草菇基因文库的构建(英文)

应用基因重细技术,我们建立丁一个草菇总DNA的部分基因文库。通过限制性内切酶Sau 3AI部分酶切纯化的草菇总DNA,得到小于4kb的DNA片段。这些DNA片段插入到经Bam HI酶切及碱性磷酶酯酶处理的pUC18质粒,转化感受态细胞DH5α。在此研究中。我们比较了两种转化方法(氯化钙转化法和电转化法)的转化效率,电转化法的转化效率高于氯化钙转化法数千倍,达到2×10(2)CFU/μg DNA。在此实验中DNA重组率是64%,这个草菇总DNA的部分基因文库由8000个克隆组成,平均每个克隆含有1.5kb的草菇DNA。此基因文库含有15%的草菇总DNA。可作为分子标记用于DNA指纹图谱分析及作为遗传学标记用于RFLPs的遗传图谱分析。     

食用真菌基因工程实验技术(连载)

实验(三)琼脂糖凝胶电冰检测总DNA分子量构建基因组文库,首先必须制备分子量大于50kb(千碱基对)的总DNA,且要求DNA的纯度达到可被限制性内切酶(Restriction endonuclease,简称RE)酶切的水平。本实验采用水平式琼脂糖凝胶电泳(Agarose gel electrophoresis)法检测实验(二)提取到的平菇总DNA的纯度、浓度与分     

食用真菌基因工程实验技术（连载）

目前流行的基因工程实验技术,是把某种外源基因或DNA序列,通过离体的DNA重组分子转导技术,重组到受体细胞基因组中,使其独立地在受体细胞中复制表达,并通过无性或有性生殖过程将外源基因遗传给后代,以达到操纵生物体经济性状的目的。这种DNA重组技术(Recombiant DNA Techniques),即基因工程(Gene Engineering)或称遗传工程(Genetie Engineering),也有人称之为基因克隆(Gene Clong)或分子克隆(Molecular Clone)。上述基因工程与遗传工程的含义并不完全相同,后者的概念更广泛。基因工程特指在分子水平上对遗传结构进行修饰或重组的生物工程技术。当其用于遗传育种时,可称之为遗传工程。但遗传工程既可以是分子水平的基因工程,也可以是细胞水平的生物工程技术,为原生质体融合或组织培养等。近年来,国内生物工程研究在食用真菌领域中,原生质体融合技术报导较多,但构建食用菌基因文库(Genome Library)等DNA重组技术尚未见报导。本文是笔者1988—1991年从(一)制备原生质体;(二)提取高分子量平菇总DNA;(三)琼脂糖凝胶电泳检测总DNA分子量;(四)选择载体;(五)总DNA的部分酶切;(六)蔗糖密度梯度超离心;(七)包装抽提物效价的测定;(八)连接包装转导,构建平菇基因文库等八个方面实验的总结报告。     

草莓镶脉病毒的PCR检测及特异片段的序列分析

用CTAB法从感病的草莓叶片中提取总DNA,以其为模板经PCR扩增获得与预期片段大小一致长约600bp的扩增产物,同时优化PCR反应程序,获得单一特异条带;通过总DNA浓度梯度稀释,进行PCR扩增,结果表明能检测到2.5μg叶组织中病毒的存在。回收PCR特异扩增产物,与pMD18-T载体连接,并进行转化、重组克隆的筛选、重组质粒的酶切鉴定和序列测定。扩增片段序列与已报道SVBVCP基因序列(序列号:Nc_001725)的核苷酸同源性为89.2%,氨基酸同源性为96.3%。该特异片段序列在GenBank中的登记号为AY862389。     

平菇基因组文库的构建

结果1.高分子量平菇总 DNA的提取(1)每升培养物恒温摇培(25℃,125 rpm)5天,得平菇菌丝体12g,采用原生质体裂解法得平菇总DNA100mg 左右。(2)平菇菌丝体经Lywallzyme 酶解破壁和裂解缓冲液作用后,用 SS一酚/氯仿/异戊酵抽提(至少3次)去除蛋白质等杂质,经酒精沉淀后得总 DNA。抽提过程中避免剧烈振荡,可使总 DNA 的分子量大于50kb。     

脐橙基因组DNA文库的构建

研究构建了一个脐橙基因组DNA文库。以‘大山岛’脐橙幼叶为试材 ,CTAB法制备基因组DNA ,经CsCl密度梯度离心纯化 ,获得了大片段 ( >10 0kb)高纯度基因组DNA。以Sau3AI部分酶切 ,酶切片段 3’凹端不完全补平后与LambdaGEM 12XhoIHalf SiteArms连接 ,连接产物用Packagene Extract包装 ,所得噬菌体在KW2 51寄主上铺平板。文库经过扩增并保存。对该文库特性研究表明 ,该文库包含了 2 .15× 10 6个单个克隆 ,背景低于10 0pfu/ μgDNA ,插入片段平均大小约为 17kb ,证明是一个较为完整的脐橙基因组DNA文库。     

食用真菌基因工程实验技术(连载)

实验(八) 连接包装转导,构建平菇基因文库有了足够的外源DNA片段、载体DNA和包装抽提物,应进行一系列连接包装测试,以确定产生最大量可包装分子(Recombinant DNA)的载体与外源片段的比例,为大量连接和包装提供依据。然后,进行正式连接、包装和平板转导试验,获得构成基因文库的重组克隆,即构建基因文     

韧皮部特异启动子驱动密码子优化的抗菌肽D基因的植物表达载体构建

根据177个GenBank中登录的柑橘编码蛋白密码子用法的分析结果,优化并重新设计和合成了含柑橘偏爱密码子、对柑橘黄龙病有杀灭作用的柞蚕抗菌肽D基因(命名为CAPD),克隆入pUC19克隆载体并经测序验证后,获得了含新抗病基因的重组质粒pUC19-CAPD。用限制性内切酶BamHI和SacI双酶切pUC19-CAPD克隆载体和pBI121植物表达载体的质粒DNA,回收pUC19-CAPD克隆载体中的CAPD基因小片段和pBI121植物表达载体中去掉GUS报告基因的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由CaMV35S组成型启动子(35SP)驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ05);用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切含笋瓜韧皮部特异启动子(PSP)的pUCm-PSP克隆载体和pHZ05植物表达载体的质粒DNA,分别回收pUCm-PSP克隆载体中的PSP小片段和pHZ05植物表达载体中去掉CAPD目的基因上游35SP的大片段,经连接、转化和鉴定后,构建了由PSP驱动CAPD目的基因的新植物表达载体(命名为pHZ06)。利用细胞感受态法直接将2个由不同启动子驱动的含CAPD目的基因的新重组植物表达载体分别导入根癌农杆菌LBA4404、GV3101、EHA105和发根农杆菌Ri15834等4个农杆菌菌株中,为利用农杆菌介导的遗传转化技术培育抵抗由韧皮部传导的毁灭性和检疫性病害柑橘黄龙病的新种质奠定了基础。     

甜瓜蔗糖磷酸合成酶基因全克隆及工程载体的构建

蔗糖磷酸合成酶在甜瓜果实蔗糖合成途径中起关键性的调节作用,克隆该基因并导入甜瓜低糖自交系,可改良甜瓜果实品质创新优良种质。从甜瓜幼苗叶片提取总RNA,利用RT-PCR与Southern blot方法相结合,重组子质粒经限制性内切酶酶切和PCR验证以及测序同源性比较,克隆到基因的5’(2859bp)和3’(852bp)。应用高保真Taq聚合酶PCR拼接蔗糖磷酸合成酶完整cDNA序列3692bp,该片段与GenBank中其它植物基因序列具有97%￣99%的同源性,登录号DQ364058。应用BamHⅠ、KpnⅠ、BglⅡ限制性酶切获得植物双元表达载体pROK2及基因的线性片段,通过T4连接酶反应,构建了以CaMV35S为启动子,以Tnos为终止子的工程载体pROK-SPS,该载体含有Npt-II选择标记基因。     

欧洲山杨一号染色体显微分离、原位杂交分析及特异文库的构建

 以欧洲山杨( Populus tremula) 根尖细胞为材料, 采用玻璃针分离法, 通过显微操作器成功地分离出一号染色体。将分离到的单条染色体去蛋白、Sau3A酶切, 并在染色体DNA片段两端加上Sau3A人工接头, 进行两轮PCR扩增, 得到了200～3 000 bp的DNA扩增片段。以DIG2dUTP标记的欧洲山杨基因组DNA为探针进行Southern杂交, 结果表明显微分离出的染色体扩增片段与欧洲山杨基因组DNA同源,从而证明一号染色体DNA确实已被成功地扩增。以一号染色体第2轮PCR产物为探针进行荧光原位杂交,发现荧光信号较密集的分布于一号染色体, 但同时荧光信号也出现在其它染色体的着丝粒及端粒区域。对第2轮PCR产物进行克隆, 构建单条染色体DNA文库, 经分析, 该微克隆文库包含约3 ×10⁵ 个重组子。随机挑选160个重组子进行鉴定, 证明该文库的插入片段主要介于230～2 200 bp之间, 平均800 bp。该文库的构建为欧洲山杨1号染色体特异探针的筛选、遗传图谱的构建、重要基因的克隆等研究奠定了基础。     

孢粉学在部分梨属植物分类研究中的应用

通过扫描电子显微镜、配合光学显微镜对杜梨、木梨、褐梨、豆梨4个野生种,白梨、砂梨、秋子梨、西洋梨、新疆梨5个栽培种的花粉、花药的大小、形状、表面纹饰和特征进行了较为细致的观察、研究,并进行了种间、品种间的比较。     

高等担子菌《种》的鉴定问题

本文扼要地讨论了高等担子菌种的基本概念。拮抗线对鉴别高等担子菌的可能性。综述了从形态学、生物化学、遗传学等及三个范畴划分种的标准。     

竹荪深层发酵产物的毒性及降血脂作用分析

竹荪深层发酵菌丝体的急毒、亚毒及降血脂动物实验表明，该产物对机体无毒性作用，可明显降低血清总胆固醇浓度（Ｐ＜０．０５）。     

菊花品种间杂交若干性状在F1代的表现

1987—1988年,以16个菊花品种配制成12个杂交组合,研究了花、茎、叶的若干性状在F_1代的表现。结果表明,1.所有被研究的性状在F_1 代都发生了广泛的分离,这意味着无性繁殖使亲本品种保持着高度的杂合性;2. F_1杂种的花色具有倾母遗传;3.花序大小、小花数目和茎粗性状,在F_1代均表现衰退。杂种的平均数降低,但因变异幅度大,仍有超亲个体存在。     

银耳菌丝体的形态与银耳母种制备研究

用孢子分离，基内分离的方法获得纤细的银耳次生菌丝、节饱子和原基银耳次生菌丝还以白毛团，白色谷粒、基内菌丝和绒毛的形成存在。银耳菌丝体的形态在一定条件下互相转化。纤维的银耳次生菌丝、基内菌丝、菌龄短的原基组织和绒毛都能与伴生菌混合培养，配制成银耳母种。其中三种形态与伴生菌配制母种未见，只要正确辩识银耳菌丝体的不同形态和菌龄，掌握适宜的条件和技术，不仅简化了银耳的分离方法，而且提高了制作母种的成功率，     

重瓣榆叶梅的绿枝扦插繁殖研究

重瓣榆叶梅(Prunus trilba var.plena Dipp.)是蔷薇科李亚属中的一种落叶花灌木。它具有开花早、花期长、花朵大、颜色纯正鲜艳等特点,是一种观赏价值很高的园林绿化、彩化树种。由于它雌雄蕊退化,不能正常结实,无法用种子实生繁殖,常规的扦插繁殖,成活率极低,无实用价值。在生产上,只能用分株和嫁接方法进行繁殖,但费工费时且繁殖效率很低,使重瓣榆叶梅的苗木生产受到限制。为此,作者自1984年开始进行绿枝扦插试验。 材料与方法 一、材料 插条的采剪。于6—7月,在苗圃内,剪取树龄2—4年生     

梨杂种后代株型和株高的遗传分析

从锦香梨(南果×巴梨)的自然实生后代中选出具有紧凑、矮壮等特点的紧凑型品系S_2、S_3、S_4、S_5、用它们作母本与祖代亲本巴梨回交。S_2×巴梨与S_4×巴梨的杂种后代株型(普通型、紧凑型)的实际分离符合1:1的理论分离值,S_3×巴梨与S_5×巴梨的杂种后代株型实际分离符合3:1的理论分离值,表明株型的遗传方式属于质量性状遗传。S系与巴梨杂种后代株高的遗传变异幅度大,大部分实生苗株高低于低亲和介于双亲之间,属于连续性变异,株高的遗传力小,后代株高基因占表现型的比重小,容易受环境因子的影响,表明株高的遗传方式属于数量性状遗传。