雏鸡新城疫母源抗体水平与首免日龄关系的再探讨

对初生雏鸡的ND母源抗体进行了动态观察 ,并在HI抗体效价为 6log2 、4log2 时 ,分别应用ND强毒流行株和F48E9标准株进行了攻毒。结果显示 ,对于流行株的攻击 ,母源抗体HI效价为 6log2 和 4log2 时的雏鸡 ,均 1 0 0 %不能被保护而发病死亡 ;对F48E9毒株 ,虽然在HI效价为 6log2 时可完全保护 ,但在HI效价为 4log2 时无任何保护力。说明传统的能使鸡只获得保护的临界值 ( 4log2 )已受到了严重的挑战 ,尤其是对于ND强毒流行株 ,其HI临界值更是远远地高于传统的临界值 ( >6log2 )。雏鸡首免日龄的确定已不能再按传统的公式来推算 ,必须提前免疫 ,且要活苗、死苗同时应用 ,才有可能避免ND野毒的侵袭     

仔猪猪瘟母源抗体消长规律的研究

试验采用ELISA抗体检测法,对仔猪猪瘟母源抗体进行检测,研究其消长规律,并用准确的试验数据来确定仔猪的首免日龄,使仔猪能在最佳时期进行免疫。试验结论表明,仔猪出生后的3～10d内猪瘟母源抗体维持在较高水平,保护值是OD450nm值0.93;第20d时的抗体水平比第10d明显降低;到第25d时,抗体水平下降到更低,保护值降到OD450nm值0.41。此保护值常常是最低保护的临界值,鉴于该猪场仔猪猪瘟母源抗体的消长情况来看,在不进行超前免疫时,20～25日龄是较佳的首免日期。     

仔猪猪瘟母源抗体消长规律研究

为合理制定仔猪的免疫程序,用正向间接血凝试验研究了仔猪母源抗体消长规律。结果表明:仔猪出生后1～28d血清抗体水平较高,其中7～14d血清抗体水平最高,保护率达到了100%,14d以后血清抗体水平降低,42d时血清抗体保护率已经降到了55%。在仔猪28日龄断奶的猪场,若不进行超前免疫,30日龄是较佳的首免日期。     

商品肉鹅新城疫母源抗体的消长规律及其最佳首免日龄

[目的]探讨商品肉鹅新城疫母源抗体消长规律及最佳首免日龄。[方法]通过血凝(HA)试验和血凝抑制(HI)试验,对商品肉雏鹅在不同时间首次接种鹅源新城疫油乳剂灭活疫苗后的免疫效果进行监测,以确定最佳首免日龄,并对ND母源抗体进行动态分析。[结果]霍尔多巴吉肉鹅的母源抗体由1日龄的10 log2下降到25日龄的0.6 log2。母源抗体水平4 log2作为免疫接种的临界点。7日龄免疫组HI抗体水平20日龄后一直维持在临界点以下,不能达到疫苗保护水平;11日龄免疫组HI抗体水平在免疫后16 d达到临界点,到出栏前仍维持较高水平;14日龄免疫组HI抗体水平在免疫后约22 d达到临界点。[结论]霍尔多巴吉肉鹅母源抗体半衰期约为2.7d,11日龄为霍尔多巴吉商品肉鹅新城疫的最佳首免日龄。     

仔猪O型口蹄疫母源抗体消长试验

[目的]为制定科学合理的仔猪口蹄疫免疫程序提供依据。[方法]以规模化养猪场和散养户中经猪口蹄疫O型灭活疫苗免疫后母猪所生产的仔猪为研究对象,利用液相阻断ELISA诊断试剂盒对仔猪母源抗体消长情况进行检测。[结果]仔猪通过母乳获得被动保护,在21日龄母源抗体达到高峰,规模化猪场和散养户母猪的平均效价分别达1∶142和1∶89。规模化猪场场仔猪21~30日龄保护率在80%以上,45日龄下降到65%,60日龄时基本无保护;而农户仔猪21日龄保护率为60%左右,30日龄仅为40%左右。农户饲养母猪免疫抗体水平远低于规模化猪场。[结论]对规模化猪场的仔猪进行口蹄疫疫苗的最佳首免时间为45~50日龄,而对散养户仔猪的最佳首免时间应为30日龄左右。     

禽流感母源抗体消长规律和免疫保护抗体临界值的测定

对初生雏鸡的AI母源抗体进行了动态观察 ,并在HI效价为 6 (Log2 )和 4 (Log2 )、2 (Log2 )左右时 ,分别应用禽流感病毒进行攻毒。结果显示 :初生雏鸡AI母源抗体HI效价的峰值在 7日龄时 (7.85 (Log2 ) )出现 ,比 1日龄 (6 .8(Log2 ) )时高出 1个倍比滴度 ;7日龄后HI效价即随雏鸡日龄的增加而迅速下降 ;至 2 8日龄时 ,已趋于消失。攻毒试验中 ,当HI效价为 6 (Log2 )左右时 ,其保护率为 10 0 % ;在 4 (Log2 )时 ,保护率仅为 5 0 % ;在 2 (Log2 )左右时 ,保护率只有2 0 %。由此说明 ,能使雏鸡对AIV的攻击获得完全保护的临界值应在 4 (Log2 )～ 6 (Log2 )之间 ,且必须大于 4 (Log2 )。     

猪瘟和蓝耳病母源抗体消长规律及疫苗免疫的干扰作用

为了制定合理的猪瘟和蓝耳病免疫程序,试验测定了猪瘟和蓝耳病母源抗体消长规律和疫苗免疫相互干扰作用。结果表明,猪瘟母源抗体从28日龄开始下降加剧,半衰期为17 d左右;蓝耳病母源抗体21日龄开始下降加剧,半衰期9 d左右;高致病性蓝耳病灭活苗对猪瘟弱毒苗免疫无干扰作用,两者可以同时免疫;蓝耳病弱毒苗与猪瘟弱毒苗同时免疫,对猪瘟疫苗的免疫有极显著干扰作用,猪瘟抗体合格率仅为60%,未达免疫保护要求;两者疫苗间隔7 d免疫仍有显著干扰作用,但猪瘟抗体能达到免疫保护要求;蓝耳病免疫效果较差。     

仔猪口蹄疫母源抗体消长规律监测

在贵阳某规模化养猪场,随机选取20头仔猪,采用正向间接血凝试验（IHA）、液相阻斯ELISA（LPB—ELISA）两种血清学方法,对O型口蹄疫母源抗体的消长规律进行监测和分析。结果表明,13日龄左右抗体效价最高。IHA、LPB—ELISA监测的抗体平均效价分别是2．76、2．74,母源抗体免疫合格率分别为90％、85％,在23日龄左右平均效价均为为2．45,母源抗体免疫合格率均为75％,大部分仔猪仍被母源抗体保护,随着日龄的增加,抗体效价呈明显的线性下降,到36日龄左右抗体平均效价分别是1．98、1．95,母源抗体免疫合格率均为55％。45％的仔猪抗体效价低于保护临界值。因此,36日龄确定为仔猪首次免疫时间。两种方法监测的结果无显著差异（P〉0．05）。     

仔猪猪瘟母源抗体消长规律测定

选择福建省南平市某规模化猪场猪瘟抗体检测合格的10头能繁母猪,分别从每头母猪所生的仔猪中随机抽取2头,共20头,25日龄断奶,不注射猪瘟疫苗,分别于l日龄、5日龄、10日龄、15日龄、20日龄、25日龄、30日龄、35日龄、40日龄用猪瘟病毒抗体ELISA检测试剂盒检测猪瘟抗体水平,通过检测数据掌握母源抗体的消长规律。结果表明,哺乳仔猪出生后5~10日龄血清抗体阳性率达到了100%,为最高。抗体水平于15日龄以后开始降低,至25日龄左右达到保护临界值(80%阳性率),40日龄时降低到5%。     

猪O型口蹄疫母源抗体消长规律及疫苗免疫的干扰作用

[目的]制定科学合理的免疫程序,从根本上控制仔猪O型口蹄疫的发生。[方法]采用ELISA抗体检测试剂盒对涪陵某规模化养殖场母猪和仔猪进行了母源抗体和免疫抗体检测。[结果]仔猪在10日龄左右抗体效价最高,平均效价为2.62。随着日龄的增长,仔猪母源抗体水平迅速下降至不完全保护水平。不同日龄首免仔猪口蹄疫疫苗免疫抗体检测结果表明母源抗体效价对试验猪的免疫应答有较大的影响。[结论]30～45日龄是仔猪接种FMD疫苗的最佳时间,这与母源抗体的消长规律相一致。     

仔猪血清猪瘟抗体动态的数学模型

作者对8窝104头仔猪血清的猪瘟抗体用酶联免疫吸附试验间接法进行测定,在获得大量数据的基础上,使用多项式回归分析方法,建立了仔猪血清猪瘟抗体酶联免疫吸附试验测定A值(y)关于日龄(x)的回归方程,本模型的意义在于对各日龄(3日龄～25日龄)仔猪血清猪瘟抗体A值的观察值能进行点预测及区间预测。另4窝45头仔猪血清猪瘟抗体A值作为考验样本,考验样本值都落在置信度:勾0.90的预测区间之内。模型提示,猪瘟抗体水平的最低点在20～21日龄;猪瘟母源抗体的半衰期为11.86天。     

用RT—PCR法对猪瘟病毒检测的研究

用异硫氰酸胍-酚-仿一步抽提法提取病料细胞总RNA并进行反转录，再以此产物为模板对CSFV可疑病料进行了PCR扩增。结果用CSFV特异性引物扩增能得到与设计片段大小相同的产物(272bp)，并且不扩增猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒的核酸；其敏感性要高于猪瘟荧光抗体染色法、猪瘟强弱毒酶标单克隆抗体染色法和电镜负染法，为临床上猪瘟的诊断提供了一个快速、有效的诊断方法。     

盐渍肠衣猪瘟病毒实验室检测的相关性研究

参考GenBank中发表的猪瘟病毒（CSFV）序列,设计一对CSFV特异性引物;从CSFV感染猪盐渍小肠中提取总RNA,经逆转录后进行PCR扩增,在盐渍小肠中成功扩增出与预期大小（168bp）一致的特异性条带,而正常猪和感染猪伪狂犬病病毒的猪小肠扩增结果均为阴性．用此方法对40例盐渍猪肠衣样本进行检测,结果与经典抗原检测方法（抗原捕获ELISA法）一致,而兔体交叉反应试验的阳性检出率为RT-PCR的66．7％,表明本RT-PCR技术能应用于盐渍猪肠衣的CSFV检测．     

非洲猪瘟病毒P30蛋白单克隆抗体制备、鉴定及阻断ELISA方法的建立

【背景】非洲猪瘟（ASF）于2018年8月在中国首次出现,对养猪业造成了巨大危害,损失惨重。目前尚无安全有效的疫苗用来预防ASF,于是建立快速特异的检测方法对于防控ASF提供了有效的手段。【目的】制备非洲猪瘟病毒（ASFV）特异性单克隆抗体,建立ASF快速特异性的检测方法。为ASF的检测和防控提供借鉴技术手段。【方法】构建表达载体pET-28a-P30,通过原核表达系统获得ASFV P30重组蛋白,以纯化的P30蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,经过细胞融合和细胞亚克隆制备出ASFV P30蛋白特异性杂交瘤细胞株;对P30蛋白进行截短表达,利用Western Blot和间接酶联免疫吸附试验（iELISA）鉴定单克隆抗体所对应的抗原表位;并利用制备的单克隆抗体建立非洲猪瘟阻断ELISA抗体检测方法。【结果】通过双酶切和PCR验证,结果显示构建出重组载体pET-28a-P30,经测序其序列未发生突变;IPTG诱导后,P30重组蛋白主要表达在包涵体中,分子量约为33 kD。纯化的P30蛋白与弗氏佐剂1﹕1混合免疫小鼠,3次免疫后,小鼠血清效价达到1﹕102 400,说明表达的蛋白具有良好的免疫原性。经细胞融合和亚克隆,获得8株P30蛋白特异性杂交瘤细胞,Western Blot和间接免疫荧光试验（IFA）检测获得的8株单抗均具有良好的反应性。叠加试验显示8株单克隆抗体均针对相同的抗原位点;截短表达P30蛋白不同片段,选取制备的2-12B单克隆抗体与不同的截短P30蛋白反应,显示单克隆抗体的抗原表位区为187—194aa。利用2-12B单克隆抗体并经过条件优化,成功建立了ASF阻断ELISA抗体检测方法,检测了190份临床样品,并与商品化非洲猪瘟ELISA抗体检测试剂盒进行对比,两方法阳性符合率为90.91%,总符合率为96.32%。【结论】本研究成功获得ASFV P30蛋白,经过iELISA、Western Blot和IFA筛选出反应性良好的特异性单克隆抗体8株,抗原识别表位区为187—194aa。并利用制备的单克隆抗体建立了特异性高,敏感性好的ASFV阻断ELISA抗体检测方法,为ASF的检测及其防控提供了手段和支撑。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体制备及线性抗原表位定位

【目的】制备非洲猪瘟病毒（African swine fever virus,ASFV）p30蛋白的单克隆抗体（monoclonal antibodies,MAbs）并初步分析其所识别的线性抗原表位,为ASFV及其抗体检测方法的建立及p30蛋白结构和功能的研究奠定基础。【方法】将原核表达并纯化的p30重组蛋白作为免疫原,免疫6—8周龄BALB/c雌鼠,每两周免疫1次,共免疫3次,首次免疫是抗原与等体积的弗氏完全佐剂乳化后免疫,第二次和第三次免疫与等体积的弗氏不完全佐剂乳化,3次免疫后1 w断尾采血,间接酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体效价,选择血清效价最高的小鼠进行加强免疫,3 d后取小鼠脾淋巴细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按照4﹕1的比例使用PEG进行常规细胞融合。利用重组p30蛋白作为包被抗原,间接ELISA筛选阳性杂交瘤细胞,有限稀释法进行克隆纯化,直至筛出能够稳定分泌抗体的MAbs。将ASFV接种于猪肺泡巨噬细胞,以筛选的MAbs为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行间接免疫荧光试验（IFA）。将感染和未感染ASFV的细胞沉淀处理后进行 SDS-PAGE并转印至硝酸纤维素膜,分别以IFA鉴定为阳性的MAbs上清为一抗、兔抗鼠HRP-IgG为二抗,进行Western blotting分析,筛选获得p30 MAbs。根据已知序列设计引物扩增p30ab与p30bc两段截短基因,其中p30ab代表由第86—153位氨基酸残基的截短体,p30bc代表由第120—187位氨基酸残基的截短体,原核表达部分重叠的截短p30蛋白,最终获得重组蛋白GST-p30ab与重组蛋白GST-p30bc。分别以GST-p30ab和GST-p30bc融合蛋白为包被抗原,以5株MAbs为一抗,以兔抗鼠HRP-IgG为二抗, 通过间接ELISA方法初步定位p30蛋白的抗原表位。【结果】以纯化的重组蛋白为包被抗原,经间接ELISA试验筛选出25株可分泌抗重组 p30蛋白的杂交瘤细胞株。IFA结果显示,5株MAbs（8F4、1D3、1H2、6C3和8E11）与ASFV感染的猪肺泡巨噬细胞IFA 试验呈阳性;Western blotting结果显示,5株MAbs均能够与ASFV感染的细胞呈阳性反应,与未感染病毒的细胞呈阴性反应。试验构建的p30截短体重组蛋白GST-p30ab以可溶和包涵体两种形式表达,而GST-p30bc仅以包涵体形式表达,以两组截短体融合蛋白为包被抗原,通过间接ELISA检测出MAbs 8F4、1H2和6C3与两个重组蛋白均能有效结合,证明MAbs 8F4、1H2和6C3抗原识别区域为两组截短蛋白重叠区域,即第120—153位氨基酸;MAbs 8E11与1D3则只能与GST-p30ab蛋白结合, 证明MAbs 8E11与1D3抗原识别区域为两个重组蛋白的非重叠区域,即第86—119位氨基酸。【结论】本研究可溶性地表达了p30蛋白的第86—153位氨基酸截短体重组蛋白,制备了5株p30 MAbs,定位到2个p30蛋白抗原表位。结合ELISA和IFA,可建立十分可靠的ASFV及其抗体的检测手段。     

猪瘟和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染的诊断

2009年3月贵州省某猪场送检病猪3例,为确诊病因,进行了流行病学调查,实验室剖检病变观察,细菌学、荧光抗体和RT-PCR检测。经流行病学调查和剖检病变观察,该病例为疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪瘟病毒感染所致;该病例细菌分离鉴定结果为阴性,猪瘟直接荧光抗体检测结果为阳性,猪繁殖与呼吸综合征病毒和猪瘟病毒RT-PCR核酸检测为阳性。表明,该病例为猪瘟病毒和猪繁殖与呼吸综合征病毒混合感染。     

3种疫苗单独和联合免疫对猪抗体水平的影响

{目的]寻求有效结合注射的新型免疫程序,以有效控制猪瘟（CSF）、猪口蹄疫（FMD）和猪繁殖与呼吸综合征（PRRs）疫情的发生和流行[方法]在陕西省横山和米脂两县将140头猪随机分为7组,每组20头,采用CSF活疫苗（脾淋源）、FMD灭活疫苗（0型Ⅱ）、PRRS灭活疫苗（NVDC—JXA1株）分别进行单独、2种及3种同时分．点免疫注射试验,用正向间接血凝和EUSA法检测猪抗体水平。l结果10）3种疫苗都可以刺激猪产生特异性抗体,并且抗体在21、28和35d呈规律性增长。②CSF疫苗与FMD、PRRS疫苗分开和三者同时使用时．虽然FMD、PRRS疫苗推迟CSF抗体的上升时问,但是对CSF的免疫效果产生的影响不明显。（3）PRRS与FMD疫苗同时注射后,所产生抗体效价在21、28和35d均比单独注射PRRS疫苗阳性率高,说明FMD疫苗可对PRRs疫苗注射后有效抗体的产生达到积极协同作用,促进PRRS有效免疫抗体的产生,同时免疫CSF疫苗和PRRS疫苗的抗体水平低于单独注射PRRS疫苗,说明共同免疫CSF和PRRS疫苗时,2种疫苗会相互影响,使免疫效果不如单独免疫。④FMD和PRRS疫苗同时注射后,FMD疫苗所产生的抗体水平（OD值）最高,且一直呈上升趋势,优于FMD疫苗单独注射所产生的抗体水平,说明FMD和PRRS疫苗同时注射,更能促进FMD抗体的产生．[结论]3种疫苗同时分点注射和单注CSF产生抗体后再同时分点注射FMD和PRRS都是较好的防疫体系,具体应根据养殖规模及地域选择合适的防疫体系.     

酷暑对兔体温和猪瘟定型热比率的影响

选用无猪瘟抗体原料兔作试验,研究酷暑对兔体温变化及注射猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液后产生定型热比率的影响。结果表明,当兔体周围气温达38℃时,100%的兔体温超过41℃;当环境温度达35.5℃时,100%的兔体温超过40℃。这些试验兔群表现出不同程度的中暑症状。发生中暑的试验兔群,在22℃的GMP生产动物房内饲养3 d后,每只注射含4 000个发热单位的猪瘟兔化弱毒脾淋乳浆液,5个试验组所产生的定型热比率分别为47%、65%、73%、54%、63%;而饲养于17~25℃舒适气温中的无猪瘟抗体兔群,转移到22℃的GMP生产动物房,注射相同病毒量后,产生定型热比率为98%、96%。上述结果表明在猪瘟兔化弱毒脾淋疫苗生产中,GMP生产动物房必须给兔子提供最舒适的室温,原料兔在生产后期和运输过程中也应避免中暑。但中暑过的试验兔,若能产生定型热,其脾淋毒价仍符合制造活疫苗的要求。