小麦纹枯病菌Rc-RPA-LFD快速检测方法的建立及应用

正近年来,随着气候条件、耕作制度的变化和水肥条件的改善,小麦纹枯病在我国危害日趋严重,现已成为长江中下游麦区和黄淮麦区主要病害,每年造成严重经济损失[1]。小麦纹枯病常与小麦根茎部病害如根腐病、茎基腐病混合发生,发病早期症状相似,影响病害的早期诊断和防治。目前,小麦纹枯病菌快速检测方法主要基于常规PCR和Real-time PCR [3,4]。常规PCR和Real-time PCR具备检测准确、灵敏度高的优点,但这两种检测技术对仪器设备和     

禾谷丝核菌基因组SSR标记的开发及评价

群体遗传学研究对于了解病原菌的流行、变异及进化规律具有重要意义。但是到目前为止,对小麦纹枯病菌禾谷丝核菌群体遗传结构的了解并不深入,缺乏有效的SSR标记是主要原因。本研究根据禾谷丝核菌全基因组序列进行了微卫星位点搜索并设计SSR引物,通过电泳筛选和测序验证,最终筛选出12个多态性较好且稳定可靠的SSR标记。利用这些标记对收集自我国安徽、江苏、河南三省的23个禾谷丝核菌菌株进行了多态性分析,结果发现禾谷丝核菌基因组中长片段微卫星位点较少。12对引物扩增出的等位基因数平均为6.1个,期望杂合度平均为0.651,观测杂合度平均为0.508,表明这些标记具有较高的多态性,能够满足禾谷丝核菌群体遗传学研究需要。本研究为进一步进行禾谷丝核菌的多样性、群体遗传结构分析及进化学研究提供了有效工具。     

河南省小麦纹枯病菌及小麦全蚀病菌对丙环唑的敏感性

正小麦纹枯病和小麦全蚀病是河南省小麦生产上重要的土传病害,发病面积分别在300万和30万hm~2~([1,2])。近年来,由于小麦高产栽培措施(早播、密植、高肥)的推广,以及气候条件适宜、农机跨区作业等原因,两种病害的发生面积日益增大,     

三唑酮、三唑醇对小麦纹枯病菌形态和生理的影响

 小麦纹枯病菌(Rhizoctonia cerealis)在加入三唑酮(Triadimefon)或三唑醇(Triadimenol)的培养液中生长时,菌丝形态和生理发生明显的改变。菌丝畸形,表现为细胞肿大,细胞分隔处菌丝缢缩;药剂处理后,等量菌丝的麦角甾醇含量下降,1、5μg/ml的三唑酮和三唑醇处理,麦角甾醇含量比对照减少45.155.9%和27.5、48.9%;菌丝在药剂处理后,电解质渗漏增加,5μg/ml药剂处理一小时后,三唑酮组的菌丝之细胞电解质渗漏达2.58%,三唑醇组的渗漏为2.19%,空白对照组仅为0.65%。本研究结果表明,三唑酮、三唑醇对小麦纹枯病菌具有直接的伤害作用。     

江苏大麦纹枯病菌的种类、分布及致病性的研究

 从江苏11个地区采集的大麦纹枯病病株上分离到92个丝核菌分离物,经菌丝融合测试,分别属于禾谷丝核菌的CAG1、CAG4、CAG5、AGC1、AGE,以及立枯丝核菌的AG1-IA,AG1-IC、AG2-1和AG5等9个不同的菌丝融合群,各群分离物数依次为76(82、6%)、1、2、4、2、1、1、2和3个。它们在感病大麦品种LEGIA和中抗品种CI3906。1上的致病性反应表明:不同丝核菌种间、不同丝核菌的融合群间、来自不同地区及来自同一品种上的菌株间,其致病性差异达到极显著水平;而同种丝核菌不同融合群间和不同品种间的菌株致病力虽有差异,但不明显;总的来讲,禾谷丝核菌的CAG1群菌株致病力最强,且分布广泛,其它各群致病力由强到弱的排列顺序为:AG5、AG1-1A、AGE、AGC1、CAG4、AG1-1C、CAG5和AG2-1。     

基于Ypt1靶标的大豆疫霉环介导等温扩增技术的研究

大豆疫霉侵染大豆引起的根腐病是大豆生产上的毁灭性病害之一。本研究以Ypt1基因作为靶标,利用环介导等温扩增(LAMP)技术,设计了特异性检测体系,整个过程仅需60 min,即可通过肉眼直接目测检测结果。反应后经浊度仪验证浊度变化、琼脂糖凝胶进行电泳验证和在扩增前加入染料HNB(羟基蔡酚蓝)作为反应指示剂验证扩增结果。特异性检测中,111个大豆疫霉菌株均能产生浊度曲线和扩增到梯形状的条带,同时HNB显色观察到天蓝色的阳性反应,而其它疫霉、腐霉和真菌供试菌株中均没有观察到这些现象;在灵敏度检测中,PsYpt1-LAMP技术最低检测限达到100 pg·μL~(-1),比普通PCR技术的最低检测限高出10倍;在田间应用方面,PsYpt1-LAMP检测技术明显提高了检测效率。本研究建立的LAMP检测体系可用于口岸和田间对大豆疫霉的快速检测。     

喷雾诱导沉默CYP51和Sdh基因对禾谷丝核菌生长和致病性的影响

由于缺少稳定的遗传转化体系,丝核菌致病相关基因的功能研究受到严重限制。本研究以防治丝核菌病害的常用杀菌剂靶标基因CYP51和Sdh为目标基因,体外合成禾谷丝核菌CYP51的3个同源基因以及Sdh的B、C、D亚基基因的dsRNA,采用喷雾诱导基因沉默(spray-induced gene silencing, SIGS)方法研究这6个基因产生的dsRNA对病菌生长和致病性的影响。结果表明,外源施加靶标基因dsRNA对禾谷丝核菌的生长和致病性均有抑制作用。在被侵染的大麦叶片上,外源dsRNA能够显著抑制病菌中对应基因的表达。100 ng·μL^-1浓度的RcCYP51-3-dsRNA在大麦叶片上抑菌效果较为显著,且可以同时抑制3个RcCYP51同源基因的表达;RcSdhD-dsRNA同样可以抑制RcSdh三个亚基的基因表达,在50 ng·μL^-1浓度时抑菌效果最好。本研究探索了一种抑制禾谷丝核菌基因表达的方法,为使用SIGS方法研究丝核菌基因功能打下基础。     

甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法的建立

 甘蔗宿根矮化病是由Leifsonia xyli subsp. xyli (Lxx)引起的一种世界性甘蔗细菌病害。根据Lxx的Pat1基因保守序列,设计并合成了一对特异性引物Pat1F (5′-GGTTCCATTGCTTACCGATT-3′)/Pat1R(5′-CAAGTTTCGACAGGAACAGC-3′),和一条TaqMan探针(FAM-5′-CCACGGCTACGTCAATTCGGG-3′-TAMRA),建立了一种特异性强、灵敏度高的甘蔗宿根矮化病菌实时荧光定量PCR检测方法。结果表明,本研究建立的实时荧光定量PCR方法,对Lxx的检测最低下限为10² copies·μL^-1。应用实时荧光定量PCR与常规PCR方法对14个甘蔗品种进行Lxx检测,阳性检出率分别为86%和43%,表明实时荧光定量PCR比常规PCR检测方法具有更高的灵敏度。研究结果为甘蔗宿根矮化病的诊断、田间发生动态监测、脱毒健康种苗检测及品种/材料交换检疫检测提供了新技术支撑。     

樱桃灰霉病菌LFD-RPA快速检测方法的建立

 灰霉病是樱桃的主要病害,由灰葡萄孢(Botrytis cinerea)侵染所致。该病菌可为害樱桃的花、叶、果实等多个部位,尤其在樱桃生长中后期及贮藏期发病率极高,危害严重。依据樱桃灰霉病菌内转录间隔区(ITS)序列设计引物,建立了樱桃灰霉病菌的重组酶聚合酶扩增结合侧流层析试纸条(LFD-RPA)检测方法。结果表明,该方法检测条件为37℃扩增30 min,能特异性地检测灰葡萄孢,灵敏度为100 fg·μL^-1,略低于常规PCR(10 fg·μL^-1)和荧光定量PCR(7.43 fg·μL^-1);检测方法用时短,PRA扩增仅需30 min,LFD检测仅需10 min。本研究建立的快速检测方法可用于樱桃灰霉病菌的实时监测及病害的田间快速诊断。     

螺旋毛壳ND35 β-1,3-葡聚糖酶的诱导、性质及其抑菌作用

 以病原菌Rhizoctonia solani的细胞壁为诱导物,模拟毛壳菌自然的重寄生过程,研究了内生真菌螺旋毛壳(Chaetomium spirale) ND35 β-1,3-葡聚糖酶的产酶条件、性质,尤其是不同碳源的调控作用。结果表明,不同种类的真菌细胞壁及几丁质和昆布多糖,均可诱导产生β-1,3-葡聚糖酶,而作为分解代谢产物的葡萄糖则抑制产酶。经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose阴离子交换层析及Phenyl-Sepharose疏水层析,并通过SDS-PAGE鉴定,纯化了一种分子量约为73 kDa的内切β-1,3-葡聚糖酶GLUC73。其最适反应温度为55℃,在40℃以下较稳定;最适pH值为5.5,在pH 5-9范围内均很稳定;酶活性受Hg²⁺、Fe³⁺、Zn²⁺、Mg²⁺等金属离子不同程度的抑制,Mn²⁺和Co²⁺对酶有激活作用;以昆布多糖为底物时,该酶的米氏常数K_m为0.412 mg·mL^-1,最大反直速度V_max为3.876 U·mL^-1。粗酶液同时具有β-1,3-葡聚糖酶和几丁质酶活性,离体抑菌试验表明,对苹果炭疽病菌(Glomerella cingulata)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、苹果树腐烂病菌(Valsa mali)的菌丝生长和孢子萌发有明显的抑制作用。通过对β-1,3-葡聚糖进行免疫细胞化学标记和超微结构观察,间接证明了β-1,3-葡聚糖酶在螺旋毛壳重寄生过程中的作用。