家蚕近等基因系育成研究

选用家蚕分子生物学研究常用品种“大造”为轮回亲本,以家蚕实验遗传上各连锁群重要的形态性状标志基因系统为供体,培育家蚕近等基因系。通过1995年春至2000年秋连续6年的培育研究,在我国首次大批育成了包含家蚕全部连锁群各1个标志基因的近等基因系计28个。其中22个与轮回亲本交配次数在10次以上,分别为10－17次不等;余6个（均为隐性基因者）与轮回亲本交配次数达7－9次不等。利用育成的近等基因系进行RAPD分析及克隆鉴定,目前已得到8个近等基因系的目标基因的分子标记。     

对构建的家蚕抗核型多角体病毒病近等基因系的评估

为了从DNA、RNA和蛋白质水平上研究家蚕抗核型多角体病毒病的抗性基因紧密连锁的分子标记及相关的抗性基因和蛋白,选用抗性和感性的亲本,通过杂交和回交技术构建了近等基因系.为了从分子水平上评估这个模型的准确性,尤其是对构建的抗性近等基因系与感性的轮回亲本之间遗传背景的高度相似性的评估.本研究中我们对随机多态性DNA和双向电泳的一些结果进行了分析,比较了以前构建的近等基因系和轮回亲本之间在DNA和蛋白质水平的差异,证明其相似性虽比理论值低,但这个模型对研究抗性仍然是有价值的,对研究家蚕其他的差异基因是有借鉴作用的.     

利用RGA-PCR方法进行水稻抗瘟基因分子标记

用28对RGA引物对LTH近等基因系品种进行PCR扩增，其中11对引物扩增出特异性条带。将扩增到的33个特异性片段回收并进行重扩增，有11个片段产生单一条带。选择2个片段HS-1和HS-19进行探针标记。经Southern杂交发现。探针HS-1在含有Pi—ta^2抗瘟基因品种F-128—1、NO4中有特异杂交信号，表明该片段可能与抗瘟基因Pi—ta^2连锁或是其一部分。对特异性片段HS-1进行克隆、测序，全长为478bp，与Mago等从水稻中克隆的一个抗病基因同源序列RGA29有95％同源性。     

甘蓝型油菜黄籽基因RAPD标记的初步研究

采用RAPD技术,以甘蓝型油菜近等基因系03L1(黑籽)和03L2(黄籽)为材料,对200个10nt的RAPD引物进行了筛选。有18个引物能在近等基因系间扩增出差异片段,其中6个引物在重复实验中表现出很好的重复性。这6个引物扩增出的6个特异片段可能是甘蓝型油菜黄籽基因的RAPD标记。     

三对水稻抗白叶枯病近等基因系的RAPD分析

以水稻抗白叶枯病３对近等基因系为材料，对近等基因系基因组ＤＮＡ进行了ＲＡＰＤ分析，结果显示；经１２０个１０－核苷酸随机引物对３对近等基因系基因组ＤＮＡ的ＰＣＲ扩增，有２个引物在ＩＲＢＢ３中各扩增出１－２条特异性条带；有３人引物在ＩＲＢＢ４中各扩增出２条特异性条带；有３个引物在ＩＲＢＢ５中各扩增出１－２条特异性条带因轮回中和扩增出２条特异性条带；有３个引物在ＩＲＢＢ５中各扩增出１－２条特异性条带；在     

家蚕耐热近等基因系的构建及分子标记育种技术的开发应用

[目的]为家蚕近等基因系分子标记育种技术的开发利用提供理论依据。[方法]采用构建近等基因系的方法,连续回交,将耐热基因导入到敏感品种欧_(17)中,经过6代回交,耐热辅助选择,2代自交。[结果]获得了具有耐热基因的家蚕近等基因系(新种质)。同时监测了各回交后代的抗性水平,测定了近等基因系的分子标记,并利用SSR标记与耐热基因连锁的品种尝试耐热实用品种的杂交种组配。[结论]成功构建了耐热近等基因系,监测了回交后代的抗性水平、饲养成绩,并测定了近等基因系的分子标记。     

与大豆疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁的分子标记研究

以大豆疫霉根腐病近等基因系Williams和Williams79为材料,对它们的基因组DNA进行RAPD分析,160个10-nt随机引物中,只有引物OPQ-04在Williams79中扩增出特异条带,在Williams中未扩增出,且3次重复均获得一致结果。经进一步检测在其它抗病材料中也出现该特异条带,推测该特异条带与大豆抗疫霉根腐病抗性基因Rps1-c连锁,得到显性RAPD标记OPQ-04700。     

小麦抗叶锈基因Lr37 ISSR分子标记的初步研究

利用ISSR(内部简单重复序列)技术对感病品种Thatcher及20个以Thatcher为轮回亲本的小麦抗叶锈病近等基因系进行分析,找到1个与Lr37基因连锁的ISSR标记。经过多次重复发现,在一套ISSR引物中,引物UBC812在小麦抗叶锈基因Lr37近等基因系间表现多态性。当用这个引物对已知含Lr37基因的3个抗病材料及其它不含Lr37基因的感病材料进行检测时,多态性标记UBC812-1200可以从3个含Lr37基因的抗病材料中检测到1条1200bp的多态性带,而在其它感病材料中均未出现。     

家蚕耐热近等基因系的构建及分子标记育种技术的开发(摘要)(英文)

[目的]为家蚕近等基因系分子标记育种技术的开发利用提供理论依据。[方法]采用构建近等基因系的方法创建新种质。利用分子标记辅助育种原理,采用连续回交方法将耐热基因导入到敏感品系欧17中。采用常规耐热选择结合分子标记辅助育种技术,经过6代回交、接种选择,2代自交,获得对具有耐热基因的家蚕新种质。[结果]经过3年8代分别用欧17(敏感性品种)为父本,东34为母本(抗性品种)杂交得BC6F3,后以欧17为轮回亲本,育成了具有耐热基因的近等基因系NK(BC6F3)。同时监测了各回交后代的抗性水平,测定了近等基因系的分子标记,并利用SSR标记与耐热基因连锁的品种尝试耐热实用品种的杂交种组配。[结论]成功构建了耐热近等基因系,监测了回交后代的抗性水平,饲养成绩,并测定了近等基因系的分子标记。     

甜瓜雄全同株和雌雄异花同株的RAPD标记

以甜瓜雄全同株和雌雄异花同株近等基因系为试验材料,选用300条随机引物进行性型性状的RAPD标记.结果表明:S152号引物经多次重复均能扩增出清晰、稳定且有差异的DNA条带,在雄全同株的植株中能扩增出一条分子量约为550 bp的特异条带,标为S152550.在F2代分离群体中,根据特异标记在田间实际雄全同株与雌雄异花同...     

家蚕抗BmNPV细胞因子的筛选和分析

【目的】探讨家蚕NF-kB类转录因子BmRelish在抗核型多角体病毒(Bombyx mori nucleopolyhedrovirus, BmNPV)感染的免疫应答中的作用,筛选和分析抗病毒细胞因子,完善对家蚕抗病毒免疫机制的认识。【方法】通过Western blot检测当BmNPV感染家蚕BmE细胞后BmRelish全长形式（BmRelish-FL）是否转变成其活性形式（BmRelish_act）;利用荧光定量PCR检测过表达BmRelish_act的细胞在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,观测在被荧光标记的BmNPV（BmNPV-EGFP）感染后呈现EGFP荧光的细胞数,并与作为对照的未表达BmRelish_act的细胞相比较,以确定BmRelish是否参与抗病毒免疫;将新鲜细胞通过Transwell细胞共培养体系经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,定量检测在感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,以探讨过表达BmRelish_act的细胞是否产生并分泌抗病毒细胞因子;通过超滤等方法对过表达BmRelish_act的细胞上清培养液予以初步分离,将滤过液和截留液分别孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平,从而确定抗病毒细胞因子的分子量范围;用高温处理滤过液和截留液后再孵育新鲜细胞,定量检测感染BmNPV后胞内病毒DNA的相对水平以确定抗病毒细胞因子的属性;利用LC-MS/MS对滤过液中的多肽做进一步鉴定和分析。【结果】BmE细胞被BmNPV感染后,部分BmRelish-FL转变成其活性形式BmRelish_act;过表达BmRelish_act的细胞被BmNPV感染后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于对照细胞,且呈现EGFP荧光的细胞数也较对照少;新鲜细胞经过表达BmRelish_act的细胞上清培养液孵育后,胞内病毒DNA的相对水平显著低于用对照细胞上清培养液孵育的细胞;用100和3 kD超滤管超滤过表达BmRelish_act的细胞上清培养液后,滤过液仍然具有显著降低所孵育细胞的胞内病毒DNA的相对水平,而截留液无此活性;经高温处理后,该细胞上清培养液不再具有降低所孵育细胞的胞内病毒DNA相对水平的作用;在滤过液中通过质谱鉴定到67个肽段,长度为9-45个氨基酸,富集到32个蛋白质,分子量均＞3 kD,其中9个蛋白质含有信号肽。【结论】BmNPV感染导致BmRelish的激活;活化的BmRelish促进细胞产生抗病毒细胞因子并分泌到上清培养液中;该细胞因子具有增强细胞抗病毒能力的活性,为分子量＜3 kD的多肽。     

野桑蚕应用于家蚕育种的分子标记分析

为了利用家蚕×野桑蚕的杂种优势,选用家蚕与野桑蚕杂交后代群体为试验材料,用SSR分子标记分析家蚕×野桑蚕杂交后代的亲缘关系。聚类分析结果表明:家蚕与野桑蚕杂交后代群体分为2大类,其中第1大类是以家蚕873为亲本的杂交后代,第2大类是以家蚕874为亲本的杂交后代,聚类划分结果符合品系的来源情况。     

家蚕品种资源的遗传多样性与分子系统学研究

利用微卫星(SSR)标记,在DNA分子水平上对不同地理系统和化性的家蚕品种之间的遗传差异进行了研究。结果表明:在11对引物中均出现稳定的扩增带,扩增带总数为106条,最多的有16条,最少有4条,平均每个引物9.6条。利用单匹配相似系数和UPGMA聚类法对结果进行分析,发现其SSR不但具有品种特异性,而且具有系统特异性,证明不同化性及地理系统的家蚕在进化上属有显著差异的类群。     

家蚕荧光茧色分子标记初探

为了获得家蚕荧光茧色基因的分子标记,以家蚕的荧光品种C408黄和C408紫为材料,采用400多个RAPD随机引物筛选分子标记,获得了与家蚕紫荧光茧色有关的1个分子标记CFP-01859.并通过设计特异引物转换成SCAR标记验证,证明获得的标记真实、可靠,并对该分子标记的片段进行了克隆和测序.     

家蚕谷氨酸转运蛋白基因克隆及序列分析

谷氨酸转运蛋白(EAAT)主要存在于神经、神经原及神经胶质细胞浆膜上,对胞外谷氨酸浓度进行调节,在维持细胞正常的生理状态、避免神经元过度兴奋方面起着重要的作用.利用鳞翅目粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)和双翅目拟暗果蝇(Drosophila pseudoobscura)的谷氨酸转运蛋白序列为问询序列,在家蚕基因组数据库中进行同源检索,找到2个EAAT基因的同源基因(BmEAAT),并进行了克隆测序.两个BmEAAT基因均含8个外显子,编码蛋白均为膜蛋白,各有8个跨膜结构域.多物种的同源基因序列的系统发生分析结果表明:家蚕的两个EAAT拷贝至少在鳞翅目与双翅目分化前就已存在.基因芯片数据显示BmEAAT的两个拷贝在家蚕5龄3天的组织表达模式有明显差异,表明这两个基因的功能可能已经分化.     

家蚕多倍体发生与染色体观察分析

以家蚕一代杂交种５Ａ－富蛹和刚产下卵为材料,观察研究其后代的幼虫生殖腺的染色体变化情况。结果表明,微波处理可以诱发家蚕产生多倍体,诱发的多倍体不同而有差异;在以雌蛹为材料的微波处理后代中发现了三倍体（２n=3x=84）和混倍体（2n=2x=56,2n=3x=84);在以卵为材料的微波处理后代中发现了四倍体（2n=4x=112)和混倍体（2n=2x=56,2n=4x=112)。Ｇ－带显示结果表明,在减数分裂的双线期,终变期和早中期Ⅰ的纤细染色体上显示出微弱的带纹,但是未能获得可供带型分析的显微照片。     

家蚕BmYki-1基因鉴定与表达特征

【目的】Hippo信号通路中的核心激酶通过磷酸化作用于转录共激活因子Yki来调控下游基因的表达,在控制器官大小、细胞增殖与凋亡等方面起关键作用。家蚕(Bombyx mori)作为鳞翅目模式昆虫,对其Hippo通路研究较少。论文旨在通过鉴定家蚕BmYki-1并对其序列信息和表达特征进行分析,为进一步研究中肠中Hippo信号通路提供基础,更好地了解Hippo信号通路在肠道稳态维持及组织损伤修复方面的调控机制。【方法】利用NCBI数据库及家蚕基因组数据库等相关信息,以哺乳动物和果蝇的Yki蛋白序列为依据,对家蚕Yki基因的同源序列进行鉴定;以家蚕大造品系为研究材料,利用PCR和cDNA末端快速克隆技术克隆获得家蚕BmYki两种可变剪切体的全长序列BmYki-1和BmYki-2,并基于生物信息学方法对两种剪切体的基因序列特征及蛋白结构特征进行分析;重点对BmYki-1在家蚕中肠组织中的功能进行探索;利用半定量PCR检测家蚕L5D3不同组织及中肠各个龄期BmYki-1表达情况;构建BmYki-1过表达载体并转染家蚕胚胎细胞系对其进行亚细胞定位分析;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达情况。【结果】家蚕中存在两种可变剪切形式的BmYki,分别为BmYki-1和BmYki-2,在家蚕基因组数据库中对应的注释号分别为BGIBMGA0082-TA和BGIBMGA0081-TA,其开放阅读框(ORF)分别为1 329和1 227 bp,分别编码442和408个氨基酸,其蛋白质分子量分别为48和44.1 kD,等电点分别为5.18和5.50,在139-171、220-252氨基酸处均各有1个WW结构域。多物种进化树表明,家蚕BmYki-1与同为鳞翅目的昆虫脐橙螟的亲缘关系最近,与鞘翅目、膜翅目昆虫较近,与双翅目昆虫较远,而与脊椎动物的亲缘关系最远。结果显示BmYki-1在家蚕中肠和丝腺中特异表达,中肠不同龄期表达谱分析结构显示表达量从2眠开始上调,在5龄的前中期表达水平较高。亚细胞定位试验表明BmYki-1蛋白在家蚕胚胎细胞系中主要存在于细胞核中,但在细胞质中也有分布。与对照相比,用博来霉素损伤的家蚕中肠中BmYki-1的表达量显著上调。【结论】获得了BmYki-1全长序列及时空表达特征,亚细胞定位BmYki-1蛋白主要在细胞核中,推测其在家蚕中肠细胞生长发育及损伤修复中起重要作用。     

家蚕中肠组织感染质型多角体病毒的应答基因分析

 【目的】筛选家蚕（Bombyx mori）中肠感染质型多角体病毒的应答基因,为阐明家蚕感染质型多角体病的分子机制奠定基础。【方法】 应用含有约23 000个家蚕基因组寡核苷酸芯片比较分析感染家蚕质型多角体病毒24、48及72 h的中肠试验组与中肠对照组的差异表达基因;结合生物信息学工具对差异表达基因的功能注释、分类及涉及的信号通路等进行分析;应用实时荧光定量PCR验证17个基因的差异表达。【结果】 在感染24、48及72 h后,分别得到了9、51及258个差异表达基因。KEGG通路分析表明,在感染48及72 h后,大多数涉及到代谢通路的基因的表达水平下调,所有涉及到核糖体通路和蛋白酶体通路的基因的表达水平上调。一些免疫相关基因如丝氨酸蛋白酶抑制剂、脂酶、热激蛋白、细胞色素P450、核糖体P0蛋白等基因的表达水平上调。【结论】经荧光定量PCR验证的差异表达基因可能与家蚕感染质型多角体病毒的应答机制相关,研究结果为从分子水平上阐明家蚕感染质型多角体病毒的致病机理提供了新的研究方向。     

桑蚕幼虫中肠对亮氨酸和尿嘧啶的吸收

应用示踪法和体外培养技术,研究了桑蚕幼虫中肠各部位对亮氨酸和尿嘧啶吸收作用的差异。在体外培养中,中肠各部位对亮氨酸的吸收作用以中肠中部最强,对尿嘧啶的吸收作用以中肠后部最强,同时培养液的pH对中肠吸收尿嘧啶有一定的影响。     

蚁蚕期个体形体特征在蚕种杂交率检验中的应用

 【目的】检验蚕种杂交率是蚕桑生产的重要工作，但生产上还没有一种理想的方法。【方法】采用体视显微镜（解剖镜）放大观察蚁蚕。【结果】不同蚕品种具有不同的蚕体颜色、斑纹、斑纹颜色和形状、体型等形体特征，这种形体特征与4、5龄大蚕的形体特征不同，据此发明了一种根据蚁蚕期形体特征检验蚕种杂交率的方法。该方法是采用体视显微镜和摄影设备首先建立每一个家蚕品种蚁蚕期个体形体特征的图文数据库；然后将待鉴别家蚕品种的形体特征与数据库中已知品种的形体特征进行一对一的比较分析，按照概率分布理论和抽样推断方法对检验结果进行统计推断；为了同时减少将不合格蚕种误判为合格蚕种及将合格蚕种误判为不合格蚕种的鉴定风险，拟采用2次抽样检验方法，2个样本组成都为1 000个个体，当第一检和第二检检出纯种数分别小于等于38和79时判为合格蚕种。【结论】本方法可达到简便、正确、快速、低成本、早时期的检验蚕种杂交率的目的。