展中国南瓜重要功能基因的表达模式和调控机制研究奠定基础。【方法】以中国南瓜‘密本’品种的基因组DNA为模板,通过PCR方法克隆中国南瓜18SrRNA基因序列,再利用Primer Premier软件设计荧光定量PCR引物,对该内参基因在中国南瓜不同组织、生长阶段及非生物胁迫条件下的表达稳定性进行检测。【结果】首次克隆得到中国南瓜18SrRNA基因序列,其长度为1 857bp,GenBank登录号为KM979454,该基因与西瓜、西葫芦等瓜类蔬菜18SrRNA基因同源性大都在90%以上;以中国南瓜内参基因18SrRNA核苷酸全长序列为基础设计1对荧光定量PCR引物,以中国南瓜果肉总RNA逆转录的cDNA第一链为模板进行PCR扩增,该引物扩增的片段大小为132bp,扩增效率高,特异性强;18SrRNA基因在中国南瓜不同组织、生长发育阶段及非生物胁迫条件下均能稳定表达。【结论】克隆获得中国南瓜18SrRNA基因,该基因适合在中国南瓜基因表达研究中作为内参基因。