毕赤酵母异源表达β-葡聚糖酶酶学特性的研究

根据酵母密码子的偏好性对来自某异源菌种的葡聚糖酶基因进行化学合成改造,用电转化方法整合到毕赤酵母基因组中进行表达,并对表达出的内切β-葡聚糖酶进行相关酶学特性研究。结果表明:酶的最适pH为4.5,最适温度为40℃C;酶的pH稳定性范围与缓冲溶液类型有关,为4.0—6.0;Al~(3+)对酶有激活作用,但Mn~(2+)和Cu~(2+)则会抑制酶的活性;此酶对羧甲基纤维素钠(CMC-Na)有较强的分解能力;胃蛋白酶对该酶有抑制作用。     

金针菇菌糠中木聚糖酶的分离纯化及其酶学性质研究

废弃食用菌栽培料(SMC)中含有一定活性的木聚糖酶,作者以金针菇菌糠为材料,采用盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE C-52离子交换层析等技术,对SMC中的木聚糖酶进行分离和纯化,并进行酶学性质研究。结果表明,该酶经SDS-PAGE电泳鉴定为电泳纯,分子量为37.8 KDa,酶比活力达到946.67 U/mg,纯化倍数为12.74;酶的最适温度和pH分别为50℃和pH 6.0,Fe~(2+)、Zn~(2+)对木聚糖酶有激活作用,Ca~(2+)、Mn~(2+)、K~+有促进作用,Mg~(2+)、Cu~(2+)、Fe~(3+)有抑制作用,反应动力学参数V_(max)和K_m分别为15.43μg/mL/min、9.61 mg/mL。     

产低温纤维素酶菌株的分离鉴定及产酶特征研究

自东帕米尔高原布伦口湖群湿地10 cm草甸中分离到一株高酶活低温纤维素酶产生菌BLKC2,经16S rDNA序列鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)。BLKC2在10℃低温条件下保持繁殖能力,在20℃,pH 7.0条件下发酵72 h,酶活力达到最大值28.7 U/mL。酶学特性显示,BLKC2分泌的粗酶最适催化温度为30℃,对热敏感,最适反应pH8.0左右,在pH 7.0～9.0的偏碱性环境中酶活力较稳定,Mn~(2+)、Zn~(2+)、Mg~(2+)对酶反应有明显激活作用,而Fe~(3+)、Cu~(2+)则抑制了酶反应。     

海参组织蛋白酶K的部分酶学性质及其对海参自溶的影响

采用特异性荧光底物法检测海参体壁组织蛋白酶K(CTSK)的酶学性质并初步探讨其对海参自溶的影响。结果表明:CTSK的最适pH为5.0,最适温度为50℃,在20~40℃之间酶活力稳定性较好;Zn~(2+)、Fe~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)均对CTSK产生一定抑制作用,抑制率均超过60%;而Ca~(2+)和Mn~(2+)对其活性影响不大,Mg2+可增强该酶活性、CA-074、Z-Leu-Leu-Leu-H(ZLLL)、碘乙酸、E-64、抗痛素、PMSF对CTSK的抑制率均在85%以上,EDTA和1,10-菲啰啉对该酶的抑制率分别为39.7%和16%,而DTT和L-Cys可将该酶活力分别提高至127.46%和238.3%。在海参匀浆物中分别加入特异性抑制剂CA-074和ZLLL,25℃水浴加热使其发生自溶,并通过SDSPAGE检测CTSK对海参蛋白降解的影响。结果显示ZLLL能够在一定程度上抑制海参蛋白的降解。CTSK是一种巯基氨基酸含量较高的半胱氨酸蛋白酶,具有一定的金属离子依赖性,但又易被多种金属离子抑制;CTSK有可能直接参与海参自溶过程中蛋白质的降解。     

芽孢杆菌L4菌株角蛋白酶的酶学性质研究

采用室内实验方法,对芽胞杆菌L_4菌株产生的角蛋白酶进行了系列的酶学性质研究.结果表明,以角蛋白溶液为底物时该酶的最适酶促反应温度为40℃,最适酶促反应pH为7.0,其Km值为1.88 mmol·L~(-1),Vmax为2.72×10~(-2)mmol·L~(-1)·s~(-1).利用不同的蛋白酶抑制剂进行酶活性抑制实验,发现该酶受邻啡罗啉和EDTA的抑制,推测该酶可能是一种含Zn~(2+)的金属蛋白酶.微量元素对该酶活力的影响显著,Ca~(2+)和Mg~(2+)对酶活力有促进作用,高浓度的Fe~(2+)和Cu~(2+)明显抑制角蛋白活力.     

三唑磷农药降解酶的定位及酶学性质研究

采用超声波破碎法破碎三唑磷农药降解菌芽孢杆菌TAP-1,研究不同细胞组分对三唑磷农药的降解率,应用液相色谱法研究三唑磷农药降解酶的酶学性质。结果表明,胞外酶、胞间粗酶液和胞内酶对三唑磷的降解率分别为2.8(±0.34)%、12.8(±2.44)%和84.4(±6.71)%。菌株TAP-1降解三唑磷农药的主要活性物质位于降解菌细胞内,属于胞内酶组分。该酶最适作用pH值为6.5~7.0,在pH 5.0~7.5之间,酶活力均能保持在最高酶活力的68%以上。最适反应温度为30℃,在25~40℃温度范围内能保持75%以上的降解活性。不同化学试剂和金属离子对酶活性产生不同的影响。巯基修饰剂、EDTA、Hg~(2+)和Mn~(2+)对酶活性有抑制作用。Mg~(2+)、Co~(2+)和Fe~(3+)对酶活性有促进作用。该降解酶米氏常数(Km)为23.02μmol/L,最大反应速度(Vmax)为0.738μmol/mg·min。     

海洋弧菌中褐藻胶裂解酶Alg的克隆表达及酶学性质

褐藻胶裂解酶是制备功能性寡糖的关键酶,以基因工程手段构建重组褐藻胶裂解酶,为实现褐藻胶裂解酶向商业酶转化奠定重要基础。以海洋弧菌SS-1总DNA为模板,运用PCR技术克隆得到褐藻胶裂解酶基因Alg,构建重组表达菌株E.coli BL21(DE5α)/p ET28a(+)-Alg,进行诱导表达,产物通过Ni-NTA resin亲和层析柱纯化,研究其酶学性质及酶解产物。结果表明,重组酶的最适pH为8.0,在pH 4.0~9.0范围内,30℃条件下保温2 h,仍能保持60%以上的相对酶活力;最适温度30℃,热稳定实验显示在高于30℃保温2 h其残余酶活力损失40%以上;在添加浓度1 mmol/L离子K~+、Na~+和Mg~(2+)显示对重组酶有明显的促进作用,Cu~(2+)、Fe~(3+)、Ba~(2+)、Fe~(2+)、Al~(3+)、SDS和EDTA等对该酶抑制作用明显;动力学参数Km为5.93 mg/mL,Vmax为826.44 mg/(mL·min);电离喷雾质谱(ESI-MS)分析其降解褐藻胶产物主要为小分子寡糖。重组酶是具有良好的酶学特性及有效的作用poly(M)降解产生低聚寡糖的双功能酶,可用于褐藻寡糖的制备。     

藜麦麸过氧化物酶分离纯化及酶学特性研究

经浸提、硫酸铵分级沉淀和DEAE-Sepharose Fast Flow阴离子交换层析,从藜麦麸中纯化得到了电泳纯的过氧化物酶(peroxidase,POD),其纯化倍数、比活力和回收率分别为23.78,22 753.09 U/mg和19.36%。经SDS-PAGE鉴定,该酶相对分子质量为57.1 ku。在催化愈创木酚与过氧化氢的反应中,酶的最适温度为60℃,最适pH值为6.0,在40～60℃及pH值4～8范围内具有较好的稳定性。以H_2O_2为底物,测得该酶的Km值为5.61 mmol/L。尿素、Mg~(2+)和Fe~(3+)对酶有激活作用,当其浓度为50 mmol/L时,酶活力被分别激活至119%,117%,161%;K~+,Ca~(2+)对藜麦麸POD无显著影响;甲醇,乙醇,异丙醇,正丁醇,KSCN,SDS,Zn~(2+),Cu~(2+),Mn~(2+)对酶有抑制作用,其中,正丁醇和SDS对酶的抑制作用很强,当正丁醇体积分数为20%,SDS浓度为10 mmol/L时,酶的活性完全丧失。     

毕赤酵母表达罗氏耶尔森氏菌(Yersinia rohdei)植酸酶和酶学特性研究

按毕赤酵母偏爱密码子,将来自Yersinia rohdei的植酸酶基因(YrAPPA)进行了化学合成,并成功在毕赤酵母GS-115中异源分泌表达,重组植酸酶分泌量能达到72μg/mL。酶学特性研究结果表明:酶比活达到1 500 U/mg,重组植酸酶的最适反应温度和pH分别为55℃和4.5;纯化的重组植酸酶能耐受60℃高温,且pH 3—7.5范围内重组植酸酶有良好的稳定性;Cu~(2+)、Zn~(2+)、Fe~(3+)对植酸酶活性有抑制作用;重组植酸酶有抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解特性。     

来源于Cronobacter universalis的植酸酶酶学性质的研究

按照毕赤酵母(Pichia pastoris)对密码子的选择偏向性,对来源于细菌(Cronobacter universalis)的植酸酶基因(以下命名为CuPhyS)进行了密码子优化改造,合成并且作为外分泌蛋白成功地在毕赤酵母GS115里表达,CuPhyS的蛋白分泌量可积累到45μg/mL。酶学性质研究表明:该酶的最适pH为4.0,最适温度为50℃,在pH 3.0—12.0时该酶比较稳定,在50℃下热稳定性较高;以植酸钠作为底物,Mg~(2+)对酶活有一定的激活作用,Cu~(2+)对酶活有一定的抑制作用;该酶还具有良好的抗胰蛋白酶水解的能力和部分抗胃蛋白酶水解的能力。     

新型植酸酶基因YkAPPAS在毕赤酵母中的表达及其酶学特性分析

根据密码子的偏好性,采用PTDS方法化学合成了一个来源于Yersinia kristesenii的新型植酸酶基因(YkAPPAS),并且作为外分泌蛋白在毕赤酵母GS115中成功表达。重组植酸酶YkAPPAS的蛋白分泌量可达到106.73μg/mL。对重组植酸酶的酶学性质研究表明:该酶的比活力为2 330 U/mg;最适pH为4.5和6.0;最适温度为45℃;100℃处理5 min后其剩余活性为47.55%;90℃处理5 min后其剩余活性为56.75%;在pH 3—12时的活性均在30%以上。Li~+、EDTA对酶活有一定的激活作用;Zn~(2+)、Cu~(2+)对酶活有一定的抑制作用。重组植酸酶还具有良好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶水解的特性。     

右旋糖酐酶酶学性质研究

右旋糖酐酶专一性水解右旋糖酐中的α-1,6糖苷键,使右旋糖酐高效水解为一定分子量的右旋糖酐用于医药等领域。右旋糖酐酶酶学性质研究表明,酶作用的最适pH和温度分别为pH 5.0和55℃,最适底物浓度为2%右旋糖酐;在50℃以下相对稳定;在pH 2.2～9.6范围内相对稳定,具有良好的酸碱稳定性;酶对底物的亲和力随底物分子量的增加而增强;Mn~(2+)具有显著的激活作用,Cu~(2+)对酶具有较强抑制作用。     

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质初步研究

盾壳霉几丁质酶和葡聚糖酶酶动力学性质研究表明:几丁质酶和葡聚糖酶的酶促反应,在本试验计量范围内,其反应速度与酶量和底物浓度均呈正相关,但两种酶促反应适宜的温度和pH值有较大差。几丁质酶降解几丁质的最适反应温度为50℃,最适pH值为8.0,葡聚糖酶降解葡聚糖的最适反应温度为60℃,最适pH值为3.0。     

来源于盐惰菌属Halopiger xanaduensis的木聚糖酶基因在毕赤酵母中诱导表达及其酶学性质的研究

根据毕赤酵母的密码子偏爱性和木聚糖酶的蛋白序列设计并合成了木聚糖酶基因片段,与表达载体pYPX88连接,构建成分泌表达载体;构建的分泌表达载体经BglⅡ酶切后电击转化到毕赤酵母GS115中,筛选得到阳性克隆。研究了重组木聚糖酶的最适pH、pH稳定性、最适温度、温度稳定性以及部分金属离子、十二烷基硫酸钠(SDS)和二硫苏糖醇(DTT)对该酶性质的影响。结果表明:重组木聚糖酶最适pH为6.0,在pH 4.5—8.0时酶学性质稳定;最适温度为60℃在20-65℃时酶学性质稳定;金属离子Mn~(2+)与Cu~(2+)对该酶有抑制作用,化合物DTT对该酶有明显促进作用。     

南极磷虾羧肽酶的分离纯化及酶学性质

南极磷虾生活在极寒环境,其体内特殊的蛋白酶系统是其维持正常新陈代谢的关键因素。羧肽酶是南极磷虾蛋白酶系统中一类主要且关键的蛋白酶,酶学性质研究对其后续基础研究开展及商业利用都具有指导意义。本研究以南极磷虾为原料,采用缓冲液提取、硫酸铵分级盐析,DEAE-琼脂糖凝胶FF阴离子层析和Sephadex G-100凝胶层析,从南极磷虾匀浆液中分离纯化出一种羧肽酶,SDS-PAGE结果显示其分子量为30 ku。酶学性质研究结果显示:该酶最适温度为30℃;最适pH为8.0。热稳定性较差,即使在4℃下保温超过2 h酶活性会急剧下降。金属离子Ni~(2+)、Mn~(2+)、Zn~(2+)和Mg~(2+)具有激活作用,且激活作用依次增强;而Ca~(2+)、Fe~(3+)和Cu~(2+)起抑制作用,Cu~(2+)抑制效果最明显。对巯基有修饰作用的抑制剂DTT和β-巯基乙醇对其有抑制作用,推测该酶活性中心存在二硫键;金属蛋白酶抑制剂EDTA和1,10-菲罗啉对该酶活性有明显的抑制作用,说明了其具有金属蛋白酶特性;而丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF对该酶抑制作用并不强烈。以脲酰-L-苯丙氨酸为底物溶液,测得该酶K_m为0.005 9 mg/mL、V_(max)为4.909 1 U/min。     

黄星天牛中肠中内切葡聚糖酶的鉴定与酶活性测定

内切葡聚糖酶(Cx)是纤维素酶系中的主要成分,它包含多种同工酶,能够将可溶性纤维素水解成还原性寡糖。采用Native-PAGE技术对黄星天牛中肠中Cx进行电泳分离,结合LC-MS/MS技术对黄星天牛中肠中Cx种类进行鉴定,并对其性质进行研究。结果显示黄星天牛中肠中含有多种Cx,通过结构域分析,确定为GHF5家族蛋白,有共同的保守区(IIYETFNEPT),Cx最适反应温度为50℃,最适pH值为6.0,且具有较广的pH值稳定范围,低浓度的Mg~(2+)与Co~(2+)对该酶有激活作用,高浓度的Mg~(2+)与Cu~(2+)对该酶有抑制作用。这一结果可为黄星天牛降解纤维素机制的研究提供理论基础,为进一步研究天牛中肠组织的生理功能提供基础信息。     

枯草芽孢杆菌86315α-淀粉酶的研究 Ⅱ.分离提纯、性质及动力学

采用壳聚糖絮凝、淀粉吸附、乙醇沉淀等步骤,从枯草芽孢杆菌86315发酵液中提取了α-淀粉酶,然后用Sephadex G-100凝胶过滤、DEAE-纤维素柱层析进一步提纯,得到DISC-电泳一条带的α-淀粉酶制剂。用SDS-PAGE测出其分子量为54000。用等电聚焦测出其p~1为5.2。动力学实验表明:最适温度60℃;最适pH5.6;对可溶性淀粉的Km值是3.0mg/ml;Ca~(2+)、Mg~(2+)、Ba~(2+)对α-淀粉酶活性稍有激活作用;Mn~(2+)不影响酶活性;Fe~(2+)、Fe~(3+)、Cu~(2+)、Ag~(1+)、甲醛、EDTA以及戊二醛都明显抑制酶活性。该酶在50℃以下是稳定的,pH稳定范围是5.6～8.8,对60％乙醇有高度的稳定性,易被尿素变性。     

鲢内源性转谷氨酰胺酶的纯化及其性质

以鲢(Hypophthalmichthys molitrix)肌肉为原料,采用硫酸铵盐析、凝胶过滤层析(Sephacryl S-300HR)和阴离子交换层析(DEAE-Sepharose FF)对鲢内源性转谷氨酰胺酶(TGase)分离纯化,并对其酶学性质进行研究。结果表明,酶液经多步纯化后可得单一酶蛋白,其分子质量为100ku,比活力为126.7U/mg,纯度提高34.2倍,该酶适宜的反应pH和温度分别为8.0和50℃。鲢内源性TGase具有Ca~(2+)依赖性,最适Ca~(2+)浓度为3mmol/L。DTT在低浓度(0~5 mmol/L)范围能增加酶的活性,而高浓度的DTT、EDTA及Mg~(2+)、Cu~(2+)、Zn~(2+)、Ba~(2+)、Sn~(2+)、Fe~(3+)等金属离子则表现出抑制作用。鲢内源性TGase对鲢和草鱼肌球蛋白有较强的催化交联作用,能够诱导鲢、草鱼肌球蛋白交联形成多聚体,且对鲢肌球蛋白的催化交联作用更强。     

来源于Kosakonia radicincitans的新型植酸酶基因通过密码子优化在毕赤酵母中高效表达

将来源于Kosakonia radicincitans的新型植酸酶基因(以下命名为KrPhyS)进行密码子优化,并将其导入到毕赤酵母GS115中进行表达。结果表明:KrPhyS的蛋白分泌量可积累到45μg/mL;该酶的比活力为1.83×10~3 U/mg,最适pH为3.5,最适温度为55℃,在65℃下热稳定性较高,在pH 3.5—7.5时该酶比较稳定。以植酸钠作为底物,EDTA和Mg~(2+)等金属离子对该酶有一定的激活作用;Cu~(2+)等金属离子对该酶有一定的抑制作用。该酶还具有良好的抗胃蛋白酶水解的能力。     

Thermotoga petrophila普鲁兰酶基因的异源表达与酶学性质分析

通过生物信息学筛选出来源于超嗜热菌Thermotoga petrophila(DSM13995)的普鲁兰酶基因,以从德国菌种保藏中心购买的基因组作为出发材料,克隆出普鲁兰酶基因TP-pul A;通过二步PCR方法构建含有该嗜热普鲁兰酶基因的载体pET21a-TP-pul A;将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3)中测定其酶学性质。结果表明,TP-pul A为Ⅰ型普鲁兰酶,最适pH值为6.4,最适温度是85℃,半衰期为26.28 h,Na~+、K~+、Ca~(2+)、Mg~(2+)对其酶活性有明显的促进作用,Mn~(2+)、Co~(2+)、AL~(3+)、Fe~(3+)、SDS及EDTA对酶活性有不同程度的抑制作用,Km、Vmax、Kcat及Kcat/Km值分别为0.72 g·L-1、0.004 9 mmol·L~(-1)·s~(-1)、154.63 s~(-1)、214.76 L·g~(-1)·s~(-1)。本研究采用的生物信息学方法比传统的筛菌方法简单方便耗时短,且获得的嗜热普鲁兰酶的热稳定性好、催化效率高、对普鲁兰糖有较强的底物亲和能力,具有良好的应用前景。