茶树CsH1基因结构及其内含子信息分析

利用cDNA-AFLP方法对低温胁迫下茶树基因表达差异进行了分析,获得1个低温特异表达的cDNA片段。为了获取该片段所代表基因的结构信息,在成功克隆其基因全长cDNA序列(GenBank登录号:EU716314)的基础上,设计引物,从茶树品种‘龙井43’的叶片中克隆获得了该基因全长DNA序列,命名为茶树CsH1基因(JF836005)。基因结构分析表明:CsH1基因包含2个外显子和1个内含子,外显子和内含子的剪接符合GT-AG原则,其中2个外显子的碱基序列长度分别为236 bp和608 bp,内含子为388 bp。经序列分析发现该内含子具有启动子及激素调控元件,可能对CsH1基因的特异性表达有调控作用。茶树CsH1基因的结构及其内含子信息为茶树低温特异基因的表达和抗寒途径分子调控提供了序列信息。     

玉米Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定（摘要）

[目的]研究玉米Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1的克隆与鉴定,为研究该基因在玉米逆境信号转导与生长发育中的作用提供参考。[方法]采用电子克隆、RT-PCR、生物信息学方法,从玉米基因组中克隆1个质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因,并鉴定该基因编码产物的跨膜结构预测以及在盐胁迫下的表达模式等信息。电子克隆具体步骤：将水稻质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白OsSOS1的氨基酸序列作为种子序列输入GenBank,对玉米基因组数据库和EST数据库进行tBLASTN分析,结果检索到含有候选基因的基因组序列AC186524和1批高度相似的玉米EST。为确定候选基因的编码区,将上述EST序列进行拼接,并将拼接所得的contig通过BLASTN分析定位到基因组序列AC186524中。为获得完整的编码区序列,利用与contig间隔区相对应的水稻OsSOS1蛋白的氨基酸序列,进一步对玉米基因组序列进行tBLASTN分析;同时,结合GENSCAN软件的基因预测结果,最终确定了候选基因的编码区序列。最后,通过比较编码区序列和基因组序列,确定ZmSOS1基因的外显子和内含子结构。[结果]利用电子克隆方法,从玉米中克隆出1个质膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白基因ZmSOS1（编码序列反向互补于AC186524中的78 964～96 731 bp处）;ZmSOS1基因的开放阅读框长3 411 bp,编码1 136个氨基酸的蛋白。ZmSOS1蛋白的理论等电点pI=6.46,分子质量为126.2kDa,理论半衰期大于10 h,不稳定参数为41.74,属于不稳定蛋白。通过在线软件TMHMM2.0和TMPRED分析,发现ZmSOS1蛋白含有12个跨膜结构区,且有一个长的高度亲水性的羧基端尾巴,暗示质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白在进化上是较为保守的。ZmSOS1基因至少含有21个内含子,如果将ZmSOS1基因的结构分别与水稻、拟南芥和苔藓植物（Phycomitrella patens）的同源基因OsSOS1、AtSOS1、PpSOS1相比较,可以发现质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因编码区的结构是比较保守的且研究发现质膜型Na^＋/H^＋逆向转运蛋白基因在进化过程中很可能发生过内含子丢失事件;序列分析表明,ZmSOS1蛋白与拟南芥和水稻同源物AtSOS1、OsSOS1的氨基酸序列一致性分别为61%和82%,鉴于ZmSOS1的氨基酸序列与同源序列的多重比对,猜想质膜型Na~＋/H~＋逆向转运蛋白在进化过程中,N-端序列可能承受着较为严谨的净化选择压作用,而C-端序列所受净化选择压则相对松弛;RT-PCR分析表明,ZmSOS1基因的表达可以被盐胁迫诱导增强,表明其可能在玉米耐盐性上发挥功能。[结论]ZmSOS1基因可能参与玉米的渗透胁迫反应。     

南江黄羊FSH β亚基基因内含子1序列的测定

利用牛、绵羊等动物FSHβ亚基基因序列设计引物,采用PCR法扩增并测定出南江黄羊FSHβ亚基基因内含子1全序列(GenBank登录号:AY838283)。山羊FSHβ基因内含子1全序列长641bp,A、C、G、T 4种碱基分别占35.73%,13.88%,17.47%,32.92%;A T(68.65%)的含量远高于G C(31.35%)的含量。所测定7个个体的碱基序列完全一致,表明FSHβ基因内含子1的保守性较强。     

草鱼MKLN1基因可变剪接和微卫星序列的多态性

MKLN1基因编码的muskelin蛋白主要通过其羧基端的kelch重复结构域与其它蛋白形成复合物行使功能。通过分析草鱼鳃组织的基因转录谱,发现其中的MKLN1基因存在(CT)15的微卫星序列,通过检测3个不同的草鱼种群,又发现(CT)9、(CT)10、(CT)11和(CT)13 4种多态性序列。通过克隆该段MKLN1基因组序列并与斑马鱼和红鳍东方鲀的MKLN1基因组序列比较,发现克隆得到的草鱼基因序列是由一个内含子和两个外显子组成,共编码144个氨基酸。通过进一步调查不同组织该基因的转录本,发现存在内含子剪接和内含子未被剪接的两个转录本。由于内含子序列未被剪接的转录本在内含子中存在TGA终止密码子,导致MKLN1基因翻译提前终止,翻译产物为失去部分kelch结构域的muskelin蛋白。相对于内含子正常剪接的转录本,没有被剪接内含子的转录本在各种组织中的表达量要明显低得多。简而言之,本研究发现了草鱼MKLN1转录本中的微卫星序列是来自未被剪切的内含子,而未被剪切的内含子导致该转录本编码部分kelch结构域缺失的muskelin蛋白。研究亮点:目前对于可直接锚定功能基因的I型微卫星标记研究很少。本文首次发现M...     

斑鳜胃蛋白酶原C及其5'侧翼区的克隆及序列特征分析

采用RT—PCR和RACE等技术克隆了斑鳜（Sinipercascherzeri）胃蛋白酶原C（pepsinogenC,PGC）的cDNA全长和部分DNA序列,结果表明：PGCcDNA序列全长1505bp,5’端非翻译区37bp,3’端非翻译区304bp,开放阅读框架（ORF）1164bp,共编码含有387个氨基酸的蛋白质,包括由16个氨基酸组成的信号肽、39个氨基酸的激活肽和332个氨基酸的成熟肽。斑鳜PGC氨基酸序列与斜带石斑鱼、伯氏豚虾虎鱼、狼鲈、美洲红点鲑4种鱼的相似度分别为92．0％、91．5％、90．2％、89．1％,与非洲爪蟾、鸡、人、兔、褐家鼠的序列相似度分别为76．8％、72．8％、72．5％、69．9％、67．3％,表明PGC基因在长期的进化中较为保守。PGC基因由9个外显子和8个内含子组成,内含子剪切位点符合GT—AG规则,在第7含子中发现（GACA）6、（CA）6类型的微卫星序列,第8内含子中发现（TG）,类型的微卫星序列。采用锚定PCR方法获得了PGC5’侧翼区长1924bp的序列,启动子区域位于-40～＋10bp,包含TATA盒以及GATA-1、CdxA、Hand1／E47、AP-1、Nkx-2、S8、FOX J2等转录因子的结合位点。结果为进一步研究该基因的表达、功能及其转录调控特征奠定了分子基础。     

水牛α-乳清蛋白基因的克隆及序列分析

根据报道的奶牛α-乳清蛋白基因核苷酸序列设计和合成4对引物,采用PCR扩增的方法克隆并测定了水牛α-乳清蛋白全基因的核苷酸序列.结果表明,克隆的水牛α-乳清蛋白基因全长3 038 bp,包括5′侧翼区,3′侧翼区,3个内含子和4个外显子(该序列已被成功提交到GenBank,序列接收号为EU422984).核苷酸序列比对结果表明,水牛α-乳清蛋白基因与报道的奶牛该基因的核苷酸序列同源性为97.53 %.水牛α-乳清蛋白成熟肽的氨基酸序列与奶牛相比有两个氨基酸的差异.与奶牛相比,水牛α-乳清蛋白基因5′调控区发生了多处插入突变和碱基替换突变,这些插入和替换突变可能与水牛乳汁中α-乳清蛋白的高水平表达有关.     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

两种鲷属鱼类线粒体COI基因片段序列的比较

利用通用引物成功扩增了黄鳍鲷和黑鲷的线粒体细胞色素氧化酶Ⅰ亚基（COI）基因序列。通过序列测定，得到581bp的基因片段，碱基A、T、G、C平均含量分别为25．8％、32．6％、18．0％和23．6％，序列中的A＋T含量明显高于G＋C含量，与其他鱼类的C01基因片段研究结果相一致。通过序列分析发现黄鳍鲷和黑鲷两序列共存在14处碱基变异，其中在第19～139bp之间检测到13个变异位点，是变异频率较高的区段，可以考虑作为鲷属或者种群鉴别的分子标记。与黄鲷、真鲷、三长棘真鲷等鱼类比较，无插入和缺失位点，转换明显高于颠换。序列差异比较结果显示，真鲷与黄鳍鲷的序列差异在这5种鱼类中最大，达到了18．2％，黄鳍鲷和黑鲷的筹异最小（2．4％）。两个序列已提交到GenBank数据库中．序列臀录号为DQ185608和DQ185609.     

天冬氨酸激酶(AK)编码基因的克隆及其序列分析

用PCR方法从谷氨酸棒杆菌突变株ZL9601基因组中扩增获得了天冬氨酸激酶(AK)编码基因,并对该基因编码区(1263bp)进行了序列分析。结果表明：本文扩增的AK基因编码与文献报道的序列基本一致,通过与不同作者克隆的AK基因序列进行比较,同源性最高达99．7％,最低达97．2％。这些碱基的差异均表现为碱基取代,多数碱基取代未引起编码氨基酸的改变,仅有少数碱基取代导致编码氨基酸的变化。由此可见,谷氨酸棒杆菌AK基因的碱基序列存在着多态性。     

水稻纹枯病病菌β-微管蛋白基因克隆及其与多菌灵抗药性的关系

测定湖北省不同地区水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感性,结果发现,抗性菌株的抗药性水平不高。根据常见植物病原真菌β-微管蛋白基因设计引物,从水稻纹枯病病菌对多菌灵的敏感和抗性菌株中扩增β-微管蛋白基因,均获得了大小为695 bp的基因片段,其中含有1个53 bp的内含子,与粗糙脉孢菌具有较高的同源性。序列分析结果表明,水稻纹枯病病菌抗性菌株β-微管蛋白基因的第271、第453、第612位碱基发生了突变,分别由T、T、T突变为G、C、C,但这3个位点相对应的氨基酸却没有发生变化。此外,内含子的第15位碱基由G突变为A。由此可见,水稻纹枯病病菌对多菌灵抗药性的产生与β-微管蛋白基因的变异有一定的关系。     

Cloning One CIPK Gene from a Thermo-Sensitive Genic Self-Incompatible Line in Maize Expressing Under Different Temperatures

A calcineurin B-like protein-interacting protein kinases (CIPK) gene was cloned (EU 424058) from a thermo-sensitive genic self-incompatibility (TSGI) line, HE97, in maize, which was selected for suppression subtractive hybridization (SSH) library of the self-incompatible and self-compatible silks of the TSGI line under different temperatures. The full-length cDNA of the candidate CIPK-like gene consisted of 1 918 nucleotides and contained a 1 332-bp open reading frame in maize. Real-time PCR indicated that the candidate CIPK-like gene was highly expressed in the self-incompatible pollen of the TGSI line, and promoted elevated levels of calcium (Ca2+). High Ca2+ concentrations in the pollen strongly inhibit pollen tube formation in silk of the same plant, thus inducing self-incompatibility (SI) under high temperature. These results implied that the CIPKs-like gene would play an important role in the regulation of HE97 characteristics under different temperatures, perhaps acting as a secondary messenger in the expression of SI in the TGSI line in maize.     

逆转座子LINE-1在基因组中的调控作用

近年来研究发现真核生物基因组中的许多重复序列以及基因的内含子参与基因表达的调控。在这些重复序列中,有一种广泛分布于基因组中的逆转座子LINE-1,目前发现其对细胞的增殖与分化以及肿瘤的发生起着非常重要的作用,具体表现为影响基因的转录及整个基因组的稳定性、参与X染色体失活及基因组进化等。在正常细胞的分化调控中,基因的激活与沉默具有时间与空间的特异性,实现其“预定”的、有序的、不可逆转的分化过程。主要阐述了逆转座子LINE-1的结构特征和其在基因组中的调控作用及这些作用影响基因表达从而调节生物体的生命活动。研究LINE-1的调控机制对认识细胞的时空调控以及癌症的发生与发展具有重要的价值。     

长沙地区南瓜的小西葫芦黄花叶病毒检测及其分子进化分析

对长沙地区160份南瓜疑似病毒病样品进行小西葫芦黄花叶病毒(Zucchini yellow mosaic virus,ZYMV)检测,检出率达46.9%。为进一步明确长沙地区ZYMV分离物的分类地位和分子进化特征,克隆获得了1个长沙地区ZYMV外壳蛋白基因,与Gen Bank已报道的ZYMV外壳蛋白基因比对,并进行基因重组、系统发生、遗传差异、选择压力、种群结构和基因漂流分析。结果显示:长沙地区ZYMV外壳蛋白基因没有发生明显的重组,突变与负选择作用是其进化的主要驱动力,种群结构相对稳定,但正处于扩张的趋势中;ZYMV不同分离物外壳蛋白基因形成3个有明显地理相关性的美洲、欧洲和亚洲种群,美洲和欧洲种群与亚洲种群之间基因交流不频繁,可能受到遗传漂变的影响,而欧洲种群与亚洲种群之间基因交流较频繁。     

草菇VEGF信号通路中vv-SPK基因的结构与表达分析

VEGF通路是一条调控细胞增殖、分化、迁移、应激反应以及生存的信号通路。本研究从草菇基因组中获得1个在VEGF通路中编码SPK蛋白的基因,将其命名为vv-SPK,并对该基因进行结构分析,结果显示:基因vv-SPK全长1 996bp,包含11个内含子;ORF长为1 401bp,编码466个氨基酸。通过BLASTP比对显示,vv-SPK基因与纹缘盔孢伞、双色蜡蘑以及紫蜡蘑的相似度最高;经过荧光定量PCR验证后发现,SPK蛋白的基因表达量与菌柄的伸长有关。根据SPK在VEGF通路中参与的细胞增殖途径以及SPK蛋白本身的激酶特性,推测其对草菇菌柄生长过程的细胞分裂和伸长有显著的促进作用,且草菇中可能存在SPK激酶介导的促进细胞增殖、伸长的信号通路。     

扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因的克隆与生物信息学分析

钙调蛋白(calmodulin,CaM)对生物体内多种Ca2+依赖的细胞功能和酶体系都有重要的调节作用。为研究扶桑绵粉蚧的信号转导受体蛋白,首次克隆了扶桑绵粉蚧钙调蛋白基因PsCaM的cDNA全长序列,其开放阅读框(ORF)包含447bp的片段,编码148个氨基酸。PsCaM基因由3个内含子和4个外显子组成。3个内含子的长度分别为73、81、72bp,分隔的4个外显子的长度分别为33、133、183、98bp。功能域分析结果显示:该蛋白具有2个EF-hand结构域,有13个Ca2+结合位点;该蛋白的理论等电点是6.21,属于稳定蛋白,且没有跨膜区域;通过同源建模获得了其蛋白的三维结构。多序列比较显示,PsCaM基因相对较保守。     

蕨麻猪生长激素基因的克隆及多态性分析

[目的]探索蕨麻猪生长激素基因与其生理学和生物学特性的关系。[方法]从蕨麻猪血液细胞中提取基因组DNA,通过PCR技术扩增出蕨麻猪生长激素基因序列,进行碱基组成多态性和突变分析。[结果]蕨麻猪生长激素（pGH）基因序列全长1671bp,有5个外显子和4个内含子。外显子1、2、3、4和5的碱基数依次是10、161、117、162和201bp,内含子1、2、3和4的碱基数分别是244、210、192和277bp。除第1外显子和第1内含子碱基剪切有明显的例外,其余全部符合GT-AG规则;蕨麻猪生长激素基因4种碱基含量依次为G〉C〉T〉A。（G＋C）含量和（A＋T）含量分别在62%和37%以上。蕨麻猪编码区第4外显子在＋1046位处A→G,为错义突变,其余均为同义突变。蕨麻猪生长激素基因编码的前体蛋白含216个氨基酸,成熟蛋白是由190个氨基酸残基组成的一个分泌性蛋白;二级结构中含有6个α螺旋结构,三级结构是结构松散的球状蛋白,含有6个α螺旋前区。[结论]为蕨麻猪生长激素基因序列的研究提供了参考依据和借鉴。     

黄瓜CSHSP70基因内含子结构分析

 【目的】探明黄瓜CSHSP70基因的内含子数目及其结构特点。【方法】根据黄瓜CSHSP70基因cDNA序列设计引物，应用PCR技术从gDNA中克隆CSHSP70基因，采用RT-PCR技术验证内含子的存在。【结果】经测序与拼接，得到长度为4 056 bp的黄瓜CSHSP70基因，它包含7个内含子。经分析发现这些内含子富含A•T，具有类似启动子和HSE核心结构的序列存在。对黄瓜、甜瓜和丝瓜CSHSP70基因部分序列的比较分析表明，该基因在这3个葫芦科作物中具有很强的保守性。【结论】内含子存在的特殊结构表明其可能对该基因表达具有调控作用。     

青花菜钙依赖蛋白激酶基因BoCDPK1的克隆与表达

钙依赖蛋白激酶(calcium-dependent protein kinase,CDPK)为Ca²⁺传感蛋白,在植物生长发育和逆境响应中起着重要作用。在克隆青花菜BoCDPK1基因的基础上,开展序列分析、系统发育分析和表达分析,为后续的基因功能鉴定和抗逆育种奠定基础。该研究以青花菜为材料,利用PCR法克隆1个CDPK 基因,利用生物信息学对序列进行分析,并采用qRT-PCR研究该基因在霜霉菌和核盘菌侵染下的表达模式。测序结果表明,BoCDPK1的基因组DNA全长为2 414 bp,具6个内含子,编码区全长为1 647 bp,编码548个氨基酸;BoCDPK1有1个S_TKc和4个EF手性结构域。多序列比对结果表明,BoCDPK1与芸薹属植物同源序列的相似性最高,仅个别氨基酸残基存在差异,它们在系统发育树上聚于一组。qRT-PCR结果表明,BoCDPK1的表达受霜霉菌和核盘菌的诱导,表达量均呈现先上升后下降的规律。在霜霉菌的诱导下,BoCDPK1的表达量在72 h达最大值,为对照的3.4倍;而在核盘菌侵染下,BoCDPK1的表达量在36 h达最大值。该研究明确了青花菜BoCDPK1基因的序列特点、系统发育关系和表达特征。     

胡葱黄条病毒外壳蛋白的原核表达与抗血清的制备

设计特异性引物PCR扩增得到胡葱黄条病毒(SYSV-O)的全长外壳蛋白(CP)基因,构建原核表达载体pET32a-SYSV-O CP,转化大肠杆菌诱导表达。结果表明,SYSV-O CP基因在大肠杆菌中得到了高效表达,分子量约为46 kDa。用纯化表达产物免疫小鼠制备抗血清,Western blot检测结果表明,抗血清与SYSV-O的CP发生了强烈的特异性反应。使用该抗血清进行了田间样品的带毒检测。