绵羊FGF5基因SNP的生物信息学分析

研究利用PCR-SSCP方法检测了FGF5基因在小尾寒羊、湖羊、藏羊、中国美利奴羊等绵羊品种单核苷酸多态性。结果表明:FGF5基因在P1引物扩增片段中存在PCR-SSCP多态性并引起编码氨基酸的改变。经克隆测序分析,位于P1引物扩增片段内存在G→T突变,该突变位点使编码的氨基酸发生A→S的改变对引起编码氨基酸的P1位点进一步进行了生物信息学分析,发现由于编码序列的改变引起蛋白质二级结构的变化,并引起限制性酶切位点的变化,但没有引起功能位点和三级结构的变化。     

绵羊MyoG基因外显子的单核苷酸多态性群体遗传学分析

采用PCR—SSCP技术分析了肌细胞生成素（MyoG）基因外显子1、2在蒙古羊、无角陶赛特羊、德国肉用美利奴羊和白萨福克羊这4个绵羊品种的多态性。结果表明在在外显子1（exonⅠ）所扩增的片段中存在3种基因型（AA型、AB型和BB型），在外显子2（exonⅡ）所扩增的片段中不存在多态性。对于exonⅠ扩增片段，4个绵羊品种均检测到AA和AB基因型；BB基因型只在蒙古羊、陶赛特羊和白萨福克羊中检测到。在4个绵羊品种中，蒙古羊的AA基因型频率最高，而其它3个品种羊是AB基因型频率高；A等位基因频率明显高于B等位基因频率。exonⅠ的多态性片段测序分析表明：MyoG基因第305处发生了单碱基突变（T→C），并导致了所编码氨基酸由半胱氨酸变为精氨酸。     

不同品种绵羊TGF-β1基因单核苷酸多态性及其与繁殖力关系的研究

以小尾寒羊、滩羊、同羊、欧拉羊共计196头为研究材料，采用PCR—SSCP技术，对绵羊TGF-β1基因6-7外显子区间内的805bp序列进行多态性分析，发现了一个多态位点。经克隆测序分析发现，第6内含子区内存在一个突变，该突变位点为第7外显子上游的第294位碱基处缺失了AGAC（序列：gi76871756中的14201位）。对不同绵羊群的基因型和等位基因频率统计结果表明，多胎品种小尾寒羊以AB基因型为主。x^2检验结果表明，单胎品种滩羊、同羊、欧拉羊以BB基因型为主，所有品种都处于Hardy-Weinberg平衡状态。     

绵羊胚胎FGF5基因单碱基突变体系的建立

研究旨在利用单碱基编辑技术定点修饰绵羊（Ovis aries）成纤维细胞生长因子5（fibroblast growth factor 5，FGF5）基因第1外显子以引入终止密码子，获得定点编辑类型的绵羊胚胎，为培育具有长毛性状的绵羊提供试验材料。首先设计合成4个单导向RNA （single guide RNA，sgRNA）寡核苷酸链（sgRNA-T1~sgRNA-T4），构建4组不同的重组表达载体；将构建好的pGL3-U6-sgRNA-PGK-puromycin和pCMV-AncBE4max-P2A-GFP质粒以共转染的方法分别转入4组绵羊成纤维细胞，随后用Cruiser^TM酶对转染的细胞进行活性检测并在胚胎水平进行测序验证。结果显示，sgRNA-T1和sgRNA-T4组细胞的PCR产物可被Cruiser^TM酶酶切，且测序结果表明都具有靶向效果，编辑效率分别为68.75%和47.37%。利用显微注射技术将不同浓度的AncBE4max mRNA与有效sgRNA混合注射到绵羊孤雌激活胚胎中，并检测胚胎卵裂率、囊胚率和编辑效率，结果显示，胚胎水平的最佳注射浓度组合为AncBE4max （ng/μL）∶sgRNA （ng/μL）=100∶50，从该浓度组中随机挑选的单枚胚胎测序结果显示，引入终止密码子的编辑效率为80%。而sgRNA-T1在不同浓度组合的注射胚胎中均未检测到编辑。本研究针对FGF5基因的第1外显子，通过在成纤维细胞转染表达载体，成功筛选到高效靶向绵羊FGF5基因的2个sgRNA （T1、T4）；通过显微注射绵羊孤雌激活胚胎，成功在胚胎上实现FGF5基因第1外显子打靶位点C→T的转变，为后期FGF5基因定点编辑羊的生产奠定基础。     

利用CRISPR/Cas9n系统编辑绵羊成纤维细胞生长因子5(FGF5)基因

成纤维细胞生长因子5(FGF5)是影响毛囊周期性活动及毛发生长的重要生长因子。本研究利用CRISPR/Cas9n系统靶向编辑绵羊成纤维细胞中FGF5基因。首先利用Gibson Assembly法将U6启动子引导表达单导向RNA(sgRNA)的原件构建至pX461质粒中,获得pX461-U6质粒;再将设计并合成好的1对靶向FGF5基因第3外显子的sgRNA及其互补链,经退火连接形成sgRNA-sg1和sgRNA-sg2双链后,分别克隆至带有BbsⅠ和BsaⅠ黏性末端的pX461-U6质粒。构建好的重组质粒pX461-U6-sg1+sg2经测序鉴定后,以电转染的方式转入绵羊成纤维细胞,72 h后收集细胞进行检测分析。经T7E1酶切检测分析表明,成功获得1对具有靶向效果的sgRNA,PCR扩增的FGF5基因片段经TA克隆后进行测序鉴定,结果sgRNA-sg1+sg2在靶位点的打靶效率为100%;缺失的核苷酸数从10到64个不等;基于预测的3D模型和RT-PCR结果显示,FGF5基因的突变将会影响FGF5蛋白与其受体的结合,导致FGF5蛋白失去其生物学功能。本研究构建了可以在同一载体中同时表达...     

绵羊催乳素受体基因外显子10的多态性分析

将催乳素受体(prolactin receptor, PRLR)基因作为绵羊高繁殖力的候选基因,对其外显子10设计2对引物, 采用PCR SSCP 技术检测其在常年发情的湖羊及季节性发情的中国美利奴羊、罗米丽羊和罗米丽×中国美利奴（新疆军垦型）中的单核苷酸多态性。结果表明,引物P1、P2 的扩增片段均有多态性。与已知序列相比,P1扩增片段的AB型在第53 bp处出现A→G突变、在81 bp处出现G→A突变, BB型在该片段第53 bp处发生A→G的突变;对于P2扩增片段, CC、DD、CE和EF型均在第89 bp处发生C→T的突变,导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸(Pro→Leu),DD型还在146 bp处出现了C→G的突变,此突变导致氨基酸由丙氨酸变为甘氨酸(Ala→Gly);CE型在该片段第132 bp处发生G→A的突变,未导致氨基酸的改变;EF型还在第132 bp处和第167 bp处分别发生了G→A、C→T突变,第167 bp处的突变导致氨基酸由脯氨酸变为亮氨酸(Pro→Leu)。通过卡方独立性检验结果发现,4种绵羊在P1、P2引物扩增片段上各基因型的构成与品种间有极显著差异(P<0.01),说明PRLR基因对绵羊的繁殖性状有一定的影响。     

绵羊雌激素受体基因外显子4多态性分析

根据GenBank发表的人、鸡、大鼠雌激素受体(estrogen receptor,ESR)基因外显子4的序列设计1对引物,采用PCR SSCP技术分析ESR基因外显子4在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（特克塞尔、中国美利奴、考力代和杜泊）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明,ESR基因的此对引物扩增片段在所检测的6个绵羊品种中均不存在PCR SSCP多态性,说明所检测的ESR基因外显子4序列比较保守,该区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

绵羊高繁殖力候选基因BMPR-IA的研究

以骨形态发生蛋白受体IA（bone morphogenetic protein receptor IA，BMPR-IA）基因为候选基因，采用PCR—SSCP技术检测该基因在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊、湖羊）以及低繁殖力绵羊品种（多赛特羊、特克塞尔羊、德国肉用美利奴羊）中的单核苷酸多态性，同时研究该基因对小尾寒羊高繁殖力的影响。结果表明：在小尾寒羊中检测到AA、AB两种基因型，在湖羊中只检测到一种基因型BB，而在低繁殖力的3个绵羊品种中只检测到一种基因型AA。统计结果表明：小尾寒羊A等位基因频率为0．964，B等位基因频率为0．036。测序结果表明：BB型与AA型相比有6处核苷酸发生了突变。独立性检验表明：外尾寒羊与低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异不显著（P〉0．05），而湖羊与小尾寒羊、低繁殖力绵羊品种间基因型分布差异极显著（P〈0．001）。AB基因型小尾寒羊平均产羔数比AA基因型多0．15只，但差异不显著（P〉0．05）。研究表明：BMPR-IA基因不是小尾寒羊和湖羊高繁殖力的主效基因。     

不同绵羊品种GHSR基因多态性与生长性状的关联分析

以GHSR基因为候选基因,随机选取滩羊、小尾寒羊和兰州大尾羊3个品种共计1 249个个体为试验材料,利用DNA池测序结合琼脂糖凝胶电泳方法,检测突变多态性,分析其与体重、生长性状的相关性。试验结果表明,在GHSR基因的第一内含子上存在24 bp的插入/缺失突变,3个绵羊品种中均存在AA、AB、BB 3种基因型。该位点的多态性与3种绵羊8个生长性状指标关联分析显示,兰州大尾羊BB基因型的个体体重显著高于其他基因型;AB基因型的个体体高、十字部高显著高于其他基因型;小尾寒羊AB基因型的个体胸宽显著高于其他基因型;AA基因型的个体体高、十字部高显著高于BB基因型;滩羊AB基因型的个体体斜长、体重显著高于AA基因型,BB基因型的个体体高显著低于其他基因型。研究表明:GHSR基因可以作为3种绵羊生长性状的候选基因,为绵羊育种选育提供新思路。     

MCIR基因多态性与其肤色、胫色表型相关性的分析

利用引进的隐性白羽肉鸡和黑羽乌骨鸡的资源家系及由该亲本建立的资源家系群体,对MCIR基因的进行PCR-SSCP分析,分析其性状与基因型的相关性,并对检测到的基因型与肤色和胫色性状进行卡方独立性检验,结果表明：AA、BB和AB各基因型分布在不同肤色性是中差异显著P〈0.05）;CC和CE基因型分布在不同活体胫色性状中差异显著（P〈0.05）     

绵羊催乳素受体基因PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了催乳素受体基因(PRLR)在小尾寒羊、萨福克羊、多赛特羊、多赛特公羊×小尾寒羊母羊F1代杂种羊4个绵羊群体中的多态性。结果表明:PRLR基因在3对引物扩增片段中均存在PCR-SS-CP多态性。对于引物1,4个绵羊群体均检测到AA基因型,AB基因型只出现在小尾寒羊、多赛特羊和萨福克羊中,仅在多赛特羊中检测到BB基因型。对于引物2,4个绵羊群体均检测到AA和AB基因型,只有萨福克羊没有BB型。对于引物3,4个绵羊群体均检测到AA、AB和BB基因型。在4个绵羊群体中,A等位基因频率均明显高于B等位基因频率。     

绵羊孕酮受体基因的PCR-SSCP分析

作者设计3对引物,采用PCR-SSCP方法检测孕酮受体（progesterone receptor,PGR）基因DNA结合区和配体结合区序列在高繁殖力绵羊品种（小尾寒羊和湖羊）和低繁殖力绵羊品种（多赛特和特克赛尔）中的单核苷酸多态性,同时研究该基因对绵羊繁殖力的影响;对小尾寒羊PGR基因外显子5、6和9克隆测序,结合GenBank提供的绵羊PGR基因部分编码序列,拼接出绵羊PGR基因DNA结合区和配体结合区的完整序列,推导出编码的氨基酸序列;并将人、兔、狗、绵羊、小鼠和大鼠的PGR基因这两个区域的核苷酸与氨基酸序列进行比较。结果表明,PGR基因DNA结合区和配体结合区序列在所检测的4个绵羊品种中都不存在单核苷酸多态性;人、兔、狗、绵羊、小鼠、大鼠PGR基因DNA结合区和配体结合区的核苷酸序列同源性分别为88.6%~97.2%和84.4%~96.3%,氨基酸序列同源性分别为97.6%~100%和96.3%~99.6%。可见,哺乳动物PGR基因DNA结合区和配体结合区序列保守性很强,这两个区域可能不是影响绵羊高繁殖力的功能结构域。     

乌珠穆沁羊FSHR基因第10外显子的PCR-SSCP检测及序列分析

利用PCR-SSCP技术检测乌珠穆沁羊123个样本的FSHR基因第10外显子的单核苷酸多态性（SNP）。结果未发现多态。测序后获得该羊FSHR基因第10外显子的核苷酸序列,通过DNA序列分析结果表明：绵羊FSHR基因第10外显子序列与小尾寒羊、牦牛、水牛和小鼠的同源性分别为100%、98%、98%和86%。提示：为FSHR基因第10外显子能否作为绵羊高繁殖力相关的侯选基因提供依据。     

3个绵羊群体MSTN基因编码区PCR-SSCP分析

采用PCR-SSCP技术分析了3个不同绵羊品种（杜泊绵羊、小尾寒羊、晋中绵羊）肌肉生长抑制素（MSTN）基因的单核苷酸多态性.根据3个绵羊品种MSTN基因Exon1（P1）、Exon2（P2和P3）和Exon3（P4和P5）序列设计5对PCR-SSCP引物并扩增,经SSCP分析,P1位点检测到A和B两个等位基因,AA、AB、BB三种基因型;且在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,而在小尾寒羊和杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P2和P5位点没有检测到多态位点.P3位点检测到A和B两个等位基因,AA、BB两种基因型;且在3个绵羊品种上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.P4位点检测到A、B和C三个等位基因,AA、AB、AC三种基因型;且在小尾寒羊上处于Hardy-Weinberg平衡状态,在晋中绵羊上处于Hardy-Weinberg不平衡状态,在杜泊绵羊上极显著偏离Hardy-Weinberg平衡状态.     

5个家兔群体FGF5基因的遗传多样性分析

设计5对特异性引物,采用PCR-RFLP法及PCR-SSCP法对5个家兔群体FGF5基因CDS序列进行分析。结果显示:FGF5-1A发现了2个等位基因、3种基因型,在该引物285~287位点存在TCT缺失;FGF5-3B发现了2个等位基因、2种基因型,在该引物58位点处存在T→C突变。所有的群体均处于哈代-温伯格平衡,且在所选的5个家兔群体的FGF5-1A中,A1等位基因均为优势等位基因,獭兔群体表现为中度多态,肉兔群体表现为低度多态,毛兔未检测到多态。皖系长毛兔与其他家兔群体之间分布均差异极显著(P<0.01),九疑山兔与海狸色獭兔之间分布差异显著(P<0.05)。该研究为FGF5基因是否能作为家兔毛质性状选育工作的分子标记提供了一定参考。     

4个绵羊品种LHCGR基因单核苷酸多态性分析

为探究绵羊LHCGR基因在4个绵羊品种之间的多态性与基因功能，本研究以杜泊羊、滩羊、小尾寒羊、滩羊和小尾寒羊杂交羊4个绵羊品种为研究对象，利用Sequenom MassARRAYSNP技术对4个绵羊品种LHCGR基因g.75747421A>C、g.75748200T>A 2个位点进行检测，并利用相关生物信息学软件预测分析2个位点突变前后mRNA二级结构与其编码蛋白的理化性质、结构和蛋白互作等。结果表明，LHCGR基因g.75747421A>C位点在4个品种中存在3种基因型，分别是CC、CA和AA；g.75748200T>A位点在4个品种中存在AA、AT和TT 3种基因型；χ²适合性检验表明，g.75747421A>C、g.75748200T>A 2个位点在4个绵羊品种中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P>0.05）。生物信息学分析表明，该基因编码蛋白的相对分子质量为73 599.70，理论等电点为8.30，脂肪系数为98.90，总平均亲水性为0.191，推测该蛋白为疏水性蛋白；突变前后LHCGR基因的mRNA二级结构、编码蛋白二级结构及三级结构均发生了变化；蛋白互作的结果表明，与LHCGR蛋白相互作用的蛋白质主要包括骨形态发生蛋白15（BMP15）、嗜铬粒蛋白A （CGA）、甲羟戊酸激酶（MVK）、胆固醇侧链裂解酶（CYP11A1）、鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α亚基（GNAS）等。本研究成功筛选出4个绵羊品种LHCGR基因多态位点，为绵羊繁殖力的标记辅助选择和育种提供一定的理论依据。     

绵羊WNT5A基因克隆及其组织表达分析

WNT5A(Wnt family member 5A)参与了多种细胞的增殖、凋亡和分化等生物学过程,在乳腺形态发生、毛囊发育等方面发挥了重要作用.该试验利用RT-PCR获得绵羊WNT5A基因的CDS区,分析WNT5A蛋白的结构特征并利用RT-qPCR检测WNT5A基因在9个组织中的表达情况.绵羊WNT5A基因的CDS区...