草莓乙烯受体FaEtr2基因植物表达载体构建

为通过转基因技术改善草莓的贮运性能,以全明星草莓为试材,克隆了与草莓成熟有关的FaEtr2基因的2个片段,并构建了该基因的反义和正义植物表达载体。根据已克隆的草莓乙烯受体FaEtr2基因序列及表达载体pBI221上的酶切位点设计2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个全明星草莓FaEtr2基因片段。两片段经双酶切消化后分别以正、反两个方向插入到植物表达载体pBI221的35 S启动子和NOS终止子之间,分别构建成All Star-FaEtr2基因的正、反义植物表达载体。     

非洲紫罗兰的组培快繁技术研究

通过正交试验和单因素试验对非洲紫罗兰的叶片组培快繁技术进行了探讨。结果表明：初代培养基为MS+6-BA1.0mg/L(单位下同)+IBA0.5;诱导丛生芽的适宜培养基为MS+6-BA1.0 +KT0.1 +IBA0.1;有效苗诱导培养基为MS+6-BA0.5+IBA0.5+活性炭0.3%。试管苗生根采用瓶外扦插生根效果较好。     

OsI2基因的克隆及其植物表达载体的构建

在旱稻IRAT109干旱胁迫下cDNA芯片分析结果的基础上,通过RT-PCR,5'-RACE及3'-RACE方法,从IRAT109总RNA中扩增得到了干旱胁迫下芯片表达谱中上升表达强度第二的基因全长序列,命名为OsI2,全长有523 bp,并对基因序列结构进行了分析.该基因与全长cDNA文库中的CT836140.1有99%同源.OsI2基因编码产物对应1个包含57个氨基酸的开放阅读框(ORF),为一功能未知蛋白.其编码产物也可能对应两个中间相隔19 bp的较小ORFs(43个氨基酸和42个氨基酸),都是功能未知的蛋白.在pBI121载体的基础上,将OsI2基因与CaMV35S连接成功构建了pBl121-OsI2植物表达载体,为进一步研究其功能创造了条件.     

绿竹cab-BO2基因的克隆及其表达载体的构建

捕光叶绿素a/b结合蛋白基因是绿色植物光合系统中的重要基因,其编码的蛋白与色素所形成的蛋白复合体在光化学反应、光保护等方面都起着重要的作用.采用RT-PCR技术和与RACE-PCR技术,从绿竹中克隆到捕光叶绿素a/b结合蛋白基因的全长cDNA编码区,命名为cab-BO2(GenBank登记号:EF088668).该基因编码区长为792 bp,编码263个氨基酸.通过加酶切位点的方法,将基因的编码区直接构建到载体pBI121多克隆位点.经过酶切检测,获得了包含35S启动子、cab基因、GUS报告基因和NOS终止区域的植物表达载体.     

牡丹ACS基因片段的克隆及反义植物表达载体构建

根据GenBank登录的牡丹ACS基因DNA全长序列(FJ769773),设计一对特异性引物,在优化的PCR扩增体系的基础上,应用高保真DNA聚合酶KOD-Plus从洛阳红牡丹叶片总DNA中扩增出牡丹ACC合成酶基因片段PsACS-4。测序结果表明:克隆序列长970 bp,不包含牡丹ACS基因内含子序列,与目标序列同源性达100%;用SacI和SmaI对重组质粒和空载体pBI121双酶切、连接,将PsACS-4基因片段反身插入到植物表达载体pBI121的35S启动子下游,成功构建了牡丹ACS反义基因植物表达载体。     

家庭养花小三防

非洲紫罗兰极容易用植物组织培养法繁殖。只要取一片叶进行组培,50天左右就可以得到组培苗,再继续培养50天,就可以得到数以千万计的组培苗。只要栽培得法,组培苗移植3～4个月即可开花,所以一般花卉爱好者只要买几瓶不同颜色的组培苗,自己在家移植培养,就可以开个家庭非洲紫罗兰展览会了。     

美洲黑杨CCoAOMT基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

据已报道的CCoAOMT(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)基因的eDNA序列设计一对兼并引物,从美洲黑杨当年生嫩枝的次生木质部中提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得约750 bp的特异性扩增产物.测序结果显示,克隆的序列与GenBank中注册的CCoAOMT基因cDNA同源性最高达99%.该基因的cDNA序列已在GenBank上登录(登录号:EF153198).将克隆的美洲黑杨CCoAOMT基因的cDNA序列反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,成功构建了美洲黑杨CCoAOMT基因的反义表达载体pBI-CCoAOMT,为进一步通过反义技术降低杨树木质素含量奠定了基础.     

丹参钙调蛋白cDNA的克隆及其反义表达载体的构建

丹参是著名的传统中药,对心血管疾病和癌症有广泛的疗效。钙调蛋白是细胞信号转导途径中的重要蛋白,在各种生理活动中起着重要的作用,其序列比较保守。国内外对中药丹参的分子学研究很少,本文利用分子生物学手段克隆了丹参钙调蛋白基因。从丹参成熟叶片中提取总RNA,cDNA第一链经反转录合成,利用设计的引物,PCR扩增,得到丹参钙调蛋白基因,测定其全序列。在GeneBank进行了注册。其次构建了丹参钙调蛋白基因反义表达载体,以后可进行基因敲除。通过Southern杂交,进行拷贝数推测,丹参钙调蛋白cDNA至少为2个拷贝。序列分析结果表明:得到的丹参钙调蛋白基因具有完整地读码框,由454个核苷酸组成,编码150个氨基酸。与别的植物钙调蛋白基因相比有很高的同源性,核苷酸序列同源性在80%以上,编码的氨基酸序列同源性在80%以上。以上结果能使我们更加深入地研究和了解钙调蛋白。     

棉花GhMADS12基因的克隆及其表达载体的构建

MADS-box基因是真核生物中一类重要的转录调控因子,调节着植物根、茎、叶到花的发育和果实的成熟。本研究以中棉所36花发育期均一化全长cDNA文库为基础,分离出一个棉花的MADS-box基因全长cDNA命名为GhMADS12。同时利用pBI121双元载体成功构建了GhMADS12基因的植物过表达载体,并利用基因枪轰击法瞬时表达载体,验证了载体的可靠性,为下一步转基因验证基因的功能奠定了基础。     

千代田草莓乙烯受体Etr2基因克隆及序列分析

克隆了与草莓成熟有关的乙稀受体FaEtr2基因片段,为进一步研究FaEtr2基因功能并通过基因技术改善草莓贮运性能奠定基础。以千代田草莓成熟果实中分离到的基因组DNA为模板,经PCR扩增到1条约1．0kb的特异片段,将该片段克隆到pGEM-T easy vector上经测序分析,基全长共1049bp,编号349个氨基酸残基。序列分析结果表明,该序列与Chandler-Etr2的cDNA序列同源性99％、氨基酸序列同源性为98％。     

玉米ZmPT6基因的克隆及RNAi表达载体的构建

采用PCR方法分别从玉米郑单958基因组DNA及RNA中克隆了菌根共生磷酸盐转运蛋白基因ZmPT6,序列分析表明,ZmPT6基因全长cDNA 1 665 bp,包括一个长97 bp的内含子;编码554个氨基酸,属于Pht1家族成员,由12个疏水的跨膜结构域组成.并构建了35S启动子驱动的植物正义、反义及RNAi表达载体,为下一步玉米的遗传转化及ZmPT6基因的功能研究奠定了基础.     

上西早生柿ETR5基因片段的克隆与植物表达载体的构建

从上西早生(Uenishiwase)柿叶片中,提取了基因组DNA。以基因组DNA为模板,经PCR扩增,克隆到一个549 bp的ETR5的DNA片段。序列分析表明,上西早生柿基因与洋梨ETR5的核苷酸同源性为79.0%,氨基酸同源性为81.0%;并且含有其他植物ETR5的保守氨基酸区和不变氨基酸残基,表明克隆到的序列是上西早生柿ETR5的基因片段。设计了2对带限制性内切酶位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增到2个ETR5-Uenishiwase片段。2个片段经单酶切消化后连接成反向互补的大片断。连接片断经双酶切消化后,连接到植物表达载体pBI221上,构建成Uenishiwase-ETR5基因的植物表达载体。     

草果AtNCED基因克隆、表达和植物表达载体构建

9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶(9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase, NCED)是ABA生物合成的限速酶。诸多研究表明NCED基因表达量的变化与ABA含量显著相关,在种子休眠过程中发挥重要作用。为探究草果AtNCED基因的序列特征和功能,本研究以草果(Amomum tsaoko Crevost et Lemarie)种子转录组为基础,采用RT-PCR技术克隆了一个AtNCED基因。该基因全长2 372 bp,包含一个1 830 bp的开放阅读框(open reading frame, ORF),编码610个氨基酸。生物信息学分析显示,AtNCED基因编码的蛋白在N-末端包含典型的叶绿体转运肽序列,在催化结构域含有4个高度保守的组氨酸残基。AtNCED蛋白与芭蕉科马来西亚蕉同源性较高,与其他单子叶植物处在同一进化分支。实时荧光定量PCR分析结果表明,AtNCED基因表达量随着层积时间的增加逐渐下降,该基因可能正向调控种子休眠,在草果种子休眠诱导与维持中发挥重要作用。进一步地,利用同源重组方法,成功构建了pBI121-AtNCED过表达载体,并转化至农杆菌EHA105。该研究结果为弄清ABA激素信号在种子休眠中的调控作用提供了帮助。     

独行菜CBF基因的克隆及其植物表达载体的构建

本实验以新疆早春短命植物独行菜(Lepidiumapetalum Willd)为主要材料,利用聚合酶链式反应从独行菜中克隆了CBF( C-repeatbinding factor)基因家族中的CBF 3基因和CBF4基因,并将其成功构建到带有35 S+Ω的植物表达载体pCAMBIA 2300中,为进一步转化拟南芥以了解独行菜CBF基因的结构和功能奠定了基础.     

AtFT基因植物表达载体的构建研究

FT是从拟南芥克隆得到的诱导植物开花调控基因。利用FT基因表达特点,克隆拟南芥FT基因片段,重组构建了以CaMV35S为启动子、GUS为报告基因的植物表达载体pCAMBIA2301-FT与pCAMBIA2300-FT:GUS,并采用农杆菌介导法转化橡胶树体细胞胚,通过GUS组织化学染色观察橡胶树体细胞胚瞬时表达情况,结果验证了重组构建的2个载体的有效性,为进一步研究FT基因在橡胶树中的功能及应用奠定基础。     

拟南芥DREB2A基因的克隆及植物荧光表达载体的构建

以拟南芥幼苗总RNA为模板,采用RT-PCR技术扩增到DREB2A基因,并将其克隆到植物表达载体pCAM-BIA1304中CaMV 35 S启动子与poly(A)终止子之间。酶切鉴定及测序列结果都表明,成功构建了植物表达载体pCAMBIA1304-DREB2A。另外,获得了携带DREB2A基因的根瘤农杆菌菌株,为以后转基因植物工作奠定了基础。