基于H蛋白表位合成肽的小反刍兽疫病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

本研究旨在建立针对小反刍兽疫病毒(peste des petits ruminants virus, PPRV)H蛋白抗体的iELISA检测方法。以筛选的H蛋白B细胞表位为基础,选择反应原性较好的4个抗原表位肽串联后合成作为包被抗原,优化各步反应条件及筛选各种缓冲液,并确定检测临界值。经优化后,多表位抗原肽的最佳包被量为1.5×10~(-6)μg·孔~(-1),血清临界稀释度为1∶100,酶标二抗最佳稀释度为1∶80 000;包被液为碳酸氢盐缓冲液,血清和二抗稀释液均为PBST溶液,封闭液为2%BSA溶液;阴、阳性临界值为0.25。不同血清的检测结果表明,批内及批间检测结果变异系数均小于10%,证明该方法具有良好的稳定性;对羊痘、口蹄疫、蓝舌病阳性血清的检测均为阴性,说明该方法具有良好的特异性;与ID-Vet公司的cELISA试剂盒对306份临床血清平行检测,两者相对符合率为92.81%。该研究所建立的PPRV H蛋白抗体iELISA检测方法特异、稳定、敏感,操作比cELISA简便快捷,省时省力,可用于临床小反刍兽疫抗体检测。     

旋毛虫新生幼虫期特异性基因T668主要抗原表位短肽的筛选

为进一步从T668基因编码的蛋白中寻找到敏感性及特异性较高的抗原表位,对T668主要抗原表位区进行抗原表位作图,进一步设计了一套共16条覆盖整个抗原表位决定区的短肽,并与GST融合表达,用Western blot筛选具有高反应原性的短肽。结果显示,N5EM4、N5EM5、N5EM7、N5EM8、N5EM9、N5EM116条融合短肽与感染旋毛虫的猪血清有强阳性反应条带,但均表现出较明显的假阳性。将筛选出的6条短肽人工合成后与牛血清白蛋白偶联,利用Dot blot进一步验证,结果显示融合短肽N5EM11-BSA表现出良好的反应原性和特异性。此抗原短肽的发现对进一步确定T668蛋白虫体定位、功能及旋毛虫病诊断试剂盒的研发奠定了基础。     

H5亚型AIV HA抗原表位重组蛋白McAbs的制备及应用

目的以H5亚型禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)的血凝素(HA)抗原表位重组表达蛋白为抗原,探索H5亚型AIV单克隆抗体制备的简便有效途径。方法利用H5亚型AIV的HA抗原表位原核表达重组蛋白为抗原,4次免疫8～10周龄雌性BALB/c小鼠后,取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,用间接ELISA方法筛选能分泌单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并对单克隆抗体的特性及初步应用价值进行测试。结果得到一株能稳定分泌针对H5亚型AIVHA抗原表位的特异性单克隆抗体杂交瘤细胞株,单克隆抗体ELISA效价达1:5×104,为具有IgK轻链的IgM亚类。该单克隆抗体能特异性地与H5亚型AIV产生肉眼可见的WesternBlot免疫印迹反应,与其它供试的禽病抗原无反应。H5N1亚型AIV阳性血清能有效阻断辣根过氧化酶标记的单克隆抗体与HA抗原表位重组蛋白的结合。结论本研究探索出一条利用H5亚型AIV的HA抗原表位重组表达蛋白为抗原的单克隆抗体制备的简便、高效途径,所制备的单克隆抗体稳定性好、效价高、特异性强,在H5亚型禽流感病毒及其血清学检测中有较高的应用价值。     

猪流行性腹泻病毒S2基因B细胞表位的筛选及其单克隆抗体的制备与鉴定

目的 应用生物学软件与单克隆抗体技术相结合的方法鉴定PEDV S2基因B细胞表位肽。方法 利用CLC Sequence viewer 6.8软件及在线数据库IEDB筛选出PEDV S2基因B细胞表位,并人工合成表位肽。将表位肽与钥孔血蓝蛋白（KLH）耦联后作为抗原,免疫雌性BALB/c小鼠,通过ELISA法筛选出抗体效价较高的小鼠进行1次加强免疫,3 d后取脾脏制备脾细胞悬液进行细胞融合。经HAT选择培养基培养筛选有效杂交瘤细胞,采用ELISA法筛选阳性克隆继续进行扩大培养。将部分阳性杂交瘤细胞进行小鼠腹腔注射,并收集腹水。通过ELISA方法分别检测小鼠腹水和单克隆细胞株培养上清液抗体效价,确定最高效价作为后备细胞株。结果 筛选出B细胞表位肽序列为:MQYVYTPTYYML;免疫多肽抗原后融合前血清抗体效价达到1:2 000;BALB/c小鼠腹水及单克隆细胞株培养物上清液ELISA检测结果显示抗体效价达到1:4 000。结论 筛选出了PEDV S2基因B细胞表位,为PEDV表位肽疫苗载体构建研究提供参考。     

H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原表位的筛选及其抗原性分析

本研究旨在对H1N1猪流感病毒血凝素蛋白抗原分子的模拟表位进行分离鉴定并分析其抗原性。用抗H1N1猪流感病毒血凝素蛋白小鼠血清IgG对噬菌体随机12肽库进行筛选,3轮亲和筛选后,特异性噬菌体得到了有效富集;对随机挑选的47个噬菌体克隆用ELISA进行鉴定,其中40个为阳性;对40个阳性克隆测序得到3种不同氨基酸序列;用Western blotting对获得的3个不同序列的噬菌体克隆进行抗原性分析,显示这3种噬菌体插入短肽能和H1N1猪流感病毒感染小鼠血清特异性结合。结果表明,本试验获得了3种H1N1猪流感病毒血凝素蛋白模拟抗原表位,它们都具有明显的抗原性,为H1N1猪流感病毒的疫苗研究和诊断奠定了基础。     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位多肽序列鉴定及分析

为了对流行性乙型脑炎病毒(JEV)E蛋白抗原表位E19进行核心序列定位,本研究设计了一系列编码相互部分重叠短肽核苷酸序列,原核融合表达后经western blot分析,确定其抗原表位核心序列为150ENHGNYS156.该表位在乙型脑炎不同基因型的各种病毒株间为高度保守序列;根据JEV E19表位与同一血清群其他黄病毒之间的差异,在同源序列位置设计了系列突变短肽,融合表达后western blot分析的结果表明,其他黄病毒属病毒同源序列不能与抗JEV阳性血清反应.本实验结果表明JEV E蛋白抗原表位E19具有鉴别检测JEV与西尼罗病毒等其它黄病毒的意义.本实验为进一步研究E蛋白结构和功能以及建立乙型脑炎临床鉴别诊断方法奠定了分子生物学基础.     

抗东方马脑炎病毒结构蛋白E2单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定

为制备抗东方马脑炎病毒(EEEV)结构蛋白E2的单克隆抗体(MAb)并鉴定其抗原表位,本研究以Bac-to-Bac真核表达系统表达EEEV E2蛋白,纯化后作为免疫原免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0进行融合.以原核表达载体pET-30a表达并纯化的EEEV E2蛋白作为包被抗原建立间接ELISA方法筛选杂交瘤细胞,获得4株稳定分泌抗EEEV E2蛋白MAbs的杂交瘤细胞株,分别命名为6F3、6F11、7C11、8B11.Western blot与间接免疫荧光试验结果表明,获得的4株MAbs均与EEEV呈阳性反应,而与西方马脑炎病毒、乙型脑炎病毒以及登革热病毒1型～4型呈阴性反应.利用部分重叠的原核表达的短肽对E2蛋白抗原表位进行鉴定,初步确定MAb 6F11、7C11和8B11识别的抗原表位均为E-33 (321EGLEYTWGNHPPKRVW336),而MAb 6F3无短肽与其反应,推测可能为构象表位.本研究结果为建立EEEV型特异性检测方法、研究E2蛋白结构功能及该病的进一步防制奠定了基础.     

日本乙型脑炎病毒E抗原表位的筛选

为筛选日本乙型脑炎病毒(JEV)的E抗原表位,本实验以抗JEV E蛋白的单克隆抗体(MAb)作为固相筛选分子,应用噬菌体表面展示技术,按消减、结合、洗脱、扩增的顺序筛选噬菌体七肽库,挑取噬菌体单克隆培养并采用MAb包被的ELISA鉴定,对阳性克隆测序分析,确定JEV E抗原模拟表位的氨基酸序列.设计合成包含该表位的E抗原15肽(E-365GGADSMSMAGMAVSYE-379)cDNA序列,与pGEX-KG构建重组表达质粒,诱导表达重组多肽并进行western blot验证.经过4轮筛选后,噬菌体得到高度富集,挑取单克隆采用MAb包被进行ELISA鉴定,有22个克隆呈阳性.对重组多肽进行western blot验证,结果表明该重组多肽能够特异结合兔抗JEV多克隆抗体.本实验成功筛选出JEV结构蛋白E的特异性噬菌体模拟表位,为开展用JEV抗原表位探索JEV的防制研究创造了条件,为多肽疫苗研制、药物筛选以及特异血清学诊断方法的建立提供重要依据.     

乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39特异性单克隆抗体的制备

为了制备乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位特异性单克隆抗体,将编码乙型脑炎病毒E蛋白抗原表位E39的DNA序列进行人工合成,随后插入表达载体pGEX-6p-1的限制性酶切位点BamHⅠ与XhoⅠ之间,构建了表位肽与GST的融合表达质粒。该表住融合蛋白经亲和层析纯化后免疫BALB／c小鼠,按常规方法进行细胞融合。以化学合成的E39表位多肽为抗原,对融合细胞上清进行间接ELISA筛选。结果,筛选出1株分泌E39表位特异性抗体的杂交瘤细胞株,该杂交瘤细胞分泌抗体能力稳定。经鉴定,该单克隆抗体亚型为IgG2b,轻链类型为κ链。结果表明,用表位融合蛋白为抗原可以制备表位特异性单克隆抗体。     

一株25型蓝舌病病毒VP7蛋白单克隆抗体识别表位的鉴定

为研究本实验室制备的一株抗25型蓝舌病病毒(BTV-25)VP7蛋白单克隆抗体(MAb)3H7识别的B细胞抗原表位,本研究利用噬菌体展示技术对3H7识别的抗原表位进行鉴定。经过3轮淘选后进行测序,测序结果经分析比对后获得共同的短肽序列为QYHAM;将该短肽序列合成后与3H7细胞上清和腹水均能够发生特异性反应;与BTV1~24型标准阳性血清的间接ELISA结果均呈现阳性反应;进一步的序列分析表明该表位的氨基酸序列QYHAM在不同血清型的BTV株间保守,确定该MAb识别的VP7抗原表位为238QYHAM242,本研究对于BT疫苗的设计及高通量检测试剂盒的研制均具有重要意义。     

骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA检测方法的建立

为建立骆驼斯氏副柔线虫病间接ELISA （iELISA）诊断方法,本试验对骆驼斯氏副柔线虫半胱氨酸蛋白酶CPR基因进行重组表达,将获取的重组蛋白（rCPR）进行纯化和Western blotting检测,然后以纯化好的重组蛋白为抗原,通过棋盘滴定试验优化了抗原包被浓度、包被条件、抗体稀释度、酶标二抗稀释度、封闭液和封闭时间等,建立了骆驼斯氏副柔线虫病iELISA诊断方法,并对建立的iELISA检测方法进行了重复性、敏感性、特异性试验和临床检测。结果显示,抗原最佳包被浓度为8 μg/孔,血清最佳稀释度为1：50,酶标二抗最佳稀释度为1：5 000,最佳包被条件为4℃包被过夜,最佳封闭条件为3% BSA封闭2 h。临界值为0.235,待检血清D_{450 nm}值>0.235则确定为阳性。重复性试验中变异系数均<10%,重复性较好;用该方法检测阳性血清的敏感性为96.3%;此方法仅与骆驼斯氏副柔线虫病阳性血清发生特异性反应,与感染了其他寄生虫的阳性血清无交叉反应,特异性为100%;对140份临床血清进行检测,阳性率为86.4%。综上可知,本试验成功建立了一种快速有效诊断骆驼斯氏副柔线虫病的iELISA方法。     

西尼罗河病毒病竞争ELISA检测方法的初步建立及应用

本研究用表达的西尼罗河病毒(WNV)囊膜蛋白E结构域III蛋白作为包被抗原,单抗8F4A4作为竞争检测抗体,初步建立了能够对乙型脑炎病毒(JEV)和WNV进行鉴别诊断的竞争ELISA方法。优化的最佳抗原包被浓度为530ng/mL,单抗的最佳稀释倍数为1:8000,待检血清的最佳稀释倍数为1:10。通过对56份阴性样品进行检测确定了该方法的临界值为30%,以此为判定标准对临床220份血清进行检测,结果均为阴性。此方法的建立弥补了商品化试剂盒不能区分JEV和WNV感染的缺陷,为我国西尼罗河病毒病的流行病学调查提供了一种有效的抗体检测方法。     

Monoclonal antibody-based competitive ELISA for simultaneous detection of rinderpest virus and peste des petits ruminants virus antibodies

An experimental competitive enzyme-linked immunosorbent assay (morbillivirus cELISA) using a recombinant N antigen (rRPV N) expressed in a baculovirus and a ruminant morbillivirus (RPV and PPRV)-specific monoclonal antibody (P-13A9) was developed for simultaneous detection of rinderpest virus (RPV) and peste des petits ruminants virus (PPRV) antibodies and its diagnostic performance was evaluated. A set of known reference antisera against RPV and PPRV belonging to different lineages, experimental sera from cattle vaccinated for a RPV of Asian lineage, and field sera from cattle and sheep/goat populations known to be positive (West Africa) and negative (Korea) for RPV and PPRV were used for the evaluation. Morbillivirus cELISA results on the panel of experimental RPV and PPRV antisera showed high correlation (r=0.97) between the whole virus and the rRPV N antigens, suggesting that the rRPV N contains a ruminant morbillivirus-specific antigenic determinant recognized by the P-13A9 and it may be suitable as an ELISA antigen in place of the whole virus. Morbillivirus cELISA detected anti-RPV and anti-PPRV antibodies in all reference RPV and PPRV antisera containing VN titers >/=1:8, suggesting that the assay can simultaneously detect antibodies against RPV and PPRV. Anti-RPV antibody was detected by morbillivirus cELISA in vaccinated cattle as early as the VNT and continued to be detectable by both the cELISA and the VNT until termination of the study. When applied to field samples from Africa, morbillivirus cELISA showed good agreement with a RP cELISA kit (kappa value of 0.86) in bovine sera and with a peste des petits ruminant cELISA kit (kappa value of 0.81) in caprine/ovine sera. Usefulness of morbillivirus cELISA using the rRPV N protein was discussed.     

布鲁氏菌4种高通量抗体检测方法的比较研究

旨在科学选择和使用布鲁氏菌抗体检测方法,推动布病诊断试剂标准化。本研究用布病阳性血清标准品测定了国家/OIE布鲁氏菌病参考实验室开发的布鲁氏菌荧光偏振（FPA）抗体检测试剂盒、动物布鲁氏菌病竞争ELSIA （cELISA）抗体检测试剂盒、牛布鲁氏菌病间接ELISA （iELISA）抗体检测试剂盒和改进的微量补体结合试验（mCFT）等4种方法的灵敏度。通过对已知阴、阳性血清样品的检测,比较了各检测方法的敏感性和特异性,并用临床样本进一步比较了各种方法检测结果的吻合性。结果表明,4种方法检测的灵敏度基本一致,当布病阳性血清标准品按1∶20稀释（即50 IU·mL^-1）时均检测为阳性,1∶40稀释（即25 IU·mL^-1）时均检测为阴性。FPA、cELISA、iELISA和mCFT方法的敏感性分别为97.14%、100.00%、100.00%、98.57%,特异性分别为96.34%、95.12%、97.56%、100.00%。对315份临床样本的检测结果显示,各方法之间的符合率均高于90.00%,其中iELISA、FPA、cELISA与mCFT符合率分别为97.14%、96.83%、92.70%;FPA、cELISA与iELISA符合率分别为95.24%、93.65%;FPA与cELISA符合率为91.43%。iELISA、FPA、mCFT 3种方法之间吻合性最高,cELISA与其他3种方法之间的吻合性略低。     

非洲猪瘟病毒p54蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA方法的建立

旨在建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)血清抗体的阻断ELISA方法.采用原核表达的ASFVp54蛋白作为包被抗原,并制备了针对p54蛋白的单克隆抗体,采用方阵滴定法确定了阻断ELISA方法的最佳反应条件,并对建立的方法进行了敏感性、特异性、重复性和符合性评价.结果显示,抗原最佳包被浓度为2.0 μg·mL-1,抗原包被温...     

副猪嗜血杆菌抗体间接ELISA检测方法的建立与应用

本试验采用121 ℃高压处理副猪嗜血杆菌4型和5型耐热蛋白,混合作为包被抗原,建立了检测副猪嗜血杆菌抗体的间接ELISA方法。通过对试验条件进行筛选优化,确定了最佳反应条件:抗原包被浓度为10 μg/mL,37 ℃包被2 h;封闭液选择含20 g/L脱脂奶粉的PBST,封闭30 min;血清的稀释度为1∶80;抗原抗体反应时间为45 min;酶标二抗稀释度为1∶12000,作用时间为30 min;底物显色时间为15 min。特异性、重复性和敏感性试验及对200份送检血清的检测结果表明,建立的间接ELISA方法特异性和重复性良好,敏感性比间接血凝试验高,对已知阴阳性血清的临床样本检测结果与国外ELISA试剂盒一致,可用于副猪嗜血杆菌的血清抗体检测和血清流行病学调查。     

传染性支气管炎病毒抗体间接ELISA检测方法的建立

为了快速检测针对传染性支气管炎病毒(IBV)抗体,本研究建立相应的间接ELISA(iELISA)检测方法。以本实验室分离的临床毒株DS10为检测抗原,经过差速离心纯化获得DS10病毒作为包被抗原,利用方阵试验,优化一系列条件,最终确定了最佳的ELISA反应条件。抗原最佳包被浓度为0.11mg/mL,血清最适稀释度为1:100,封闭液为含1%BSA的PBST,封闭时间为60min,一抗作用时间90min,HRP标记的兔抗鸡IgG稀释倍数为1:3500,作用时间为60min,显色时间为10min。用iELISA方法和血凝抑制试验(HI)同时检测145份血清样品的结果表明,建立的iELISA方法与常规的HI检测的符合率为92.41%,iELISA和HI的阳性检出率分别为92.41%和90.34%,iELISA的敏感性略优于HI。     

REV重组env蛋白间接ELISA诊断试剂盒的研制

以纯化的env蛋白为包被抗原,建立了检测REV抗体的间接ELISA（ienv-ELISA）方法。ienv-ELISA工作条件优化结果表明,最佳包被液为CB;最佳封闭液浓度为1%BSA-PBS;最佳抗原包被量为8μg/mL;血清最佳稀释度为1∶300;血清最佳作用时间为1 h;二抗的最佳稀释度为1∶5000;二抗最佳作用时间为1 h;底物最佳显色时间为25 min。重复性试验、特异性试验和对比试验结果显示,建立的ienv-ELISA方法有良好的可重复性,标准差均小于15%;与鸡MDV、ALV、NDV、H5N1、H9N1等病毒阳性抗体均无交叉反应;与REV抗体检测试剂盒（以REV全病毒为包被抗原）对比,所建立的ienv-ELISA诊断敏感性、诊断特异性以及准确率分别为90.625%9、3.75%和92.7%。     

小反刍兽疫病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与初步应用

本研究利用原核表达的小反刍兽疫病毒核衣壳（N）蛋白作为标准抗原蛋白,建立PPRV抗体检测方法,同时对建立的检测方法的相关条件进行了优化。通过优化确定抗原的最佳包被浓度为10 mg/L,血清最佳稀释度为1∶40,二抗的使用浓度为1∶200,血清及二抗的最佳反应条件为37 ℃孵育60 min,底物的最佳反应时间为37 ℃ 15 min。通过批内及批间重复性的评价,变异系数均小于0.1,表明本检测方法具有较高的可重复性。经过临床样品检测证明,建立的检测方法可用于临床PPRV抗体的检测。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白ELISA检测方法的建立及初步应用

将杆状病毒表达系统表达并经梯度离心纯化的PCV2Cap蛋白作为标准品,利用双抗夹心法建立了针对猪圆环病毒2型Cap蛋白的ELISA检测方法,并应用于圆环病毒2型基因工程疫苗的质控。结果表明,多抗最适包被浓度为1μg/mL,最佳封闭液为1％BSA,最佳单抗反应浓度为2μg／mL,反应时间60min,最佳二抗使用稀释度1：40000,反应时间60min。该方法与St9细胞、BSA和其他猪病病毒抗原之间无交叉反应,最低检测抗原量为5ng。