黄瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2克隆与表达调控

肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)是合成棉子糖系列寡糖(RFOs)的关键酶,在植物抵抗非生物胁迫过程中发挥重要作用。为探究GolS2基因在黄瓜应答非生物胁迫中的作用,本研究采用RT-PCR法从黄瓜中克隆了GolS2基因,其开放阅读框长度为981 bp,编码326个氨基酸,植物GolS2蛋白氨基酸序列一致性很高。进化树中,黄瓜GolS2蛋白与拟南芥GolS2和GolS3蛋白聚在同一分支,亲缘关系最近。盐胁迫和低温胁迫处理显著诱导GolS2基因在黄瓜幼苗中的表达,但低温处理显著抑制GolS2基因在采后黄瓜果实中的表达。对其启动子顺式作用元件的分析结果显示,GolS2基因启动子中含有多个与逆境胁迫响应有关的顺式作用元件。在采后黄瓜果实中沉默HHO2和GRP3基因的表达,显著下调GolS2基因表达,表明这两个基因调控GolS2基因表达。本研究结果明确了GolS2基因在不同类型黄瓜组织中应答非生物胁迫的功能存在差异,这为进一步研究该基因的功能奠定了基础。     

大豆肌醇半乳糖苷合成酶基因GmGolS及非生物胁迫表达分析

[目的]本文探索了大豆肌醇半乳糖苷合成酶(GolS)基因与非生物胁迫的关系.[方法]通过RT-PCR从大豆叶片cDNA中扩增编码GolS的基因GmGolS.生物信息学分析预测该基因及编码蛋白的理化性质.构建系统进化树分析GolS蛋白的亲缘进化关系.采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在非生物胁迫下的表达模式.[结果]G...     

烟草肌醇半乳糖苷合成酶基因NtGolS1的克隆及序列分析

为从烟草中克隆到与植物抗逆相关的肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS,以辣椒GolS基因为探针,通过电子克隆法从烟草栽培品种K326中分离出一条编码GolS基因的cDNA序列,暂被命名为NtGolS1.NtGolS1包含一个完整的开放读码框,编码343个氨基酸,具备糖基转移酶保守结构域;序列比对结果表明,NtGolS1蛋白与其他植物的GolS蛋白具有很高的相似性;系统进化树分析表明,NtGolS1与耐旱植物维柯萨的Gols亲缘关系最近.这些结果为进一步研究NtGolS1的性质和功能,并为植物抗逆基因工程研究提供理论基础     

刺齿报春苣苔肌醇半乳糖苷合成酶基因的鉴定及序列分析

肌醇半乳糖苷合成酶基因与植物光合产物运输、种子耐脱水性、抵御生物与非生物胁迫和自我保护等生理生化过程密切相关。基于刺齿报春苣苔(Primulina spinulosa)转录组测序数据,获得(鉴定)1个肌醇半乳糖苷合成酶基因。序列分析结果表明,该基因全长1 347 bp(GenBank登录号为MG521418),开放阅读框(ORF)为1 008 bp,共编码335个氨基酸。进一步基于氨基酸序列的分析表明,该基因编码的蛋白质分子量为38.05 ku,理论等电点为5.09,为亲水性蛋白,含有1个与糖基转移酶家族蛋白相同的保守结构域;刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因与同科的旋蒴苣苔(Boea hygrometrica,FJ222452)的相似性高达90%,两者在系统进化树上聚为1支。研究结果为进一步研究刺齿报春苣苔的肌醇半乳糖苷合成酶基因的分子结构和功能奠定了基础。     

茶叶加工中β-半乳糖苷酶活性变化的研究

不同芽叶中β-半乳糖苷酶活性存在差异,嫩芽叶>老叶>嫩茎。芽叶中的β-半乳糖苷酶活性在摊放2b后上升到最高峰,为鲜叶酶活性的1.2倍;随着摊放时间的延长,酶活性又逐渐下降,8h后酶活性降至鲜叶酶活的85%。揉捻及发酵过程中β-半乳糖苷酶活性呈大幅度下降。微波杀青处理后,β-半乳糖苷酶快速失活,摊放冷却后没有复性。     

畜禽日粮中的α-半乳糖苷以及相应酶制剂的应用

提高畜禽对饲料的利用效率一直是动物营养学非常关注的研究领域,尤其在当前饲料原料比较紧缺的情况下如何提高饲料的利用价值更值得重视.阻碍畜禽对饲料充分利用的一个重要因素是饲料原料中含有多种多样的抗营养因子.这些抗营养因子通过干扰畜禽的正常消化和代谢功能而影响动物生产潜能的充分发挥,降低饲料的利用效率.已经发现在豆类籽实和饼粕饲料中含有较高的α-半乳糖苷.部分研究报告指出α-半乳糖苷是一种抗营养因子.本文综述了近年来对α-半乳糖苷的抗营养作用研究,并且介绍了其相应酶制剂-α-半乳糖苷酶在饲料中的应用效果.     

大豆GmGolS基因的原核表达及抗旱性分析

肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase,简称GolS)是棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides,简称RFOs)生物合成途径中的关键酶,在植物应对非生物胁迫的过程中发挥着重要作用。通过逆转录(RT)-PCR从大豆叶片cDNA中扩增得到编码肌醇半乳糖苷合成酶的基因GmGolS,再将GmGolS基因构建到原核表达载体pET28上,然后将载体导入大肠杆菌Rosetta(DE3)中,对其进行异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalacto pyranoside,简称IPTG)诱导。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis,简称SDS-PAGE)结果表明,在诱导时间为3 h、IPTG浓度为0.1 mmol/L的条件下,可以获得大量重组蛋白,分子量约为40 ku。对表达GmGolS蛋白的大肠杆菌进行抗旱性分析的结果显示,GmGolS基因在大肠杆菌中的过表达降低了重组菌的生活力,使其对干旱胁迫更加敏...     

α-1,3-半乳糖苷转移酶基因沉默载体的构建

根据小鼠α-1,3-GT基因mRNA序列设计并合成了特异性的发夹状RNA干扰序列,以pCDNA3为基本骨架,选取人类H1启动子,构建了针对小鼠α-1,3-GT基因的特异性基因沉默载体,为进一步获得α-1,3-GT基因沉默小鼠,构建异种器官移植用小鼠模型奠定了基础.     

拟南芥光敏色素基因PHYA转化菊花的研究

光敏色素(phytochrome,简称PHY)是植物的重要光受体,拟南芥包含PHYA、PHYB、PHYC、PHYD、PHYE等5个光敏色素基因,它们在植物的生长发育中起着重要作用,光敏色素基因的过量表达通常造成转基因植株株型及光合效率的改变.从拟南芥基因组中克隆了全长PHYA基因,构建了植物表达载体,通过根癌农杆菌LBA4404转化地被匍匐小菊"粉地毯",得到4株PCR反应呈阳性的转基因株系.结果发现,与对照相比,在弱光环境下转基因植株节间变长,叶片瘦长,叶柄变长;在露天栽培条件下,转基因株系的叶片变大,叶片着生密,节间变小,株型明显矮化.转基因株系的另一明显表现型是花期显著提前,转基因植株的花色也由粉色变为黄色,拟南芥PHYA基因的过量表达同时也影响了地被小菊生长发育的诸多方面,为PHYA基因在植物基因工程中的应用提供了借鉴.     

拟南芥含双MATH结构域基因AtSb3基因表达的组织定位研究

摘要：MATH结构域即安眠蛋白与TRAF-C端同源结构域(Merprin and TRAF-C homology domain),由7-8个反向平行的β-折叠组成。AtSb3是拟南芥中一个编码双MATH结构域蛋白的基因,其功能未知。本研究在构建AtSb3基因启动子与GUS融合载体并获得拟南芥转化子的基础上,利用半定量RT-PCR的方法和组织化学染色方法对AtSb3基因在拟南芥中的表达进行了研究。结果表明：在茎、叶、花和果荚中均检测不到AtSb3的表达,而在根中检测到AtSb3的表达。GUS组织化学染色结果显示：在刚萌动的种子中,AtSb3主要在胚根部位表达,其它部位不表达;在种子萌发后的子叶展开期,AtSb3在根尖部位表达,其它部分不表达;在4-5叶期幼苗中,AtSb3在地上部位没有表达,只在主根和各级侧根的根尖部位以及靠近根茎转换区的根中有表达。在根尖部位,AtSb3基因在根冠和分生区结合部,以及伸长区的组织染色非常深,说明表达量高,在结合部与伸长区之间的组织染色非常浅,说明表达量很低。     

拟南芥开花抑制基因TFL1的蛋白表达及纯化

TFL1基因是植物中的一个开花抑制基因,与促进植物开花的FT是同源基因,但是二者发挥相反的功能。本研究为了获得TFL1融合蛋白,首先将TFL1基因构建到PGEX-4T-3表达载体上,获得TFL1基因的原核表达载体PGEX-4T-3-GST-TFL1,转化大肠杆菌表达菌株BL-21(DE3)。在37℃,0.5mmol/L IPTG条件下诱导出了大小为46kD的GST-TFL1融合蛋白。经过GST纯化基质纯化后,获得了质量较高、并且能被TFL1抗体特异识别的GST-TFL1蛋白,为进一步研究TFL1的互作蛋白及其抑制植物开花的分子机制提供了一个十分有力的工具。     

异源表达Peu-miR473 a增强拟南芥的抗旱性

为了探究胡杨miR473a基因的功能,本文克隆了miR473a的前体Pre-Peu-miR473a,并利用农杆菌花序侵染法将其遗传转化入拟南芥。通过普通PCR和β-葡萄糖苷酸酶(GUS)组织化学染色检测获得CaMV35S: miR473a过表达植株,然后对转基因和野生型植株在甘露醇模拟高渗环境与土壤自然干旱条件下的生长状况及各项生理指标进行评价。结果表明,胡杨miR473a前体长度为100 bp,与毛果杨前体序列相似度为100%,可以形成完美的二级茎环结构。相比于野生型,过表达胡杨miR473a的拟南芥在200 mmol/L甘露醇胁迫条件下的萌发率、根长和生长状况都优于野生型;在土壤干旱处理条件下,转基因拟南芥的株高、相对含水量、脯氨酸含量以及光系统Ⅱ(PSⅡ)最大光合效率均显著高于野生型10%以上(P0.05)。半定量PCR检测显示:Peu-miR473a参与胡杨受干旱胁迫的正调控,杨树中预测的靶基因Potri.012G093900、Potri.007G100200、Potri.009G165300、Potri.004G204400受干旱胁迫的负调控;拟南芥中预测的靶基因AT1G24530、AT5G45000、AT5G46070及AT3G52950在转基因株系中表达量下降。初步预测它们有可能被miR473a靶向调控。本研究表明,miR473a基因在干旱胁迫条件下通过调控植株的抗脱水能力和渗透调节能力发挥一定抗旱作用。      

拟南芥(Arabidopsis thaliana)VSP cDNA的克隆、鉴定及基因表达

报道了从模式植物拟南芥花ｃＤＮＡ文库中分离鉴定的一个克隆。该ｃＤＮＡ的长度为８８７ｂｐ，其编译的蛋白质推断为２６８ａａ（氨基酸），与大豆营养贮藏蛋白（ＶＳＰ）的同源率达５０％。Ｎｏｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ分析表明，该基因在拟南芥叶片中仅有微量表达，但在花蕾，幼荚及茎中表达量丰富。采用发育后期的花为材料进行原位杂交，发现该基因的表达仅限制于子房壁。     

拟南芥at3g57680基因编码的CtpA蛋白对光系统Ⅱ功能的影响

采用电镜技术、Northern印迹技术、蓝绿温和胶电泳、SDS-PAGE电泳和蛋白免疫印迹等方法对拟南芥at3g57680基因缺失的突变体植株研究。结果表明:(1)突变体植株和野生型植株的叶绿体都呈扁球状,叶绿体的大小基本一样,叶绿体内部基质,基粒均匀分布,基粒类囊体垛叠层数相近;(2)psbA、psbB、psbC和psbO基因mRNA水平没有变化;(3)类囊体膜蛋白复合物的组成、表达量以及蛋白复合物各亚单位的组成和含量也是基本一致,且突变体与野生型植株中D1蛋白的表达量也保持一致。说明在正常生长环境中,拟南芥at3g57680基因的缺失对叶绿体显微结构、D1蛋白的成熟加工以及PSⅡ蛋白组成等没有影响,即at3g57680基因编码的类CtpA蛋白对PSⅡ功能没有影响。     

卡那霉素对拟南芥幼苗生长的影响

为了解植物基因工程中最早广泛应用的卡那霉素筛选剂对拟南芥幼苗的敏感性及幼苗植株发育的影响,将拟南芥种子播种于MS固体培养基上,在22℃光照16h、18℃黑暗8h的光周期条件下进行培养试验,结果表明:卡那霉素致使拟南芥幼苗黄化现象严重,对拟南芥幼苗子叶和真叶的生长和发育有明显影响,并抑制了幼苗主根的伸长和侧根的发生。与对照相比,卡那霉素处理的拟南芥幼苗的子叶较小、黄化,且没有真叶出现,处理10d时,子叶黄化严重,甚至死亡。另外,卡那霉素处理的拟南芥幼苗的主根较短,同时没有形成侧根。但进一步研究分析发现,卡那霉素处理对拟南芥幼苗根尖的影响具有可逆性,但幼苗主根伸长并没有表现出较大的可逆性。     

拟南芥WRI1基因的克隆及其植物反义载体的构建

应用聚合酶链式反应技术(PCR)扩增了拟南芥WRI1基因,并将其克隆到pMD18-Tvector载体上,对重组子进行PCR检测和限制性内切酶分析,并测定了该基因全序列.结果表明,该基因全长为1 287 bp.将拟南芥WRI1基因反向克隆到植物表达载体pCambia1300的35S启动子下游,构建了该基因的植物反义表达载体.     

拟南芥山奈酚糖苷对UV-B辐射的响应

以拟南芥(Arabidopsis thaliana)为材料,通过施加低强度(40μw·cm-2)和相对长时间(7 d)的UV-B辐射,研究拟南芥幼苗和成苗中三种山奈酚糖苷即山奈酚-3-O-鼠李葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷(K1)、山奈酚-3-O-葡萄糖基-7-O-鼠李糖苷(K2)、山奈酚-3-O-鼠李糖基-7-O-鼠李糖苷(K3)含量及合成途径关键酶编码基因表达水平对UV-B辐射的响应.结果表明,拟南芥幼苗三种山奈酚糖苷含量均为成苗的10倍左右.经过7 d的UV-B辐射处理,拟南芥幼苗中山奈酚糖苷积累水平、合成途径关键酶编码基因chs和fls1的相对表达量均显著高于对照植株,山奈酚糖苷表现为响应UV-B辐射而积累.在拟南芥成苗和幼苗中三种山奈酚糖苷组合模式应对UV-B辐射的变化并不一致,这与其在防御机制中的不同角色有关     

潮霉素对拟南芥幼苗生长的影响

为揭示潮霉素与拟南芥幼苗生长发育的关系,研究了不同浓度潮霉素对拟南芥幼苗叶和根生长的影响.结果表明:拟南芥幼苗对潮霉素的抗性浓度约为30 μg/mL;在30 μg/mL潮霉素的作用下,拟南芥幼苗叶生长、主根伸长和侧根形成受到显著抑制,导致拟南芥幼苗较小.