真菌病毒FpgMBV1中P3基因的原核表达及多克隆抗体的制备

 采用RT-PCR法从假禾谷镰孢菌(Fusarium pseudograminearum)弱毒菌株FC136-2A的菌丝中扩增出假禾谷镰孢菌巨型双链RNA病毒1(Fusarium pseudograminearum megabirnavirus 1,FpgMBV1)的P3蛋白编码序列。测序结果显示,FpgMBV1-P3蛋白的编码序列长2 700 bp,编码901个氨基酸残基。构建原核表达载体pET28a-FpgMBV1-P3并转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株,在25℃以0.5 mmol·L^-1 IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为90 kDa,与预期分子量大小相符。将该重组蛋白作为抗原免疫日本大耳白兔,获得抗血清,采用间接ELISA测定其效价达1∶128 000,能够特异性检测到假禾谷镰孢菌菌丝中的FpgMBV1-P3蛋白。研究结果可为探究FpgMBV1-P3的结构和功能,以及进一步探讨FpgMBV1在假禾谷镰孢菌弱毒菌株FC136-2A中的作用机制奠定基础。     

番茄黄化曲叶病毒V 2基因原核表达及多克隆抗体制备

 通过PCR的方法,从番茄黄化曲叶病毒江苏分离物DNA中扩增到V2基因,并克隆到pMD18-T载体,序列测定结果显示其与报道的XH2分离物序列完全一致,核苷酸序列全长351 bp,编码115个氨基酸,推测分子量约13 kD。将该V2基因亚克隆到原核表达载体PET32a中获得重组表达载体PET32a-V2,转化大肠杆菌BL21（DE3）,IPTG可诱导1个分子量约为32 kDa的融合蛋白（含His标签）表达,经Ni⁺ NTA亲和柱纯化,获得纯化的重组蛋白,免疫家兔制备TYLCV-V2蛋白的多克隆抗体Anti-V2,间接ELISA测定Anti-V2的效价达1∶655 360,Western blot及DIBA分析结果表明Anti-V2可与V2蛋白发生特异血清反应,可为进一步研究V2蛋白的功能提供参考。     

猕猴桃种传潜隐病毒外壳蛋白的原核表达及多克隆抗体制备

猕猴桃种传潜隐病毒(actinidia seed borne latent virus, ASbLV),属于乙型线状病毒科Betaflexiviridae李属病毒属Prunevirus,是一种在我国猕猴桃上广泛发生的病毒。本研究通过RT-PCR方法克隆ASbLV的外壳蛋白基因,并连接到原核表达载体pET28a(+)上,转化大肠杆菌Rosetta (DE3),经IPTG诱导后可表达分子量约为28 kD的融合蛋白。经过Ni²⁺-NTA树脂纯化融合蛋白,然后以其为抗原制备多克隆抗体。Western blot结果表明,多克隆抗体的效价为1∶4 000。该多克隆抗体只与ASbLV发生特异性反应,而不与猕猴桃病毒1、猕猴桃病毒A、苹果茎沟病毒、柑橘叶斑驳病毒、黄瓜花叶病毒和马铃薯X病毒发生反应,说明该多克隆抗体特异性良好。利用间接ELISA对36份猕猴桃田间样品进行了ASbLV检测,检测结果表明其中20份样品被ASbLV侵染,且间接ELISA检测结果与RT-PCR检测结果一致。本研究建立的间接ELISA方法能够有效地应用于猕猴桃田间样品中的ASbLV检测。     

齿兰环斑病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

 采用RT-PCR法从感染齿兰环斑病毒(Odontoglossum ringspot virus, ORSV)贵州分离物的苋色藜叶片中扩增出病毒的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase, RdRp)基因保守序列。测序结果显示,该保守片段长516 bp,编码171个氨基酸残基。构建了该片段的原核表达载体pET32a-ORSV RdRp并转化BL21(DE3)菌株,在25℃以0.4 mmol·L^-1 IPTG诱导表达重组蛋白。SDS-PAGE分析表明,重组蛋白分子量约为36 kDa,与预测相符合。将该重组蛋白作为抗原免疫BABL/C小鼠,制备的多克隆抗体效价达1∶102 400。间接ELISA结果表明,该多抗具有较强的特异性,能检测到ORSV感染的病叶汁液中的RdRp,而与其它感染4种同属或不同属病毒的病叶汁液不发生血清学交叉反应,本实验为进一步研究RdRp的结构和功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定基础。     

建兰花叶病毒RdRp基因的原核表达及多克隆抗体制备

采用RT-PCR技术扩增出建兰花叶病毒贵州分离物(CyMV-GZ)的依赖RNA的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp)基因保守序列。测序结果表明:该RdRp基因序列长735 bp,编码245个氨基酸残基。构建原核表达载体pET32a(+)-RdRp,将重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3),在37℃以0.3 mmol·L~(-1) IPTG诱导表达分子量约49 kDa重组蛋白。以该重组蛋白为抗原免疫小鼠,制备的抗体效价达1∶204 800。间接ELISA检测显示该多抗与CyMV病叶汁发生特异性免疫反应,而与其他6种同属或不同属病毒叶汁无血清学交叉反应。本实验为进一步研究RdRp的功能以及从分子水平上探讨该病毒的致病机制奠定了基础。     

海芋凝集素AML的原核表达及其多克隆抗体制备

为了制备海芋凝集素(Alocasia macrorrhiza lectin,简写AML)的多克隆抗体,分别构建了AML全长及部分片段的原核表达载体,并利用获得的原核表达的AML片段免疫新西兰雄兔获得抗血清。结果表明,含AML全长的原核表达载体pET30a(+)-AMLcDNA的原核表达宿主菌株Rosetta(DE3),在加入不同浓度的诱导剂IPTG后,菌液浓度出现短暂增加后逐渐下降,且下降幅度与加入的IPTG浓度呈正相关,同时用SDS-PAGE电泳法未检测到预期融合蛋白的形成;而含AML片段的原核表达载体pET30a(+)-AMLcDNA(270-613)的原核表达宿主菌株Rosetta(DE3),在IPTG诱导下能正常生长,且能诱导出预期大小的融合蛋白。利用制备型SDS-PAGE法纯化此融合蛋白作为抗原免疫新西兰雄兔获得抗血清,用该抗血清作为一抗进行Western blot,在海芋块茎、叶、叶柄和诱导菌体中均能检测到相应分子量的AML条带,表明制备的AML多克隆抗体可以用于检测AML。     

水稻黑条矮缩病毒外壳蛋白基因的克隆、原核表达及抗体制备

为探讨水稻黑条矮缩病毒（Rice black-streaked dwarf virus,RBSDV）的种群变异,采用RT-PCR方法从感染RBSDV山东分离物RBSDV-JN1的水稻中克隆该病毒的S10片段,并进行序列分析,进而构建包含RBSDV-JN1的CP基因的原核表达载体,导入大肠杆菌Escherichia coli BL21（DE3）诱导表达;并以表达的融合蛋白为抗原,制备病毒的多克隆抗体。结果显示：S10片段全长为1 801 bp,包含1个1 677 bp编码框,编码558个氨基酸的外壳蛋白（CP）;与GenBank已注册的19个RBSDV的CP基因序列相比较发现,病毒各分离物间核苷酸的序列相似性为90.5%~99.8%,氨基酸的序列相似性为95.9%~100.0%;地理位置较近的分离物间序列相似性较高,RBSDV种群分布呈现区域性差异。原核表达载体pET-RBSDV-CP经IPTG诱导,获得了分子量约为63 kD带有His标签的目的蛋白。用该蛋白制备的多克隆抗体经ELISA、Western blot和Dot-blot ELISA检测显示,效价为1：81 000,且具有良好的特异性。     

菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒EP-1-like基因克隆、原核表达与多克隆抗体制备方法

本实验提取被菜蛾盘绒茧蜂寄生后24h的小菜蛾幼虫体内总RNA,反转录合成cDNA,以此为模板PCR扩增出菜蛾盘绒茧蜂多分DNA病毒(Cotesia vestalis polydnavirus,CvBV)EP-1-like基因,将其分别克隆到表达载体pET30a、pET28a中,转化宿主菌BL21(DE3),获得单克隆重组质粒pET-30a-EP1L和pET-28a-EP1L。经IPTG诱导,pET-28a-EP1L成功表达了约34.8kDa的包涵体蛋白。将诱导条件优化以后,采用割胶回收的方法纯化包涵体,将纯化后的表达蛋白免疫新西兰大耳兔制备多克隆抗体。ELISA分析表明制备的抗体效价达1:128000,Western blot检测证明抗体具有良好的免疫反应特异性。     

桑脉带相关病毒N蛋白多克隆抗体的制备

 桑脉带相关病毒(Mulberry vein banding associated virus,MVBaV)属于番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)正番茄斑萎病毒属(Orthotospovirus)的新成员,是广西桑树病毒病的主要病原病毒。本研究将MVBaV核外壳蛋白(nucleocapsid protein, N protein)基因连接到pET-30a原核表达载体上,获得重组表达载体pET-30a-MVBaV-N并转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经IPTG诱导可表达产生一个含His标签、分子量约36.0 kDa的融合蛋白。用 Ni^{2 +} -NTA树脂纯化融合蛋白,将其免疫日本大耳兔制备多克隆抗体。间接ELISA测定抗体的效价为1∶256 000。Western blot 检测结果显示,该多克隆抗体在稀释倍数1∶1 000时与细菌表达的融合N蛋白及感病桑叶中的N蛋白产生特异性识别,但不与寄主蛋白产生交叉反应,表明具有良好的特异性和较高的灵敏度。将抗体按1∶2 500稀释后进行间接ELISA,可有效检出桑叶中的MVBaV。MVBaV N蛋白抗体的成功研制,为桑脉带病毒病的诊断及MVBaV与寄主相互作用机制的研究提供了重要的试剂。     

松材线虫类毒过敏原蛋白的原核表达及多克隆抗体的制备

 利用重叠延伸PCR基因合成法,按大肠杆菌偏爱密码子,合成松材线虫类毒过敏原蛋白基因（Bxvap2）,将其连接到原核表达载体pET-29b(+)上。获得的重组子转化大肠杆菌BL21(DE3)后,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析表明,目的蛋白以可溶形式高效表达,占细菌总蛋白的33.5 %。将表达产物经Ni-NTA亲和柱纯化后进行质谱分析,结果显示纯化的蛋白为BXVAP2蛋白。用制备的BXVAP2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,间接ELISA测得抗体灵敏度5.4 ng·mL^-1（效价为1∶1 360 000）,为进一步研究该蛋白的组织定位及功能,明确该基因在致病过程中的作用机理奠定了基础。     

甘蔗线条花叶病毒P1蛋白基因原核表达及抗血清制备

甘蔗线条花叶病毒Sugarcane streak mosaic virus(SCSMV)是引起甘蔗花叶病的主要病原之一,在世界各大蔗区普遍发生,严重威胁甘蔗产业的发展.建立快速有效的检测方法对于SCSMV的防控有着重要意义.本研究依据SCSMV P1基因序列合成一对引物,扩增获得1 074 bp的目的基因,将目的基因与...