高效制备转基因小鼠的优化试验

为了优化转基因小鼠的制备技术,试验着重对注射DNA的制备、高质量受精卵的获得、显微注射、胚胎移植及早期胚胎检测等各步骤中的主要影响因素进行了优化。移植后出生的小鼠经PCR及Southern Blot检测,阳性鼠检出率由1.85%(2/108)增加到23.36%(25/107)。由此说明,通过注射DNA的改良、技术优化以及GFP在转基因动物中的应用,转基因效率可以得到明显提高,为高效制作转基因动物提供基础。     

卵巢打点注射质粒pIRES2-EGFP生产转基因兔的研究

本研究以绿色荧光蛋白为报告基因,转染兔卵母细胞,探索建立操作方便、效率高、成本低、可定量生产转基因兔的可行性方法.选择14只成年新西兰雌兔,每侧卵巢内分别打点注射0.25 mL 0.5～0.8 mg/mL的质粒,注射后第3日、第16日和第31日进行人工辅助配种;卵巢注射后第3日、第16日和31日随机各取1只雌兔卵巢做冰冻切片,置荧光显微镜下观察绿色荧光;应用PCR 和 Southern 杂交检测转基因新生仔兔阳性率.结果经荧光显微镜观察,卵巢注射后第3日配种的雌兔卵巢冰冻切片及48 h以后的胚胎呈现绿色荧光;卵巢注射报告基因后第3日配种的雌兔后代阳性率最高,PCR 和 Southern 杂交检测结果分别为72.7 %和45.5 %;第31日配种的后代阳性率最低,分别为36.8 %和15.8 %;第16日配种、第3日配种和第31日配种雌兔的阳性后代数量呈递减趋势.卵巢注射后第3日配种,虽然后代阳性率较高,但是其产仔数最少.实验结果表明,用注射器直接对卵巢打点注射外源基因生产转基因兔的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础.     

转基因SD大鼠构建技术的研究

为构建转基因SD大鼠,用3种不同转基因构件p279-D5、p279-D5B、p279-SV40Tag对SD大鼠受精卵进行显微注射和胚胎移植试验,移植出生仔鼠经PCR检测筛选首建鼠.结果表明:以每只20 U的孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素的剂量组合对5周龄组大鼠达到了最佳超数排卵效果.3种构件经PCR检测后都获得了阳性后代,其外源基因整合率分别为p279-D5 1.4%(5/350)、p279-D5B 1.1%(3/274)和p279-SV40Tag 1.3%(3/230).     

转基因兔的培育及应用前景

本文阐述了转基因兔的生物学基础及培育方法;介绍了国内外转基因兔的培育状况,并对转基因兔的应用前景和今后的工作做出展望。     

睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒生产转基因兔的研究(英文)

为探讨直接用注射器对睾丸和卵巢打点注射pIRES2-EGFP质粒转染兔的精子细胞和卵母细胞,建立操作方便、效率高、成本低、可批量生产转基因兔的可行性。选择5只成年新西兰雄兔、29只经产新西兰雌兔,每侧睾丸和卵巢内分别打点注射0.5~0.8 mg/mL质粒0.25 mL。①第3周随机取一只雄兔睾丸做冰冻切片,于荧光显微镜下观察转染情况。②(Ⅰ:1#♂×7♀、Ⅱ:2#♂×7♀、Ⅲ:3#♂×7♀、Ⅳ:4#♂×7♀)其它雄兔于第6周和第7周与3日前做过卵巢注射并超排处理的雌兔配种,最后采集新生仔兔耳组织,提取基因组DNA,经PCR和Southern杂交检测阳性率。结果显示雄兔睾丸冰冻切片于荧光显微镜下可见绿色荧光,统计所得后代转基因阳性率,并进行差异分析,其中Ⅰ组后代阳性率最高,PCR和Southern杂交检测阳性率为93.55%和83.87%,Ⅳ后代阳性率最低,依次为80.65%和70.97%,但是各组之间差异不显著。上述实验结果表明,对睾丸和卵巢同时注射外源基因可获得较高阳性率的转基因后代,生产转基因的方法操作简便、高效,为日后大规模制备一些大型家畜的转基因后代奠定了基础。     

季节对超数排卵兔卵母细胞数量及质量的影响

用孕马血清促性腺激素PMSG配合人绒毛膜促性腺激素hCG处理中国白兔,对4个季节超排兔卵母细胞的数量和孤雌胚胎以及卵胞浆内精子注射(ICSI)胚的体外发育能力进行了评定.结果表明.春季成熟卵母细胞的获得数量显著高于冬季(P0.05),而其他季节之间差异不显著(P0.05);两种卵子(孤雌激活和ICSI)的卵裂率不受季节影响(P0.05),但夏季两种胚胎的囊胚形成能力显著低于其他3个季节(P0.05).所以,季节既影响超数排卵兔的卵母细胞数.也影响卵母细胞的质量.     

转基因鱼的研究进展

转于的外源基因构建需要有妄动仓,目的基因和终止子等,常用外源基因的导入方法有显微注射,电穿孔等,并介绍了外源基因表达模式及常用的标记基因。转基因鱼的研究比较落后,当务之急是从分子水平上分析鱼类的生理现象及表达基因的结构。     

利用水平微注射技术制备转基因兔的研究（英文）

利用常规微注射系统进行原核胚转基因时,由于其透光性能较差,操作不便等原因,使外源基因导入效率很低,另外其开放构造也易造成污染。为了解决这些问题,本研究有针对性地设计了新型的水平微注射系统,利用此系统,可明显缩短常规注射原核胚的平均时间,注射后原核胚的分裂率、8～16细胞胚胎发育率也明显提高。此外,利用该系统还可在低倍镜下（×100）将DNA常规注射量减半注射,提高了原核胚注射后的成活率,其注射胚的外源基因整合率亦明显提高。采用水平微注射系统,以pMT-hIGF-1为目的基因,在移植产下的24只仔兔中,有5只经Southern blot检测,证明为整合外源基因的转基因兔。     

双抗体夹心ELISA在转基因生物检测中的应用研究

随着转基因产品种类和数量的不断增加,转基因生物及其产品的安全性也越来越受到关注,各国一直以来也都高度重视转基因生物及产品的管理.作为转基因生物安全评价的第一步,转基因生物的准确检测显得格外重要.该文综述了双抗夹心ELISA方法的原理、技术要点及其在转基因植物及产品检测中的应用,并对该方法在转基因动物检测中的应用前景进行分析,为双抗夹心ELISA方法的合理利用提供依据.     

用双夹心法ELISA检测兔轮状病毒的研究

建立了检测兔轮状病毒抗原的夹心法ＥＬＩＳＡ（ＤＳ－ＥＬＩＳＡ）。用此法检测了６７份兔腹泻粪便样品和腹泻死亡兔肠内容物样品。轮状病毒（ＲＶ）阳性检出率（３１．３４％）明显高于双抗体夹心法ＥＬＳＡ（２５．３７％）和对流免疫电泳（１６．４１％）。经阻断试验和重复性试验，证明了ＤＳ－ＥＬＩＳＡ具有特异性强和重复性好等优点。     

hLF转基因羊繁殖、遗传与表达稳定性

【目的】分析转基因对人乳铁蛋白（human Lactoferrin,hLF）转基因羊繁殖性能的影响,及转基因在不同世代中的遗传与表达稳定性。【方法】应用自主研发的原代hLF转基因山羊（G0代公羊）建系,与普通奶山羊常规交配获得F1代;F1代公羊与F1、F2代母羊或普通奶山羊（N）交配获得F2代;F2代公羊与F2代母羊交配获得F3代。分别采用PCR和ELISA方法对其后代个体进行整合与表达鉴定;统计各世代不同配种方式所获得的后代数量、转基因整合率、母羊受胎率、羔羊异常率等繁殖性能数据。【结果】经过多个繁殖周期,各世代转基因羊受胎率、产羔率等繁殖性状均正常。获得F1代hLF羊19只,转基因整合率为24.7%（19/77）;F2代hLF羊86只,其中通过（F1♂×N♀）交配方式获得的是62只,转基因整合率为33.2%（62/187）;通过（F1♂×F1♀）交配方式获得hLF羊16只,转基因整合率为76.2%（16/21）;通过（F1♂×F2♀）交配方式获得hLF羊8只,转基因整合率为34.8%（8/23）;获得F3代hLF羊9只,转基因整合率为52.9%（9/17）。ELISA方法测定F1、F2、F3代羊泌乳20周乳汁中hLF的表达发现,hLF在转基因羊乳汁中稳定表达,3个世代hLF羊乳中的平均表达量分别为351.75、340.00和326.25 μg•mL-1。【结论】hLF基因的转入未对转基因羊群的繁殖性能产生显著影响,hLF基因能在山羊群体世代间稳定遗传和表达。     

增强外源基因在转基因植物中表达的策略

在转基因研究和生产应用中,人们往往期待目的基因能在转基因生物中高效表达从而实现相关目的--获得具有对杀虫剂、除草剂高抗性的农作物,或以植物作为生物反应器生产具有高附加值的疫苗、抗生素等医药用品以及工业用蛋白、酶类等。综述了各种用于增强外源基因表达效率的策略,从外源基因的整合、转录水平的调节以及外源基因翻译后的蛋白分选三个水平阐述提高外源基因表达的相关策略的利弊,从而为转基因研究提表达供载体构建方面的参考依据。     

蜘蛛拖牵丝蛋白基因转家蚕表达质粒的构建

利用DNA重组技术对络新妇蛛(Nephila clavipes)拖牵丝蛋白基因MaSp1高度重复序列进行多次重组,人工构建成1.6 kb的蜘蛛拖牵丝蛋白人工基因Sil-E,DNA序列分析证明了人工基因序列的正确性.将家蚕L链基因启动子片段、L链cDNA、L链基因终止子融合在一起,构建成丝腺特异性表达单元.再与Sil-E融合构建成蜘蛛拖牵丝蛋白基因家蚕丝腺特异表达单元.将该表达单元克隆到转座子piggyBac的转基因载体中,获得了蜘蛛拖牵丝蛋白转基因表达载体.采用显微注射法将其与辅助质粒共导入到家蚕蚕卵中.筛选转基因阳性个体,经PCR和Southern杂交鉴定,结果表明目的基因整合到家蚕基因组中,为进一步研究家蚕作为生物反应器表达蜘蛛拖牵丝蛋白基因奠定了基础.     

转双价基因毛白杨组培生根过程中内源激素含量对比研究

为探讨转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨生根生理变化,对转rolB-pttGA20ox双价基因毛白杨株系RG-4和对照株系PT-16组培苗生根过程中内源激素含量进行了测定分析。结果表明:RG-4株系在无激素培养基上8 d即可见根突出现,比对照提前3 d,生根率、平均根长及根数均高于对照;其内源IAA含量在不定根形成时增加,根形成后降低,且RG-4在起始和处于峰值时期的内源IAA含量显著高于对照;RG-4的GA3含量在生根前降低,生根后升高,与对照的变化趋势相反;ABA含量在生根过程中波动变化,但起始ABA含量RG-4低于PT-16;RG-4的IAA/ABA在根突形成前保持较高的水平,根突形成后降低。     

一种对转基因植物基因表达进行检测的新方法

介绍了对一种检测转基因植物基因表达的新方法－－蛋白免疫原位杂交法，该法与常规的Westernblot相比，具有操作简便，有效可行，所需仪器少等特点，适用于在翻译水平上对转基因植物进行了检测。     

伊普吕肉兔血浆生长激素(GH)水平及其影响因素研究

选用4月龄伊普吕肉兔12只,雌雄各半,分别于白天(13:00)、夜晚(0:00)、饥饿24h、热应激(38℃,15min)状态下经耳缘静脉采血,以放射免疫分析法检测生长激素(GH)水平.试验结果显示,该品种兔血浆GH水平白天((0.80±0.08)μg/L)高于夜晚((0.73±0.05)μg/L);应激((0.93±...     

南疆棉区转Bt基因棉对棉铃虫抗性表达及对节肢动物的影响

2000－2001年在新疆喀什叶城县研究了转Bt基因棉MD－80不同发育阶段对棉铃虫的抗性表达和棉田节肢动物群落。结果表明：1）转Bt基因棉棉叶对棉铃虫初孵幼虫有2个抗性高峰期5月中下旬和7月底，抗虫性分别为94．5％和83．3％，8月份抗性最低（22．7％），而河南的研究表明8月份正是第2个抗性高峰，抗虫效果高达93．8％；2）7月上旬棉株不同器官抗棉铃虫的强弱依次为：棉苞叶（96．7％），棉蕾（74．2％），花瓣（60％），棉叶（50．2％），棉铃（30％），花蕊（26．8％）；3）转Bt基因棉对不同龄期棉铃虫抗性随着龄期的增大而降低；4）节肢动物群落多样性，均匀度顺序依次为普通棉对照田（不进行任何防治，0.7706和0.1883),Bt棉药防田（使用化学农药防治害虫，0．3968和0．0931），Bt棉自控田（仅依靠自然天敌控制害虫，0．2211和0．0549），优势集中性依次为Bt棉自控田（0．9264），Bt棉药防田（0．8625），普通棉对照田（0．6881），表明普通棉对棉田的节肢动物群落最稳定，Bt棉药防田次之，Bt棉田自控田最差。     

Expression profiling of transgenes (Cry1Ac and Cry2A) in cotton genotypes under different genetic backgrounds

Transgenic cotton carrying the CrylAc gene has revolutionized insect pest control since its adoption,although the development of resistance in insect pests has reduced its efficacy.After 10 years of cultivating Bacillus thuringiensis(Bt) cotton with a single Cry1 Ac gene,growers are on the verge of adopting Bt cotton that carries the double gene(Cry1 Ac+Cry2 A) due to its better effectiveness against insect pests.Thus,the current study was designed to evaluate the role of each gene in the effect...     

马铃薯Y病毒复制酶基因植物表达载体构建及转基因烟草的培育

用ＢａｍＨＩ／ＫｐｎＩ从重组克隆ＰＺＤ－１中切下马铃薯Ｙ病毒脉坏死株系复制酶基因，将其插入质粒ＰＲＯＤ２相庆切点中构成植物表达载体。用重组ｐＲＯＤ２转化农杆菌（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）ＬＢＡ４４０４菌株，通过重组农杆菌侵染叶盘将复制酶基因转入烟草品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测结果表明，复制酶基因在转基因烟草中获得品种ＮＣ８９中获得转基因植株。分子生物学检测