不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期和增殖的影响

为了研究不同浓度GnIH对鸭颗粒细胞周期、增殖及相关基因表达的影响。本研究分别用不同浓度GnIH(0、0.1、1、10和100 ng·mL~(-1))处理体外培养的鸭颗粒细胞24 h(n=3),观察细胞的生长状态,通过流式细胞术和EdU方法检测细胞周期和细胞增殖,并用qRT-PCR方法检测增殖相关基因CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)的表达。结果显示,各浓度GnIH处理组的细胞生长状态良好,形态正常,细胞轮廓清晰,组间死亡细胞数差异不显著(P0.05);在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,细胞周期阻滞在G2期的比例显著上升(P0.05);随着GnIH处理浓度的增加,EdU阳性细胞数所占的百分比降低;在0.1和1 ng·mL~(-1) GnIH处理组,颗粒细胞中CDK6、CyclinD1、IGF-2、IGFBP-2、p27~(kip1)基因的相对表达量均下降,在10和100 ng·mL~(-1) GnIH处理组中这些基因的相对表达量则有所上升。研究表明,在体外培养的鸭颗粒细胞中,GnIH能使细胞周期阻滞在G2期,并降低EdU阳性细胞所占百分比和下调增殖相关基因的表达水平,从而抑制颗粒细胞增殖来影响动物繁殖性能。     

GnIH对雄性SD大鼠肝脏脂代谢的影响及机制研究

为探讨促性腺激素抑制激素(GnIH)对雄性SD大鼠肝脏脂代谢的影响,以不同浓度的GnIH(0、1和10μg/100μL,总体积200μL,溶解于生理盐水中)早晚2次定点给SD大鼠腹腔注射。持续注射6周后,观察记录GnIH对雄性SD大鼠的表观影响,并进一步检测血液生化指标、肝脏脂代谢相关蛋白表达以及腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信号通路的影响。结果表明：与对照组相比,腹腔注射不同浓度的GnIH均可导致雄性SD大鼠采食量显著增多(P<0.05),平均日增重显著加快(P<0.05),Lee指数显著增加(P<0.05),血液中甘油三酯浓度显著升高(P<0.05),而高密度脂蛋白极显著下降(P<0.01)。进一步研究发现,腹腔注射不同浓度的GnIH均可使肝脏中脂肪酸合成酶(FASN)蛋白表达显著升高(P<0.05),而激素敏感脂肪酶(HSL)蛋白表达显著降低(P<0.05),脂联素(ADPN)和过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)蛋白表达均极显著降低(P<0.01),CAAT区/增强子结合蛋白(C/EBP)表达极显著升高(P<0.01)...     

鹅不同繁殖时期GnRH和GnIH基因表达和激素浓度变化分析

旨在研究GnRH和GnIH基因和激素在鹅繁殖过程中的重要作用,本研究以产蛋性能差异显著的四川白鹅和溆浦鹅为试验材料,利用Real-time RCR方法检测产蛋前期、产蛋期和休产期两种鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中GnRH和GnIH mRNA的表达量;利用放射性免疫和酶联免疫吸附测定法测定血清中的GnRH和GnIH激素变化情况。结果表明:GnRH和GnIH基因在四川白鹅和溆浦鹅的下丘脑、垂体和卵巢组织中均有表达;产蛋前期和产蛋高峰期的下丘脑和卵巢组织中,四川白鹅的GnRH mRNA表达量显著(P0.05)或极显著(P0.01)高于溆浦鹅,在产蛋高峰期和休产期四川白鹅GnRH激素浓度也极显著(P0.01)或显著高于(P0.05)溆浦鹅,在高峰期和休产期四川白鹅GnRH血清浓度分别为51.13和51.10pg·mL-1,溆浦鹅分别为49.52和49.94pg·mL-1;GnIH在两种鹅的变化比较一致,仅在产蛋高峰期,四川白鹅下丘脑组织中GnIH mRNA表达水平极显著低于(P0.01)溆浦鹅,而两种鹅之间的GnIH激素在各个时期均无显著差异。这提示随着繁殖阶段的改变,在调控两种鹅产蛋性能的作用过程中GnRH可能较GnIH发挥着更为重要的作用,为进一步研究鹅繁殖分子机制奠定基础。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P0.01);细胞增殖受到显著抑制(P0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

RNA干扰水牛MTPN基因对颗粒细胞增殖、凋亡及激素分泌的影响

本研究旨在探讨敲低MTPN基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖、凋亡及雌激素、孕酮分泌的影响。应用RNAi技术敲低颗粒细胞中MTPN基因的表达水平,通过实时荧光定量PCR方法检测体外培养水牛颗粒细胞中MTPN基因及增殖和周期相关基因的表达情况,CCK-8法检测细胞增殖,借助流式细胞仪检测细胞周期的分布,采用ELISA试剂盒检测细胞培养液中雌激素与孕酮含量。结果显示,经siRNA(si-MTPN)转染颗粒细胞后,MTPN基因相对表达量下降60%(P<0.01);细胞增殖受到显著抑制(P<0.05),G1期细胞数量下降,S期细胞数量上升,G2期细胞数量极显著上升(P<0.01),细胞被阻滞在G2期;增殖与周期相关基因Cyclin D2、Cytochrom C表达量显著上升(P<0.05),Caspase9、Fas基因表达量极显著上升(P<0.01);ELISA检测雌激素和孕酮分泌水平均显著下降(P<0.05)。综上表明,敲低MTPN基因能通过调控相关基因的表达抑制体外培养水牛颗粒细胞的增殖及雌激素、孕酮的分泌水平,为阐明MTPN基因参与家畜卵泡发生的分子机制提供参考。     

神经生长因子对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响

本研究旨在探索神经生长因子(nerve growth factor,NGF)对小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。试验建立了小鼠卵巢颗粒细胞的原代培养体系,并通过免疫荧光技术对颗粒细胞进行鉴定和检测NGF及其受体在卵巢颗粒细胞上的表达,采用MTS法检测不同浓度的NGF对昆明小鼠卵巢颗粒细胞增殖的影响。卵巢颗粒细胞在10、50、100、500 ng/mL NGF作用24 h,用酶标仪测定细胞D_{490 nm}值,试验组与对照组相比均有促进增殖的影响（P<0.05）,50 ng/mL NGF试验组与对照组相比差异极显著（P<0.01）。结果表明,NGF在昆明小鼠的卵巢颗粒细胞中有表达,在一定浓度范围NGF可以促进卵巢颗粒细胞的增殖。     

GnIH基因克隆、表达及对幼龄公兔生殖激素的影响

旨在获得兔促性腺激素抑制素(gonadotropin-inhibitory hormone,GnIH)基因，检测其在不同组织和不同发育阶段下丘脑中的表达水平，研究其对幼龄公兔生殖激素分泌的影响。本研究以90日龄健康闽西南黑兔公兔为研究对象，采用RACE技术(rapid-amplification of cDNA ends)从下丘脑组织中克隆出GnIH基因，并对序列进行生物信息学分析；采用实时荧光定量PCR方法(real-time quantitative PCR,qPCR)检测GnIH基因mRNA在90日龄公兔不同组织表达水平(n=5)及11、30、60、90、120、150日龄公兔下丘脑中的表达水平(n=6);连续10 d向80日龄公兔分别注射0、0.5、5和50μg鹌鹑GnIH相关肽(n=10)。第11天早上采集耳静脉血液后，屠宰公兔，采集睾丸组织，分别检测血清中生殖激素浓度(GnRH、FSH、LH、INHB和T)和睾丸组织中睾酮合成相关酶基因(StarR、3β-HSD和p450scc)mRNA的表达水平。结果表明，兔GnIH基因cDNA全长904 bp,包含5′UTR 41 bp...     

鸡源REV对HBK-SPF雏鸭的感染试验

为研究鸡源网状内皮组织增殖病病毒(REV)对HBK无特定病原体(SPF)鸭的致病性,利用鸡源REV现地分离株REV-HN,分别接种鸭胚成纤维细胞(DEF)、鸭胚(尿囊腔和卵黄囊腔接种)和雏鸭(口腔接种),试验设空白对照组,雏鸭还设有同居感染组.接种REV后不同时间收获DEF和胚体,及雏鸭的外周血淋巴细胞(PBL)和免疫器官,提取基因组DNA,通过RT-PCR和PCR方法检测REV前病毒env基因.结果在DEF中未检测到特异性的env基因片段,而在卵黄囊接种后72 h鸭胚胚体和试验感染的雏鸭PBL中检测到.接种后30 d,在1羽感染REV的雏鸭肾、胸腺和法氏囊中检测到REV前病毒.本研究为利用SPF鸭研究REV提供了依据.     

原花青素对玉米赤霉烯酮诱导牦牛颗粒细胞氧化损伤的保护作用研究

旨在探究原花青素（procyanidins,PC）在玉米赤霉烯酮（zearalenone,ZEA）诱导牦牛颗粒细胞产生氧化损伤后,对颗粒细胞生长增殖、抗氧化性以及激素分泌的影响。本试验选取3～5岁的健康牦牛（n=3）,完成卵巢颗粒细胞的分离培养,并通过免疫荧光染色鉴定颗粒细胞纯度。通过CCK-8法分别比较不同浓度ZEA （0（对照组）、5、10、20、40、60、80和100 μmol·mL^-1）、不同浓度PC （0（对照组）、0.05、0.5、2.5、5、10、50和100 μg·mL^-1）以及50 μmol·mL^-1 ZEA+5 μg·mL^-1 PC联合处理对牦牛颗粒细胞活性的影响。通过ELISA法检测对照组（未添加ZEA及PC）、50 μmol·mL^-1 ZEA组和50 μmol·mL^-1ZEA+5 μg·mL^-1PC联合处理组牦牛颗粒细胞活性氧（reactive oxygen species,ROS）以及雌二醇（E₂）水平。采用实时荧光定量PCR法检测不同组颗粒细胞中部分增殖生长、凋亡、抗氧化及E₂合成相关基因的表达水平。结果显示,本研究所分离培养得到的细胞表达颗粒细胞标志蛋白FSHR,具有较高的纯度,可以满足后续试验要求。添加不同浓度ZEA后,颗粒细胞活力随着ZEA浓度的升高而显著降低（P<0.05）。在一定浓度范围内（0~5 μg·mL^-1）,随着浓度的上升,PC对颗粒细胞的活力有显著提高作用（P<0.05）,且在浓度为5 μg·mL^-1时对细胞活力的提高作用最明显。与ZEA处理组相比,ZEA与PC联合处理后颗粒细胞的数量增加且细胞活力极显著提高（P<0.05）,颗粒细胞增殖生长相关基因PCNA和IGF-Ⅱ 以及抗凋亡相关基因XIAP和BCL-2的表达显著上调（P<0.05）。相反,促凋亡相关基因BAX和CASP3的表达显著下调（P<0.05）。同时,ZEA+PC联合处理后能显著降低牦牛颗粒细胞活性氧水平并促进颗粒细胞分泌E₂（P<0.05）,颗粒细胞中的抗氧化相关基因SOD2、GPX1及CAT和E₂合成相关基因STAR、CYP11A1及HSD3B的表达量显著上调（P<0.05）。上述结果表明,PC可提高经ZEA处理后颗粒细胞的生长增殖能力,上调颗粒细胞的活力,提高抗氧化能力,降低ROS水平以及提高E₂的分泌水平。综上所述,PC对ZEA诱导的牦牛颗粒细胞氧化损伤有一定保护作用。本研究为ZEA毒性的防治和畜牧业生产中PC的应用提供了一定的研究数据和理论支持。     

水牛BMP1基因对颗粒细胞增殖与凋亡的功能研究

本研究旨在探讨BMP1基因对体外培养水牛颗粒细胞增殖与凋亡的影响,采用qRT-PCR检测体外培养0、24、48、72和96h水牛颗粒细胞中BMP1基因的表达规律,通过在水牛颗粒细胞培养液中添加BMP1基因重组蛋白和抗BMP1抗体,观察其对体外培养水牛颗粒细胞增殖变化的影响,并应用qRT-PCR和Western blotting方法检测与细胞增殖和细胞凋亡相关因子表达的变化规律。结果显示,随着颗粒细胞体外培养时间的延长,BMP1基因的相对表达量显著上调(P0.05),96h培养组BMP1表达最高。添加BMP1重组蛋白可显著促进水牛颗粒细胞的体外增殖(P0.05),并能够显著上调细胞周期关键蛋白Cyclin D1、Cyclin D2和PCNA mRNA表达水平(P0.05),同时显著抑制了细胞凋亡信号通路中促凋亡相关因子(Fas、FasL、TNFR1、TNF-α、Cytochrome C、Apaf1、Chop、Caspase-3、Caspase-8和Caspase-9)mRNA表达(P0.05)。Western blotting检测结果表明,BMP1重组蛋白能够抑制Fas、Bax和Caspase-9蛋白表达,蛋白与mRNA表达一致。而添加抗BMP1抗体的试验则得出相反的结果。综上表明,BMP1基因能通过调控相关基因的表达促进体外培养水牛颗粒细胞的增殖并抑制其凋亡,在水牛卵泡发生过程中具有重要的调控功能,为阐明BMP1基因参与家畜卵泡发生的分子机制奠定基础。     

采用dCas9-SunTag-DNMT3A技术调控玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平

旨在探究dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统对玻璃化冷冻牛卵母细胞IVF囊胚中IGF2R基因甲基化水平及胚胎发育能力的影响,为冷冻卵母细胞/胚胎特定位点DNA甲基化的精确调控奠定基础。本研究将经过体外成熟的牛卵母细胞进行玻璃化冷冻,随后进行体外受精,将受精所得到的原核胚进行dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统的注射,统计并计算卵母细胞的发育情况;通过亚硫酸盐测序的方式检测IGF2R基因启动子的甲基化水平,并利用荧光定量PCR检测IGF2R及相关基因的表达水平。与冷冻组相比,注射不同浓度的dCas9-SunTag-DNMT3A编辑系统后,只有40 ng·μL^-1组显著地提高了玻璃化冷冻卵母细胞IVF后的发育能力(P＜0.05),20和60 ng·μL^-1组间差异不显著(P＞0.05),但40 ng·μL^-1组发育效果仍然显著低于新鲜对照组(P＜0.05);对检测冷冻组、新鲜组、40 ng·μL^-1组IGF2R基因启动子甲基化水平分析发现,40 ng·μL^-1组水平与新鲜组相似,显著高于冷冻组(P＜0.05);荧光定量试验结果显示,40 ng·μL^-1组IGF2R基因mRNA表达水平相较于冷冻组显著降低(P＜0.05),与新鲜组相似。注射40 ng·μL^-1的dCas9-SunTag-DNMT3A甲基化编辑系统能够通过有效升高IGF2R基因启动子甲基化水平(P＜0.05)及显著降低其mRNA表达水平(P＜0.05),来正向调节玻璃化冷冻卵母细胞IVF胚胎的发育情况,提高胚胎发育能力,使得其卵裂率和囊胚率都得到显著提高(P＜0.05),同时促进胚胎发育相关基因的表达。     

脱氧雪腐烯醇(DON)对牛卵母细胞体外成熟及发育能力的影响

本试验旨在探究脱氧雪腐烯醇（DON）对牛卵母细胞体外成熟发育的影响及其作用机制。将牛卵丘卵母细胞复合体分别在含DON浓度为0、50、250、500、1 000 ng·mL^-1的体外成熟培养液中进行体外成熟,检测卵丘细胞扩展程度及第一极体排出率,构建DON毒性模型。然后,借助此模型研究DON对卵母细胞的线粒体分布及后续受精卵裂率、囊胚发育率的影响,探究DON对牛卵母细胞体外成熟及后续发育能力的影响;通过检测体外成熟卵母细胞内的氧化相关因子（ROS、GSH）水平和抗氧化基因CAT、GPx4的mRNA表达量,揭示DON影响牛卵母细胞体外发育能力的分子机制。结果表明,250、500 ng·mL^-1的DON显著抑制卵母细胞的第一极体排出（P<0.05）,1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制第一极体排出（P<0.01）; 250 ng·mL^-1的DON显著抑制卵丘卵母细胞扩展（P<0.05）,500、1 000 ng·mL^-1的DON极显著抑制卵丘细胞扩展（P<0.01）;后续试验选取DON浓度为500 ng·mL^-1作为毒性模型（DON组）,与不含DON组（对照组）进行比较研究,结果发现,对照组与DON组的线粒体均匀分布比例（60.2%vs.40.0%）存在显著差异（P<0.05）;试验组较对照组的受精卵裂率（33.6±3.6%vs.（67.7±2.6）%）及早期囊胚率（（0.0±0.0）%vs.（18.3±2.2）%）均显著降低（P<0.05）;试验组较对照组,卵母细胞内ROS水平（1.6 vs.1.0）显著升高（P<0.05）,GSH相对水平（0.4 vs.1.0）显著降低（P<0.05）,抗氧化基因CAT与GPx4的mRNA相对表达量（0.0 vs.1.0;0.6 vs.1.0）显著降低（P<0.05）。以上研究表明,DON对卵母细胞的体外成熟及早期胚胎发育具有抑制作用,其作用机制与DON破坏牛卵母细胞内抗氧化系统平衡相关。     

海兰褐蛋鸡ZP3基因结构及其在卵泡中表达规律分析

旨在探讨ZP3基因在海兰褐蛋鸡中的表达特性，为后期研究ZP3基因在蛋鸡卵泡发育中的作用提供理论支撑。本研究以产蛋期50周龄（50 W）海兰褐蛋鸡为试验对象，利用RACE技术克隆ZP3基因全长，并对编码区进行生物信息学分析。选择健康、体重相近的海兰褐蛋鸡6只，分别取心、肝、肺、肾、卵巢、胸肌、腿肌和不同等级卵泡构建表达谱。卵巢颗粒细胞经不同浓度（PBS、5 ng·mL^-1、10 ng·mL^-1、20 ng·mL^-1）促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）处理后，提取总RNA，采用实时荧光定量检测ZP3基因在各个样品的表达水平。结果表明，鸡ZP3基因全长1 415 bp，其中编码区1 341 bp，共编码446个氨基酸，位于10号染色体上，包含9个外显子；其亲缘关系与猪最远；跨膜结构预测表示，其含有一个跨膜结构域和一个信号肽区域；对其亲疏水性进行分析，预测该蛋白为弱的疏水性蛋白，蛋白质结构主要由无规则卷曲构成。组织表达谱显示，ZP3基因在鸡的卵巢中相对表达量最高。各等级卵泡ZP3表达分析显示，随着卵泡发育，ZP3基因在成熟卵泡（F1）颗粒细胞层表达量最高；在使用FSH处理等级颗粒细胞后，发现ZP3表达量显著上调（P<0.05），暗示ZP3基因在颗粒细胞中受到FSH激素调节。本试验对ZP3基因的结构进行了分析并预测该基因存在跨膜结构和信号肽区域。基因表达谱分析结果显示，ZP3基因在卵泡发育过程中表达量逐渐升高且主要在颗粒细胞中表达，可能受到FSH的调节作用，因此预测，ZP3基因可能与海兰褐蛋鸡繁殖功能相关。     

绵羊miR-200b对卵泡颗粒细胞周期和凋亡的影响

旨在揭示miR-200b在绵羊卵泡颗粒细胞的作用。本研究利用在线工具（TargetScan、miRTarBase及miRDB）预测miR-200b的靶基因,并利用KOBAS对其进行GO和KEGG通路富集分析。将分离培养的绵羊卵泡颗粒细胞分为4组,分别转染miR-200b mimic、mimic NC、miR-200b inhibitor和inhibitor NC,每组6个重复。采用CCK8法分别检测转染24、48和72 h颗粒细胞的存活率;采用荧光定量PCR检测miR-200b、CDK4、CDK6、CCND1、CCND2、Bax和Bcl-2基因的表达水平。利用3种在线工具预测到25个miR-200b的共同靶基因,GO和KEGG通路富集分析发现这些基因富集在细胞的增殖分化、细胞周期及生殖发育过程;转染miR-200b mimic、miR-200b inhibitor和NC后,颗粒细胞存活率随时间延长呈“V”型趋势降低,且48 h达最低（P<0.01）;miR-200b inhibitor与inhibitor NC组相比,miR-200b表达量无显著差异（P>0.05）;与mimic NC相比,miR-200b mimic组极显著促进miR-200b表达（P<0.001）,显著下调CDK4（P<0.01）、CDK6（P<0.001）和CCND1（P<0.001）、CCND2（P<0.05）和Bcl-2（P<0.01）基因表达水平,Bax表达并无显著变化（P>0.05）,且极显著下调Bcl-2与Bax比值（P<0.001）。综上所述,miR-200b抑制绵羊卵泡颗粒细胞细胞周期和增殖并促进其凋亡。     

旋毛虫重组二肽基肽酶1在体外对大鼠外周血单个核细胞增殖、吞噬、凋亡等的影响

本文旨在分析旋毛虫二肽基肽酶1（dipeptidyl-peptidase 1，Dpp1）在体外对大鼠外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）增殖、迁移、凋亡以及一氧化氮（NO）分泌和吞噬功能的影响。根据GenBank中旋毛虫Dpp1基因序列设计一对特异性引物，RT-PCR获得该基因，将其亚克隆到pET-32a原核表达载体，IPTG诱导后获得重组蛋白rDpp1。将大鼠PBMCs与rDpp1共孵育，用间接免疫荧光试验（IFA）分析rDpp1与大鼠PBMCs的结合情况，分析不同质量浓度（10、20、40 μg·mL^-1）的rDpp1对细胞增殖、迁移、NO分泌、吞噬功能和细胞凋亡的影响。结果表明，40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs增殖；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs迁移，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；20与40 μg·mL^-1rDpp1极显著促进PBMCs分泌NO；10 μg·mL^-1rDpp1能显著促进PBMCs的吞噬功能，而20及40 μg·mL^-1时表现极显著的促进；各质量浓度蛋白均极显著地促进PBMCs的凋亡。旋毛虫二肽基肽酶1在体外能通过多种途径影响大鼠外周血单个核细胞，对调节宿主免疫应答有一定的促进作用。     

可变剪接体WNT4-β对山羊卵泡颗粒细胞增殖和激素分泌的影响

旨在研究WNT4的一个可变剪接体（WNT4-β）对山羊卵泡颗粒细胞增殖的影响。本研究选取4~6月龄健康母羊20只,采集双侧卵巢,体外分离卵泡颗粒细胞进行培养。通过免疫荧光染色技术确定WNT4-β的表达位置;在山羊颗粒细胞中过表达或干扰WNT4-β后,利用RT-qPCR、Western blot检测WNT4-β和WNT信号通路中关键标记因子ROA1、RHOA及颗粒细胞增殖标记基因cyclin-D2、CDK4的表达变化;CCK-8技术检测颗粒细胞增殖情况;并通过ELISA分析颗粒细胞中生殖激素水平的变化。免疫荧光染色结果显示,WNT4-β只在山羊卵泡颗粒细胞中表达,在卵母细胞不表达;过表达WNT4-β后,WNT4-β和颗粒细胞增殖因子cyclin-D2、CDK4的mRNA相对表达量极显著增加（P<0.01）,蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;WNT信号通路标记因子ROA1、RHOA mRNA表达水平显著增加（P<0.05）,β-catenin蛋白表达水平显著增加（P<0.05）;干扰WNT4-β后,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4、ROA1和RHOA 的mRNA表达显著降低（P<0.05）,WNT4-β、cyclin-D2、CDK4及β-catenin蛋白表达显著降低（P<0.05）。CCK-8结果显示,过表达WNT4-β促进颗粒细胞增殖（P<0.05）;ELISA结果显示,过表达WNT4-β后,颗粒细胞中雌二醇（estradiol,E₂）水平显著增加（P<0.05）,孕酮（progesterone,P₄）水平升高但不显著（P>0.05）;干扰WNT4-β后则结果相反,颗粒细胞增殖受到抑制（P<0.05）,E₂和P₄的水平显著降低（P<0.05）。综上所述,WNT4可变剪接体WNT4-β通过调控WNT信号通路促进山羊卵泡颗粒细胞增殖及类固醇激素分泌,本研究为解析WNT4调控山羊颗粒细胞增殖的潜在分子机制提供理论基础。     

兔原始生殖细胞体外培养的研究

旨在探索兔原始生殖细胞（primordial germ cells,PGCs）体外分离培养的最佳条件,从而建立成熟稳定的兔PGCs体外分离培养方法。本研究首先通过两种不同的体外分离法（胰酶消化法、机械法）和3种不同的传代法（胰酶消化法、机械法、连同饲养层消化法）探索第14~18天胎兔的PGCs体外分离传代的最佳方式,另将培养液分为A、B、C、D 4组,以D组为对照组,探究不同细胞因子浓度对兔PGCs形态变化及集落形成的影响。其次,利用碱性磷酸酶染色（alkaline phosphatase staining,AKP）法对兔PGCs进行鉴定染色;实时荧光定量（real-time polymerase chain reaction,RT-PCR）检测转录因子Oct-4的表达。结果表明,机械法分离得到的兔PGCs集落数量是酶消化法分离的2.2倍,而兔PGCs经不同的消化法传代发现,酶消化法、连同饲养层消化法、机械法在兔胚胎成纤维细胞（rabbit embryo fibroblast,REF）饲养层上分别成功传至P2、P2、P4代。B组PGCs培养液（基础液+10%胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）+2 ng·mL^-1转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1,TGF-β1）+4 ng·mL^-1碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）+10 ng·mL^-1白血病抑制因子（leukemia inhibitory factor,LIF））所获得的集落数量最多,具有较好的集落形态,保持未分化的时间较长。AKP染色结果显示,PGCs集落呈红黑色; RT-PCR结果显示,体外分离培养的兔PGCs表达转录因子Oct-4。结果显示,兔原代PGCs最适采用机械分离法和机械传代法进行体外分离传代,适宜浓度的细胞因子添加至兔PGCs培养液中有利于兔PGCs在体外保持较多的集落数量和较长时间的未分化状态。本研究通过筛选和优化兔PGCs体外培养方法,为进一步建立稳定成熟兔PGCs细胞系奠定技术基础。     

盐酸多西环素片在羔羊体内残留消除规律及休药期分析

旨在确定盐酸多西环素片按照给药说明给药后在羔羊体内的残留消除规律及休药期。将盐酸多西环素片根据体重以5 mg·kg^-1内服给药,间隔24 h,连续给药5次。在最后1次给药后,分别在第0（12小时）、1、2、3、5、7和9天时间点采集羔羊脂肪、肌肉、肝和肾,采用建立并验证的HPLC-VWD方法测定组织中多西环素的含量。结果显示：方法学考察结果表明,在50~5 000 ng·mL^-1添加的线性方程和相关系数为y=0.044x-0.414,R²=0.999。试验结果表明,多西环素在羔羊组织中代谢快速,最后1次给药后第9天,在肌肉、肝、肾和脂肪中均未检测到多西环素。本试验以5 mg·kg^-1体重内服给予羔羊盐酸多西环素片后,根据欧洲药品评估机构法规《EMEA/CVMP/036/95》,建议盐酸多西环素片在羔羊组织中的休药期为2 d。