基于种特异引物(SS-COI)快速鉴定锈红果实蝇

[目的]开展不受虫态限制的实蝇快速鉴定技术研究.[方法]基于mtDNA COⅠ基因序列,筛选设计了一对能够准确鉴定锈红果实蝇的种特异性引物XF29和XR293,选用锈红果实蝇作为阳性对照,颜带实蝇B.cilifer(Hendel)、瘤胫实蝇B.tuberculata(Bezzi)等19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增和电泳检测.[结果]仅阳性种锈红果实蝇在约265 bp的位置扩增出一条清晰且单一的条带,其余实蝇均未出现任何条带.[结论]采用SS-PCR技术,基于mtDNA COⅠ基因序列筛选设计的特异引物种特异性和稳定性强,可为进出境果蔬检疫、疫情早期预警和有效监测防治提供快速鉴定的依据.     

应用SS-PCR技术建立番石榴实蝇快速鉴定方法

应用种特异引物PCR(Species-specific PCR, SS-PCR)技术,基于mt DNA COⅠ线粒体基因系列,设计了1对能够准确鉴定番石榴实蝇Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)的种特异性引物FR447和FF463-486,选用番石榴实蝇作为阳性对照,以杨桃实蝇B.carambolae Drew&Hancock等其他19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。结果表明:仅番石榴实蝇能够在约645 bp位置扩增出1条清晰且单一的目的条带。将本实验建立的SS-PCR鉴定方法应用在实际检疫工作中,得到了验证。     

应用SS-PCR技术建立番石榴实蝇快速鉴定方法

应用种特异引物PCR(Species-specific PCR, SS-PCR)技术,基于mt DNA COⅠ线粒体基因系列,设计了1对能够准确鉴定番石榴实蝇Bactrocera(Bactrocera)correcta(Bezzi)的种特异性引物FR447和FF463-486,选用番石榴实蝇作为阳性对照,以杨桃实蝇B.carambolae Drew&Hancock等其他19种实蝇作为阴性对照,进行PCR扩增并将PCR产物进行电泳检测。结果表明:仅番石榴实蝇能够在约645 bp位置扩增出1条清晰且单一的目的条带。将本实验建立的SS-PCR鉴定方法应用在实际检疫工作中,得到了验证。     

利用物种特异性PCR技术快速鉴定南瓜实蝇

[目的] 快速鉴定我国进境植物检疫性害虫南瓜实蝇Bactrocera tau(Walker),防止该虫传入扩散.[方法] 基于物种特异性PCR(SS-PCR)技术,选取20种形态近似的常见实蝇,将南瓜实蝇作为阳性对照,提取基因组DNA模板,选用mt DNA COⅠ序列,检查同源系列,设计筛选1对可快速准确鉴定南瓜实蝇的...     

福建省实蝇种类监测和寄主初步调查

实蝇监测结果表明,福建省的实蝇种类有4种,包括桔小实蝇[Bactrocera(Bactrocera)dorsalis]、瓜实蝇[B.(zeugoda-cus)cucurbitae]、南瓜实蝇[B.(zeugodacus)tau]、具条实蝇(B.scutellata)。调查发现,福建省桔小实蝇寄主有35种,瓜实蝇寄主有26种,南瓜实蝇寄主有18种,有16种是这3种实蝇的共同寄主。     

果蔬混栽果园实蝇种类调查

从2014年开始,利用诱蝇醚(Methyleugenol)、诱蝇酮(Cuelure)2种实蝇引诱剂在南宁市的广西现代农业技术展示中心对番石榴、甜杨桃等与蔬菜混栽果园的实蝇进行监测调查,经鉴定,共发现桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇和具条实蝇等4种实蝇;对虫果饲养得出的成虫进行鉴定,在番石榴虫果中只发现有桔小实蝇1种实蝇,在甜杨桃虫果中除发现以桔小实蝇为主外,还有少量的瓜实蝇和南瓜实蝇;在南宁市果蔬混栽果园中桔小实蝇是为害番石榴、甜杨桃等的实蝇优势种,在防治桔小实蝇的同时,也应防治瓜实蝇。     

广东省实蝇类害虫调查初报

实蝇是危害水果和蔬菜的一类重要害虫,进行种类调查对于其检疫和防治具有重要意义。用多种诱剂、粘板在广东省的湛江、惠州、韶关、梅州4个市的10个调查点定点调查;将诱捕的实蝇带回实验室进行形态学鉴定,并统计每种实蝇的数量。4个地区共诱捕到实蝇11种,发生数量较多的有橘小实蝇[Bactrocera dorsalis(hendel)]、瓜实蝇[Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae(Coquillellett)]、南瓜实蝇[Bactrocera(Zeugodacus)tau(Walker)]、具条实蝇[Bactrocera(Zeugodacus)scutellata(Hendel)]、辣椒实蝇[Bactrocera(Bactrocera)latifrons(Hendel)]。在韶关、惠州共捕获到4头合腹寡毛实蝇属(Dacus)实蝇,初步鉴定为三点棍腹实蝇[Dacus(Callantra)trimacula(Wang)],为广东省首次报道,调查结果显示:从发生区域和数量上看,橘小实蝇均是广东省实蝇的优势种,其次是瓜实蝇;南瓜实蝇在调查区域均有发生,具条实蝇主要分布在广东北部的韶关、梅州地区。此调查有助于对广东实蝇害虫发生情况的了解。     

应用种特异性ITS引物(SS-ITS)鉴别新菠萝灰粉蚧

[目的]研究新菠萝灰粉蚧的种特异性ITS引物,以快速准确鉴定该虫,可为口岸快速通关提供依据.[方法]采用PCR扩增方法,首次测定分析了11种粉蚧39个样品的新菠萝灰粉蚧及其他粉蚧的rDNA ITS全序列.基于ITS区序列差异设计了针对新菠萝灰粉蚧的特异性引物,通过筛选引物退火温度、优化PCR反应条件建立了新菠萝灰粉蚧的快速分子鉴定方法.[结果]种特异性ITS引物只对新菠萝灰粉蚧有扩增条带,能有效扩增出约665 bp的DNA片段,其余种类均未有扩增条带.灵敏度试验结果显示该对引物灵敏度高,其检测限可达0.1 ng/μL.[结论]采用设计的ITS区种特异性引物可以对新菠萝灰粉蚧进行快速分子鉴定,该方法可为口岸一线检测鉴定提供参考.     

实时荧光PCR法快速检测地中海实蝇的研究

[目的]设计用于扩增地中海实蝇的特异性引物,建立快速、灵敏检测地中海实蝇的实时荧光PCR方法.[方法]采用实蝇科昆虫线粒体DNA COI基因的通用引物扩增地中海实蝇以及其它三种供试实蝇的DNA片段,经测序、比对分析,设计出扩增地中海实蝇的特异性引物,用SYBR Green实时荧光PCR方法验证该引物的特异性与灵敏度.[结果]设计的引物对DZH-F/DZH-R能特异性检测出地中海实蝇,扩增产物的溶解曲线峰值Tm为79.2.该对引物检测地中海实蝇的灵敏度为10-3 ng/μL.[结论]所建立的SYBRGreen实时荧光PCR方法检测地中海实蝇特异性强、灵敏度高.     

一种大批量快速提取白僵菌DNA的方法

[目的]优化大批量快速提取白僵菌DNA的方法。[方法]对DNA沸水抽提方法进行改进,通过PCR扩增仪对DNA提取液进行加热,迅速完成DNA的提取过程。[结果]通过大批量快速提取真菌基因组DNA方法提取的DNA质量可满足RAPD扩增分析的需要。22个试验菌株均扩增出清晰的条带,清晰条带数量为2～6条不等,条带大小主要集中在450～800 bp;该方法提取的DNA也完全可以满足SCAR扩增的需要,扩增出的用于标记F263菌株的特异性DNA条带十分清晰。[结论]该研究为大批量快速提取真菌基因组DNA提供了较为理想的方法。     

凯里地区果蔬实蝇种类监测初报

为果菜实蝇防控工作提供科学依据,2006～2008年,对凯里地区果蔬实蝇进行了监测.结果表明:凯里地区果蔬实蝇有1目1科1属4种,即橘小实蝇、瓜实蝇、具条实蝇、南瓜实蝇.前3种实蝇田间虫口密度大,危害重,是主要防除对象.具条实蝇在凯里地区的分布属首次报道.     

入境旅客非法携带番石榴中实蝇幼虫的分子鉴定

[目的]探索DNA条形码技术在实蝇快速鉴定中的应用。[方法]利用DNA条形码技术和BOLD系统,选取线粒体细胞色素氧化酶I(COI)基因片段,针对截获入境旅客非法携带的番石榴中实蝇幼虫进行序列测定、比对和分析,并对培养后的成虫进行形态学分类从而验证分子分类的结果。[结果]检测的11头实蝇幼虫全部鉴定为橘小实蝇[Bactrocera dorsalis(Hendel)]。[结论]为河北出入境检疫部门初步探索DNA条形码技术在实蝇快速鉴定中的应用及提升检疫工作的时效性奠定了技术基础。     

肠炎沙门氏菌特异性诊断方法的建立

用传统的分离鉴定方法从临床采集的12例不同蛋鸡样本中分离到1株肠炎沙门氏菌。为避免传统鉴定技术中可能出现的假阳性等问题,依据SEF 14菌毛是肠炎沙门氏菌的特异性粘附素这一特性,设计编码该粘附素基因中相对保守片段的1对引物,对上述可疑菌株进行PCR扩增,以含有编码SEF 14菌毛操纵子全基因的质粒DNA、标准株SD-2染色体DNA作为阳性对照,鸡白痢国内分离株SP染色体DNA作为阴性对照。PCR扩增结果显示分离株出现1条与预期大小498 bp一致的特异性扩增条带,阳性对照也出现相同大小的条带,而阴性对照则未出现。结合传统的细菌学分离鉴定和特定的分子生物学鉴定,将此可疑分离株确定为肠炎沙门氏菌。该方法可快速、准确、敏感地检测肠炎沙门氏菌。     

基于环介导等温扩增技术快速检测瓜果腐霉菌

[目的]建立一种快速、准确的检测瓜果腐霉菌(Pythium aphanidermatum)的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法,为诊断和防治瓜果腐霉菌引起的植物病害提供技术支撑。[方法]通过比较基因组学方法,在瓜果腐霉菌基因组上筛选有序列特异性的基因作为检测的靶标基因,设计LAMP特异性引物,建立一种基于颜色判定的快速、准确的LAMP检测方法,随后对该检测方法的特异性、灵敏度和发病组织实际检测等进行分析评价。[结果]鉴定到1个编码Trypsin蛋白酶的基因是瓜果腐霉菌特异的基因,以该序列作为靶标建立了LAMP检测方法。在扩增前加入染料羟基萘酚蓝(HNB)作为指示剂,在等温条件(64℃)下进行核酸扩增反应60 min,即可通过肉眼直接观察结果,HNB显示天蓝色即为阳性反应;同时,扩增产物经琼脂糖凝胶电泳验证为梯形条带,也可判定为阳性反应。特异性试验中,建立的LAMP检测方法能将瓜果腐霉菌和其他病原菌区分开。灵敏度试验中,LAMP检测方法的最低检测限为100 pg·μL-1,与Real-time PCR反应灵敏度一样,是普通PCR反应灵敏度的100倍。发病组织实际检测试验中,该LAMP方法能检测出人工接种发病植株中的瓜果腐霉菌。[结论]成功建立了一种适用于基层使用的针对瓜果腐霉菌的快速检测技术,为该菌所致病害的准确诊断奠定了技术基础。     

雅点六齿小蠹的SS-COI技术鉴定

[目的]采用SS-COI技术鉴定雅点六齿小蠹.[方法]采用基于线粒体DNA细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ（mtDNA COI）基因序列的种特异性（species-specific COI,SS-COI） PCR方法,设计雅点六齿小蠹SS-COI引物ipsc1和ipsc2.[结果]该引物特异性强,能扩增出清晰、单一的长度为594bp的特异性条带,与白云杉齿小蠹（Ips perturbatus）、黑条木小蠹（Trypodendron lineatum）、橡胶材小蠹（Xyleborus affini）、欧洲根小蠹（Hylastes ater）、咖啡果小蠹（Hypothenemus hampei）、长林小蠹（Hylurgus ligniperda）进行对照,均无条带出现.[结论]建立的雅点六齿小蠹PCR鉴定方法在实际检疫工作中得到验证和应用,表明该方法特异、灵敏、稳定,可以应用于口岸检疫鉴定工作.     

瓜实蝇热激蛋白基因hsp70的克隆及序列分析

[目的]克隆分析瓜实蝇热激蛋白hsp70基因序列特征,为进一步研究瓜实蝇的热适应性机制及制定综合防治策略奠定基础.[方法]根据NCBI数据库中已报道的昆虫hsp70基因保守序列,设计合成扩增瓜实蝇hsp70基因部分片段的简并引物,并利用RACE-PCR扩增其全长序列.[结果]克隆获得瓜实蝇hsp70基因cDNA全长序列(获取号:KM112021)2271 bp,含1911 bp的开放阅读框,编码636个氨基酸,具有真核生物hsp70基因家族的3个明显基序标签,同时在C-末端具有EEVD基序,推测其属于胞质型热激蛋白.BLAST分析结果表明该序列与双翅目实蝇科昆虫hsp70基因高度相似,最高相似度达91％.氨基酸序列系统发育分析结果显示,瓜实蝇与双翅目实蝇科昆虫聚类为一个分支,证实hsp70基因的高度保守.[结论]瓜实蝇hsp70基因具有真核生物hsp 70基因家族的特征,序列表现为高度的保守性,可作为今后研究瓜实蝇抗逆性机制的一个参数指标.     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫,提取卵囊基因组DNA。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18SrDNA和5.8SrDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功分离出肠艾美尔球虫,PCR扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27个孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

肠艾美尔球虫单卵囊分离及ITS-1序列测定

[目的]建立一种有效的鉴定球虫种类分子生物学方法。[方法]采用单卵囊分离技术,分离肠艾美尔球虫。根据GenBank中发表的艾美尔属球虫18s和5.8srDNA序列,设计特异性引物,扩增内转录间隔区1（ITS-1）,PCR产物直接测序。[结果]成功地分离出肠艾美尔球虫,其卵囊扩增出434bp清晰条带,且最低能检测出27孢子化卵囊。[结论]该研究结果为球虫虫种及虫株的准确鉴定奠定了基础。     

滇西南南汀河流域实蝇种类及种群动态研究初报

利用诱蝇醚(Methyleugenol)和诱蝇酮(Cuelure)2种信息素诱剂对滇西南南汀河流域实蝇(Fruit fly)种群开展系统监测和网捕调查,共捕获实蝇43种。已鉴定明确学名的种类有34种,分属寡毛实蝇亚科(Dacinae)和实蝇亚科(Trypetinae)2个亚科,寡毛实蝇族(Dacini)和阿坎洞实蝇族(Acanthonevrini)2个族,离腹寡毛实蝇属(Bactrocera)、合腹寡毛实蝇属(Dacus)和阿坎洞实蝇属(Acanthonevra)3个属;捕获种类最多的监测点达30种,捕获量最高达40 504头,不同层次区域间实蝇捕获量差异达显著(P0.05)或极显著水平(P0.01);桔小实蝇[Bactrocera(Bactrocera)dorsalis(Hendel)]和瓜实蝇[Bactrocera(Zeugodacus)cucurbitae(Coquillett)]为优势种,南瓜实蝇[Bactrocera(Zeugodacus)tau(Walker)]为常见种;桔小实蝇、瓜实蝇、南瓜实蝇、泰实蝇[Bactrocera(Bactrocera)thailandica DrewHancock]和哈迪氏果实蝇[Bactrocera(Bactrocera)hardyi zhang,ji et chen]5种实蝇呈周年发生,其余实蝇种类呈季节性发生;桔小实蝇全年出现2次万头以上发生峰期,其他几种实蝇发生峰期和发生数量各有差异。     

基于AMEL基因的绵羊性别鉴定技术

[目的]探讨将牙釉蛋白(AMEL)基因用于绵羊性别鉴定的可行性。[方法]采用酚-氯仿法从湖羊的耳皮肤组织中提取基因组DNA。分别以公羊和母羊的DNA为模板,以AMEL引物和SRY引物进行PCR扩增。[结果]经扩增后母羊得到一条来自X染色体的270bp条带,而公羊则得到270和210 bp的两条带。两种方法对10份已知DNA样品检测结果与实际性别完全一致。PCR产物的电泳条带较为清晰,相同性别电泳条带数完全一致,而不同性别间电泳条带数和片段大小差异显著。AMEL引物扩增雌性个体DNA实际电泳条带数和理论条带数一致,而来自雄性结果却不一致,这可能与非特异性扩增有关。[结论]AMEL基因比SRY基因具有更高的灵敏性,可用于判定XY染色体动物的性别。