性控奶山羊精液X和Y精子分离比例检测方法的建立

旨在建立可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法,用以检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例,为性控技术的开发和生产应用提供技术支撑。本研究选择X、Y染色体中特异基因F9及ZFY片段设计引物,建立标准曲线,优化荧光定量PCR反应体系和条件。通过对阳性标准品梯度稀释以及对60支已知纯度的性控精液进行测定(3次重复)来检验方法的敏感性和可靠性。结果显示,所建立的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,X和Y精子检测灵敏性分别为47和51 copies·μL~(-1);利用该方法对商品化的奶山羊性控冷冻精液中X和Y精子的数量和比例进行计算,其结果与销售公司提供的X和Y精子的纯度无显著差异(P0.05),表明该方法结果可靠。本研究建立的计算奶山羊X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法特异性和重复性好,灵敏度高,结果可靠,为计算奶山羊精液分离后X、Y精子数量及比例提供了快速可靠的方法。     

牛性控精液纯度快速评价方法研究

为建立一种方便快捷的性控精液品质鉴定方法,本研究选择牛X、Y染色体特异基因PLP与SRY,对其提取质粒,构建含有不同比例的PLP和SRY质粒模板,即X:Y为1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1,并将其作为性别相关DNA定量的参考模板,使用实时荧光定量PCR(Real-timePCR)对市售的3头公牛性控精液进行了性别比例检测。结果表明:采用该方法检测的X-分选精液、Y-分选精液与未分选精液中X与Y精子比例与其所标注的X、Y精子比例(流式细胞仪重分析检测纯度)差异不显著。因此,本研究中建立的实时荧光定量PCR测定法可用于评估性控精液的纯度。     

不同染色与冷冻方法对关中奶山羊X、Y精子的分离及应用效果研究

为探究不同Hoechst 33342的染色浓度与冷冻方法对关中奶山羊X、Y精子进行分离及应用效果的影响，本实验采集6只关中奶山羊精液，使用浓度分别为10、11、12、13μL/m L的Hoechst 33342(5 mg/m L)染色液对精液样本进行染色，以流式细胞仪分离X精子和Y精子，应用3种不同冷冻程序冷冻精液，应用体外受精与胚胎发育技术评估关中奶山羊X、Y精液的分离准确性。结果表明：12μL/m L Hoechst 33342染色条件下，奶山羊X、Y精子分离效率达到91.02%，高于10μL/m L和13μL/m L(P<0.01)，最高分选速度为4 134个/s(P<0.05)；公羊个体的精液品质越好，其精子的分离速度越快，但对分离准确率的差异不显著；使用冷冻程序2进行关中奶山羊的X、Y精子冷冻的效果较好（P<0.05）；体外受精48 h后，使用Y精子进行受精的卵细胞的卵裂率高于使用X精子（P<0.05），在胚胎培养第9天，使用Y精子进行受精的卵细胞的囊胚发育率高于使用X精子（P<0.05）。总之，当Hoechst 33342浓度为12μL/m L...     

猪性控精子纯度实时荧光定量PCR检测方法的建立

研究旨在利用实时荧光定量PCR法检测杜洛克猪性控精子，以期建立一种快速、准确且经济高效的性控精子纯度检测方法。选取位于猪Y染色体上的Y染色体性别决定区（sex-determining region Y，SRY）基因和位于X染色体上的A-激酶锚定蛋白4（A-kinase anchoring protein 4，AKAP4）基因，以猪耳组织样提取的基因组DNA为模板进行PCR扩增验证引物的特异性，利用胶回收试剂盒进行回收并质粒小提，将获得的两种质粒经检测后稀释至相同浓度（20 ng/μL），混合构建含有不同比例SRY和AKAP4基因的质粒模板，用于绘制检测精子纯度所用标准曲线的反应模板。分别使用SRY和AKAP4基因特异引物检测3个混合的X精子（P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3）和3个混合的Y精子（P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3）的纯度。结果显示，用SRY基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%，P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%；用AKAP4基因特异性引物检测P.x_gro1、P.x_gro2、P.x_gro3精子的纯度分别为91.44%、91.93%、88.99%，P.y_gro1、P.y_gro2、P.y_gro3精子的纯度分别为89.91%、87.31%、88.71%；卡方适合性检验结果显示，两次检测结果之间差异不显著，表明使用这种方法进行精子纯度检测所得结果准确。本试验通过实时荧光定量PCR法准确检测了经流式细胞仪分选后的精子的纯度，建立了一种利用实时荧光定量PCR法检测猪精液中X精子和Y精子比例的新方法。     

荷斯坦公牛X和Y精子核形态差异及其影响因素分析

旨在分析荷斯坦公牛X和Y精子核形态(包括精子大小和形状)及其差异,探究流式分选及分选后冷冻对公牛X和Y精子核形态的影响.本研究使用荧光显微镜拍摄15头年龄相当、健康状况良好的荷斯坦公牛X和Y精子冷冻前后及新鲜精液分选前后共6类精子核图像,利用Image J插件Nuclear Morphology Analysis分析3...     

水牛精液中X和Y精子比率的鉴定

利用流式细胞仪分析水牛分离和未分离精液中精子的DNA含量,所得的直方图用高斯曲线拟合,分析计算出样本中X和Y精子的比率。结果表明:未分离的水牛精液中X精子的比率为50%,与正常水牛后代性别比率没有显著差异;而水牛的分离X精液样本中X精子占93%,分离Y精液样本中Y精子占89%。实验结果显示了流式细胞仪DNA分析法鉴定水牛精液中X和Y精子比率的可靠性,而流式细胞仪分离精子程序和方法在水牛上的应用是可靠而有效的。     

哺乳动物X精子和Y精子的分离及特点

随着分离 X 和 Y 精子的成功,各种各样的技术方法也相应建立起来了。人的 Y 精子上的荧光小体(F-小体)能够被喹吖因有效染色,所以近来的大多数分离研究工作采用人精子,用这种染色方法在显微镜下估测所得到的两类精子的比率。另一种有用的方法是用流式细胞计数器来测定 DNA 含量从而得到相应于 X、Y 精子数量的两个分离峰。迄     

浅谈优化分离精液的冷冻保藏方法

正动物的性别控制技术是通过对动物的正常生殖过程进行人为干预,使成年雌性动物产出人们期望性别后代的一门生物技术。现在一般多采用流式细胞仪进行X、Y精子分离法,该技术是利用动物含有X染色体和含有Y染色体的精液中DNA含量的差异,借助特异性染色剂染色,然后根据发出的荧光强度,通过计算机预测精子类别,再通过给精液液滴附加电荷,根据静电原理,将含有X染色体的精液和Y染色体的精液分离,得到分离精液,如果得到的分离精液在短     

奶山羊XY精子分离及低剂量输精效果研究

用假阴道法采集6只西农萨能羊种公羊精液,经过7h运输,利用流式细胞仪进行XY精子分离、冷冻.对16只阴道硅胶栓+孕马血清同期发情处理的母羊,撤栓后58～66 h采用腹腔内窥镜子宫角低剂量输入106个有效Y精子,与用同一头种公羊人工授精配种的10只母羊进行对照.结果表明:1份(11号公羊)精液能够达到60%活率,X精子分离速度(4 200 sperm/sec)不同于Y精子分离速度(4 500 sperm/sec),共获得66管冻精(X31管,Y35管),X、Y型冻精活率分别为0.45±0.04和0.43±0.03;2 h存活指数均为0.05;顶体完整率分别为(70.1±10.1)%和(68.9±6.8)%;每管有效精子数为104.85万±6.11万和103.20万±8.31万;性别比分别为94.36%和96.19%.腹腔内窥镜低剂量冻精输精试验中,试验组出生率为25%,而对照组为90%;试验组4只羔羊全部为雄性;试验组和对照组母羊妊娠期、羔羊出生重等差异不显著.因此,利用流式细胞分选和冷冻技术可以获得高纯度奶山羊冷冻X和Y精子,并通过腹腔镜低剂量输精能够获得健康后代.     

牛、梅花鹿和山羊X、Y精子头部面积差异分析

用流式细胞仪分选有正常繁殖力的公牛(n=3)、公鹿(n=3)、公山羊(n=1)的精液,获得高纯度(≥91%)X和Y细管冷冻精液,对解冻后的X和Y精子进行常规染色制片,采用Motic Images Advanced 3.2软件自动测量X精子和Y精子头部面积。结果显示,公牛X精子的头部面积35.84μm2±4.12μm2,极显著高于Y精子(34.81μm2±3.72μm2)(P<0.01);梅花鹿X精子的头部面积33.29μm2±2.93μm2,极显著高于Y精子(32.90μm2±3.25μm2)(P<0.01);山羊X精子的头部面积28.53μm2±3.16μm2,也极显著高于Y精子(28.07μm2±3.19μm2)(P<0.01);不同分选纯度的公牛精液X精子之间、Y精子之间头部面积差异均不显著(P>0.05)。结论:牛、梅花鹿、山羊X精子头部面积均极显著高于Y精子。     

Validating bovine sexed semen samples using quantitative PCR

In cattle, separation of X‐ and Y‐bearing sperm cells by flow‐sorting technology makes it possible to predetermine the sex of calves. Due to high costs and decrease in fertilization, the extensive use of sexed semen in livestock depends heavily on sorting purity of sperm cells. Validating the accuracy of sperm sexing requires reliable procedures, therefore a real‐time polymerase chain reaction (PCR) assay was established to calculate the male cell proportion in the sexed semen based on the relationship between the amplification of a SRY fragment and an autosomal gene (MSHR) fragment. Our results showed stable amplification of SRY for 100–1 ng of genomic DNA, which allows detection of 1% of male cells if 100 ng of target DNA is used. To account for the discrepancy in the efficiency of the MSHR and the SRY amplification correction of the difference of the mean values was performed. The ratio of male to female sperm cells in unsexed semen cells was very accurately determined. The fractions of the sexed samples, however, were different from the expected range appearing lower than estimated. Thus, the study reveals that real‐time PCR provides a good basis for the examination of sexed sperm cells, but needs to be optimized for the samples.     

利用流式细胞仪建立牦牛X、Y精子分选体系的研究

旨在探索与优化牦牛精子分选条件,建立高效的牦牛X、Y精子分选技术体系。本研究制备了牦牛精液细胞悬液,采用不同量的DNA染料Hoechst33342和诱惑红共孵育精子细胞。利用流式细胞仪分选牦牛X、Y精子,通过比较分选效率、分选后精子活力及发育潜能,优化分选条件。运用RT-PCR检测分选精子的纯度,利用精子分析系统检测分选后精子的活力。将分选后的精子与体外成熟的卵母细胞进行体外受精,统计分选后精子的发育潜力,并采用SRY片段的PCR法检测早期胚胎的性别。结果显示,10 μL Hoechst33342染色40 min后的分选效果最佳,其分选产物的准确度和分选效率显著优于其他组,分选后的X、Y精子活力与20 μL Hoechest33342染色20 min组相当,显著高于其他组（P<0.05）。添加5 μmol·L^-1的诱惑红对分选的纯度无显著影响（P>0.05）,但能显著提高分选后精子的活力（P<0.05）。分选后X、Y精子分别与卵母细胞进行体外受精,受精率和囊胚形成率与未分选组差异不显著（P>0.05）,且胚胎性别比例与分选后精子纯度吻合。综上,本研究建立并优化了流式细胞仪分选牦牛X、Y精子的方法,添加诱惑红有助于改善分选后牦牛精子的活力,为后期牦牛性控精液的制备及生产奠定了基础。     

白绒山羊性控胚胎生产及移植应用研究初探

应用X性控冷冻精液对超排供体白绒山羊进行人工授精,生产性控胚胎并进行鲜胚移植。结果发现,①用性控冻精和鲜精输精的供体母羊,平均卵子回收数分别为13.3和12.5枚,其中性控冻精组受精卵比例为29.6%（55/186）,极显著低于鲜精组94.0%（281/299）的比例（P<0.01）;②性控胚胎和普通胚胎移植受体母羊产羔率分别为42.2% 和58.1% ,二者差异极显著（P<0.01）;③性控胚胎移植受体母羊所产羔羊雌性所占百分数为100%,极显著高于普通胚胎移植（P<0.01）。表明通过白绒山羊X、Y精子分离、人工授精生产性控胚胎,同时结合胚胎移植技术,可以达到按照生产实际中的意愿得到性别控制子代白绒山羊的目的。     

转基因牛与非转基因牛性控精液分离及配种效果初探

本研究对转基因牛以及非转基因牛精液经流式细胞仪分离冷冻后精子活力、分离准确率进行了比较,同时对分离的性控冷冻精液进行了人工输精,对受体牛的情期受胎率进行了统计分析。结果表明,转基因牛与非转基因牛精液在冷冻解冻后活力以及分离准确率方面差异不显著(P>0.05);转基因牛与非转基因牛的性控冷冻精液的情期受胎率分别为57.4%、59.3%,二者之间差异不显著(P>0.05)。     

山羊RORα基因的克隆、表达载体构建及功能分析

旨在克隆山羊维甲酸相关孤儿受体α(RORα)基因并构建其真核表达载体,然后利用生物信息学工具系统分析RORα的生物学特性,最后对其在山羊生物钟系统中的作用机制进行初步探究。本研究以1只健康的12月龄雄性西农萨能奶山羊为试验动物,提取其肝组织总RNA,经逆转录PCR反转录为cDNA后,利用常规PCR扩增山羊RORα基因的编码区(coding sequence,CDS)片段,使用同源重组法将其与pcDNA3.1-Puro-N-3HA载体相连接; 重组载体经PCR、酶切和测序鉴定后,将阳性质粒命名为pcDNA3.1-3HA-gRORα; 将pcDNA3.1-Puro-N-3HA和pcDNA3.1-3HA-gRORα质粒分别转染至HEK293T细胞后,通过实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,qPCR)和蛋白质免疫印迹(western blotting,WB)技术检测山羊RORα的表达; 同时利用ExPASy、ProtScale等软件对山羊RORα基因进行系统的生物信息学分析。另外,使用同源重组法分别构建含有山羊生物钟基因BMAL1和NR1D1启动子片段的pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc及pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc的荧光素酶报告质粒,并通过双荧光素酶报告试验探究山羊RORα蛋白调控BMAL1和NR1D1基因启动子转录活性的作用机制。PCR、酶切和测序鉴定结果表明,pcDNA3.1-3HA-gRORα重组质粒构建成功; qPCR和WB结果显示,pcDNA3.1-3HA-gRORα转染组RORα基因的mRNA表达水平和蛋白表达水平均显著高于pcDNA3.1-Puro-N-3HA转染组(P < 0.01)。生物信息学分析结果显示,山羊RORα基因CDS区序列与绵羊、牛和猪的相似性较高,分别为97.5%、97.1%和95.2%。山羊的RORα蛋白是一种亲水性蛋白。二级结构由α-螺旋、延伸链、β-转角和无规则卷曲组成,有信号肽的概率较小,无跨膜区; 三级结构与小鼠和人的RORα蛋白差异性极小,三者具有高度相似性。此外,PCR、酶切和测序结果表明,pGL4.10-BMAL1-Promoter-Luc和pGL4.10-NR1D1-Promoter-Luc重组质粒构建成功。双荧光素酶报告试验结果表明,山羊RORα蛋白可以显著上调山羊BMAL1和NR1D1基因启动子的转录活性。本研究成功构建了山羊RORα基因的真核表达载体,并证明了RORα蛋白可以正向调控山羊BMAL1和NR1D1基因的启动子活性,这为进一步探究山羊核受体RORα的功能及山羊生物钟的转录调控机制提供了前期基础。     

复合添加剂对解冻后奶牛性控冻精质量及受胎率的影响

【目的】试验旨在研究以褪黑素和地诺前列腺素组成的复合添加剂对奶牛性控冻精解冻后精子质量及奶牛人工授精后受胎率的影响。【方法】30份奶牛性控冻精样均分为2组：试验组和对照组,试验组添加由24 ng/mL褪黑素、1.5 mg/mL地诺前列腺素及精液稀释液组成的250 μL复合添加剂,对照组添加250 μL精液稀释液,试验组和对照组均与解冻后的奶牛性控冻精按照1∶1（V/V）进行混合,室温孵育0、2及4 h,通过免疫荧光染色分析精子活率、顶体完整率、高能线粒体活性精子比率;对216头青年奶牛和82头头胎奶牛输精后通过28 d早孕检测来确定受胎率情况。【结果】与对照组相比,经复合添加剂处理0 h的性控冻精活率、顶体完整率及高能线粒体活性精子比率均无显著变化（P＞0.05）;经复合添加剂处理2 h的性控冻精活率、顶体完整率、高能线粒体活性精子比率均显著升高（P＜0.05）;经复合添加剂处理4 h的性控冻精活率和顶体完整率均无显著变化（P＞0.05）,高能线粒体活性精子比率显著升高（P＜0.05）。在输精试验中,试验组青年奶牛和头胎奶牛中的受胎率分别为65.22%和48.21%,均显著高于对照组（P＜0.05）。【结论】以褪黑素和地诺前列腺素组成的复合添加剂可以促进解冻后奶牛性控冻精精液品质以及青年奶牛和头胎奶牛输精后的受胎率。     

品种、季节、胎次、采精月龄及采精间隔对猪精液品质的影响

【目的】探究品种、公猪出生胎次、公猪同窝仔猪数、公猪乳头数、采精季节、采精月龄和采精间隔对猪精液品质的影响,以及不同品种对精液质量稳定性的影响。【方法】选取909头杜洛克、长白、大白种公猪为试验群体,收集2021年4月至2022年4月27 408条精液测定记录,采用混合线性分析模型和方差分析探究品种、公猪出生胎次、公猪同窝仔猪数、公猪乳头数、采精季节、采精月龄和采精间隔对精液体积、精液密度、精子活力、直线前进运动精子比例、精子畸形率、总精子数及各精液性状稳定性的影响。【结果】从不同品种对精液品质的影响来看,长白猪精液体积和总精子数均显著高于大白猪、杜洛克猪(P＜0.05),杜洛克猪精液密度显著高于大白猪和长白猪(P＜0.05),杜洛克猪、大白猪精子活力均显著高于长白猪(P＜0.05),大白猪直线前进运动精子比例显著高于长白猪和杜洛克猪(P＜0.05),长白猪和大白猪精子畸形率均显著低于杜洛克猪(P＜0.05);从不同公猪出生胎次对精液品质的影响来看,1~3胎出生的公猪具有较高的精液品质;从不同采精季节对精液品质的影响来看,精液密度、精子活力和总精子数秋、冬季显著高于春、夏季(P＜0.05);从不同采精月龄对精液品质的影响来看,16~25月龄公猪具有较高的精液品质;从不同采精间隔对精液品质的影响来看,4~5 d为最佳采精间隔,采精间隔过长会导致精子畸形率上升;从不同公猪总乳头数来看,乳头数13~16个时,各精液性状品质都处于中等水平,有利于公猪生产应用。3个品种各精液性状间稳定性趋势不一,杜洛克猪和大白猪精液体积和精子活力的稳定性均显著高于长白猪(P＜0.05),杜洛克猪精液密度、精子畸形率和总精子数的稳定性均显著高于大白猪和长白猪(P＜0.05),大白猪直线前进运动精子比例的稳定性显著高于长白猪和杜洛克猪(P＜0.05)。各品种中,长白猪稳定性较差;各精液性状中,精子活力稳定性最好。【结论】品种、公猪出生胎次、采精季节、采精月龄和采精间隔均会影响公猪精液品质,可根据不同品种公猪制定更完善的选择方案,提高精液质量,加速公猪遗传改良。     

饲料及动物性食品中山羊源性和绵羊源性成分双重荧光PCR检测方法的建立

目的建立一种能同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法,应用于动物源性饲料及动物性食品的快速检验.方法分别根据山羊、绵羊线粒体种间保守序列,设计合成针对山羊和绵羊的特异性引物及TaqMan探针,通过荧光PCR反应体系和反应条件的优化筛选,建立可同时检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分的双重荧光PCR方法.结果本研究所建立的双重荧光PCR检测方法可同时快速检测饲料及动物性食品中的山羊和绵羊源性成分,应用本方法检测山羊肉和绵羊肉模板的检出限均为10-5,与相应的单重荧光PCR方法的检出限一致,比国标法(GB/T20190-2006)的灵敏性高100倍.结论本研究建立的双重荧光PCR检测方法特异性好、敏感性强,适用于饲料、肉制品、乳制品等动物源性食品的快速检测