斑海豹线粒体基因组序列分析及比较研究

本研究采用LA-PCR扩增和引物步移相结合的方法对我国辽东湾斑海豹的线粒体基因组全序列进行了测定,并完成了基因组成和系统发生学分析。辽东湾斑海豹线粒体基因组长为16 754bp,其基因构成与其他海洋哺乳动物基本一致,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和1个控制区。在其37个基因中,ND6、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(UCN)、tRNAGlu、tRNAPro位于L链上,其余均位于H链上。对我国辽东湾、韩国和美国阿拉斯加斑海豹线粒体基因组进行了比较分析,结果显示,三者线粒体基因组长度略有不同,差异主要体现在以重复片段形式存在的控制区序列中。值得注意的是,在编码区中,3个目标群体的线粒体ND5基因核苷酸差异最为显著,共检测到了18个突变位点,造成4处氨基酸序列变异。斑海豹线粒体基因组蛋白编码基因的变异分析及海豹科系统进化分析结果显示,我国辽东湾和韩国斑海豹的序列同源性显著高于美国阿拉斯加斑海豹,说明辽东湾和韩国斑海豹很可能来自同一个种群。     

仿刺参基因组大小的测定

仿刺参基因组大小测定采用流式细胞术,以鸡红血细胞DNA含量(2.5 pg/2C)为内标,用夏眠、正常和野生3个群体的仿刺参体腔细胞测定了52只刺参的单倍体基因组含量,其C-值为(0.90±0.06)pg,由此得出仿刺参基因组大小为(880.2±58.68)Mb。其中,夏眠、正常和野生群体C-值分别为(0.93±0.05)、(0.90±0.05)和(0.84±0.02)pg。运用独立样本t检验对比分析显示:(1)夏眠与正常的仿刺参基因组大小之间差异不显著,说明仿刺参基因组大小与夏眠这一生理因子不具有相关性;(2)池塘(围堰)养殖环境下与野生环境下的仿刺参基因组大小之间有显著差异,野生环境下的仿刺参基因组明显小于池塘(围堰)养殖环境下的基因组。据此推测,环境因子的改变可能对仿刺参乃至整个海参类群基因组DNA含量产生影响。实验还对C-值测定的发展和方法作了详尽的描述,同时在综合其他种类海参基因组大小研究的基础上,探讨了C-值与进化地位之间的关系。     

圆斑星鲽线粒体基因组全序列结构及其进化

利用圆斑星鲽(Verasper variegatus Temminck et Schlegel)和相关鱼类的部分线粒体基因序列,设计出6对扩增引物,通过PCR扩增产物直接测序和引物行走(Primer walking)法测定圆斑星鲽线粒体基因组全序列,并对其进行结构与进化分析。圆斑星鲽线粒体基因组序列长17273 bp,其基因序列及构成都与其他硬骨鱼基本相同,包括37个基因(2个rRNA基因、22个tRNA基因和13个蛋白质编码基因)和2个非编码区(控制区和WANCY区)。在22个tRNA基因中,tRNAGln、tRNAAla、tRNAAsn、tRNACys、tRNATyr、tRNASer(第2个)、tRNAGlu和tRNAPro的编码基因位于L链上,其余则位于H链上。在13个蛋白质编码基因中,除了COⅠ基因的起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子。蛋白质编码基因包括具有完整TAA终止密码子的ND1,COⅠ,ATP8,ND4L,ND5,而其他蛋白编码基因则具有不完全终止密码子。在L链上,ND6是仅有的一个蛋白质编码基因。圆斑星蝶的控制区包含1个终止相关序列区(ETAS)、6个中央保守序列区(CSB-A、B、C、D、E、F)和3个保守序列区(CSB-1、2、3)以及长串联重复区(Tandemly repeat sequence)。用NJ法和MP法对5个目22种鱼mtDNA的13个蛋白质编码基因的氨基酸序列进行系统分析,结果显示,圆斑星蝶与石鲽关系最近,鲽形目的鲆、鲽类与鲈形目的科(Carangidae)、鲷科(Sparidae)鱼类亲缘关系较近,而同属于鲽形目的塞内加尔鳎(Solea senegalensis)没有和任何目聚在一起,成为一个独立的分支。圆斑星蝶的基因组全序列序列已提交到GenBank,登录号为DQ403797,控制区单元型序列的GenBank登录号为DQ834444~7。     

鳀科鱼类线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息分析

为了解鳀科鱼类的线粒体全基因组序列结构特征及系统发育信息,以期为进化遗传学研究和分子标记的选取提供参考依据,对已知的10种鳀科鱼类的线粒体全基因组进行分析。结果显示:1)鳀科线粒体基因组全序列长度在16 660 bp到17 069 bp之间,基因组的结构和基因排列顺序与其它硬骨鱼类一致。2)比对后获得一致序列长度为15 704 bp(不含D-loop),其中变异位点5 570个,占所有位点数的35.5%。在编码基因中,序列变异程度和Kimura双参数遗传距离最大的是ND6基因(分别是47.5%和0.276),最小的是tRNA拼接序列(分别为18.7%和0.072)。3)基于Ka-Ks的Z检验和Tajima’s D检验表明蛋白质编码基因主要受到净化选择(即负选择,purifying selection)的作用;其中12个蛋白质编码基因(ND6除外)有强烈的净化选择(Ka/Ks<1),而ND6基因受正选择(positive selection)影响较大(Ka/Ks>1)。4)ND4、ND2和Cytb是进行鳀科鱼类系统发育分析的较为理想的分子标记。     

奥利亚罗非鱼线粒体基因组全序列测定与系统进化分析

采用LA-PCR(long amplification polymerase chain reaction)扩增方法获得奥利亚罗非鱼(Oreochromis aureus)线粒体基因组全序列.分析表明,序列全长16 632 bp,包括13个蛋白质编码基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个长度为931 bp的主非编码区.A、T、G、C碱基的组成分别为27.89％、25.50％、15.62％、30.99％.基因排列与罗非鱼属的其他物种一致.13个蛋白质基因除COX1用TGT做起始密码子外,其他均以ATG为起始,终止密码子除COX2、Cyt b、ND4为不完整的T,其余基因均以典型的TAA做终止密码子.22个tRNA的二级结构都具有典型三叶草结构.系统发育分析显示,罗非鱼属与丽鱼科(Cichlidae)其他物种分开,聚为单系群,其中奥利亚罗非鱼与尼罗罗非鱼亲缘关系较近,莫桑比克非鱼和罗非鱼KM-2006亲缘关系较近.本研究旨在为进一步利用线粒体基因组分析罗非鱼群体遗传多样性、亲缘关系以及丽鱼科系统进化提供基础依据.     

滁州鲫(Carassius auratus)线粒体全基因组序列分析及系统进化

为探讨天然三倍体滁州鲫的系统进化地位,采用直接测序法获得滁州鲫线粒体基因组。其序列全长为16581 bp,碱基组成为31.6% A、26.2% T、16.1% G和26.1% C,包括13个蛋白质基因、22个tRNA基因、2个rRNA基因和1个非编码区,各基因的位置及组成与已公布的鲤科鱼类一致。除tRNA-Ser (AGY)外,其他21个tRNA的二级结构均具有典型的三叶草结构;13个蛋白编码基因中,除COⅠ起始密码子为GTG外,其余均以ATG为起始密码子;COⅡ、ND3、ND4和Cytb基因的终止密码子为不完整的T,其他9个基因均具有完整的终止密码子TAA或TAG。序列分析表明,滁州鲫与其他鲫属鱼类(方正银鲫A系和D系、鲫、淇河鲫、萍乡肉红鲫、黑鲫、日本白鲫和日本银鲫)在线粒体基因组上均具有较高的序列同源性(>94%)。以鲤(Cyprinus carpio haematopterus)为外类群,基于线粒体13个蛋白质基因的核苷酸与氨基酸序列构建上述鲫属鱼类的系统进化树,结果显示,滁州鲫与方正银鲫亲缘关系最近,与黑鲫最远。综合以上研究结果,认为滁州鲫应为银鲫亚种的一个地方种群。     

黄条鰤线粒体全基因组测序及结构特征分析

通过二代测序、软件拼接获得中国黄海海域黄条鰤(Seriola aureovittata)线粒体基因组全序列。其序列全长为16609 bp,碱基组成分别为A(26.68%)、G(17.84%)、C(30.12%)和T(25.36%);共有13条蛋白编码基因, 22个tRNA基因, 2个rRNA基因,除NAD6、trnQ、trnA、trnN、trnC、trnY、trnS、trnE、trnP外,其余基因均在H链上编码。黄条鰤线粒体基因组全序列与蛋白编码基因的A+T含量分别为52.05%和51.085%,具有明显的AT偏好性。线粒体基因中存在2个散在重复序列,分别位于NAD1基因序列正义链的中游和COX2基因序列反义链的上游。在其22个tRNA基因中,除了tRNAGly外,均具有典型的三叶草二级结构。黄条鰤线粒体基因组的蛋白编码基因起止位点与密码子除COX1、NAD5外,均与日本海域出产的黄条鰤(Seriola lalandi)完全吻合,且COX1、NAD5基因皆短于日本黄条鰤;两者间存在一定的遗传差异。基于18种隶属于13属的鲹科鱼类线粒体基因组全序列构建系统发生树,可知小甘鲹(Seriolina nigrofasciata)、黄条鰤、五条鰤(Seriola quinqueradiata)、高体鰤(Seriola dumerili)、长鳍鰤(Seriola rivoliana)同属一近支,且黄条鰤与五条鰤亲缘关系最近,与小甘鲹进化距离较远。     

仿刺参的微卫星标记

为了评价种质资源及基础生物学研究的需要,本文开发了仿刺参的微卫星标记。NCBI数据库中共有20个含有仿刺参微卫星的序列,从中选取8个设计引物,发现6个微卫星位点有多态性。不同的引物获得的等位基因数为3～9个不等,6个位点共获得了31个等位基因,每个位点平均获得5．2个等位基因。6个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．3611,平均期望杂合度（He）为0．6402。位点AJMS004提供的多态性信息含量值较低,为0．4862;其他5个位点均在0．5以上。另外,还尝试了红海参（Parastichopus californicus）微卫星标记在仿刺参的通用性。实验结果表明,在较高的退火温度下,5对引物均能扩增仿刺参的基因组DNA并具多态性。5个位点共获得了22个等位基因,每个位点平均获得4．4个等位基因。5个位点的平均观测杂合度（Ho）为0．1733,平均期望杂合度（He）为0．4201。其中位点Psc2的多态性信息含量值最高,为0．8500。     

仿刺参超氧化物歧化酶基因cDNA全序列的克隆及其特征分析

以仿刺参Apostichopus japonicus为材料,利用cDNA末端快速扩增(RACE)方法首次得到仿刺参MnSOD的全长cDNA。该全长cDNA大小为955bp,其中5′端非编码区67bp,3′端非编码区216bp,开放阅读框(ORF)672bp,在3′端有多聚腺苷酸信号序列ATTTA,并有polyA加尾,符合有效翻译的基因全长cDNA的特征。MnSOD全长cDNA可编码223个氨基酸的前体蛋白,预测蛋白分子质量为24.64kD,理论等电点是6.66,为亲水性蛋白。该蛋白序列没有信号肽和跨膜结构,仅有一段线粒体导肽。其二级结构主要以α-螺旋为主,无规则卷曲和延伸链构成了蛋白中量最大的结构元件,不含β-折叠。仿刺参SOD的氨基酸序列与目前已报道的其他物种如人、牛、斑马鱼、原鸡、非洲爪蟾、中国对虾、皱纹盘鲍、海湾扇贝、果蝇等的MnSOD氨基酸序列进行序列比对的结果表明,相似性均在61%～69%之间,说明该基因在各物种间具有一定的保守性。该段氨基酸序列无N-糖基化位点,含有3个蛋白激酶C磷酸化位点,1个酪氨酸蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点,5个肉豆蔻酰基化位点,还发现了1个SOD家族的特征肽段DVWEHAYY。对磷...     

瘤背石磺线粒体基因组全序列分析

采用LA-PCR技术对瘤背石磺线粒体基因组全序列进行了测定和分析。结果表明,瘤背石磺线粒体基因组序列全长13 957 bp,由22个tRNA、2个rRNA、13个蛋白编码基因和19个长度为2~138 bp的非编码区组成。4个蛋白质编码基因和8个tRNA基因从L链编码,其余基因均从H链编码。蛋白质基因的起始密码子,除ND2为TTG以外,均为典型的起始密码子ATN。COⅢ和Cytb基因使用了不完全终止密码子T,其余基因均使用典型的TAA或TAG。预测了22个tRNA基因的二级结构,发现tRNA^Ser缺少DHU臂,tRNA^Ser和tRNA^Thr的反密码子环上有9个碱基,而不是通常的7个碱基。最长的非编码区含有类似于tRNA的二级结构。基于线粒体基因组编码的13个蛋白质的氨基酸序列,用NJ、MP、ME和UPGMA法构建系统进化树。分析6种软体动物之间的亲缘关系,结果与传统的系统分类基本一致。研究初步确定瘤背石磺与平疣桑椹石磺的亲缘关系比与凯尔特石磺的亲缘关系近。     

养殖仿刺参溃烂病病因初探

从患病仿刺参分离获得的两株优势菌2004—A1和2004—A2,经人工感染回接健康参试验,均获得与原发病相同症状,证实此两株菌是病原菌。另通过人工创伤感染试验确认海参受外伤后,容易感染发生溃烂病。     

利用塑料大棚晒水进行刺参种苗越冬试验

2002年11月~2003年4月,在瓦房店市交流岛前哨海参育苗厂800 m3水体室内水泥池中,投放平均规格为5000头/kg,刺参种苗196 kg(98万头)。在没有锅炉进行水加温条件下,利用600 m3水体塑料大棚晒水进行刺参种苗越冬,水温2.0~13.2℃,平均盐度31.2,pH值8.2,DO>7 mg/L,经过近6个月的培育,共培育出规格为876头/kg的参苗836 kg(73.2万头),成活率74.7%,总重量增加了8.5倍。     

辛硫磷对刺参幼参的急性毒性效应

研究了静水条件下辛硫磷对刺参幼参(0.8±0.1)g的急性毒性试验,以期为海参养殖环境监测提供理论依据。利用Bliss法,得出辛硫磷对刺参幼参在24、48、72 h半致死质量浓度分别为0.329、0.1970、.141 mg/L,并计算出安全质量浓度为0.021 mg/L。     

仿刺参纤维胶凝蛋白基因的分子特征及表达分析

纤维胶凝蛋白是非特异性免疫系统中的重要分子。通过转录组测序及cDNA末端快速克隆技术得到一条仿刺参纤维胶凝蛋白基因的全长cDNA序列,并将其编码的蛋白命名为仿刺参纤维胶凝蛋白-1。获得的基因cDNA全长为1951bp,其中5′-末端非翻译区为397bp,3′-末端非翻译区为666bp,开放阅读框为888bp,编码295个氨基酸,N端16个氨基酸为信号肽,信号肽后面有两个G-X-Y重复序列,C端为纤维蛋白素原结构域。采用实时荧光定量PCR方法分析了仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参幼参不同组织及细菌脂多糖刺激后的时序表达规律,结果显示仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有表达,且肠道的表达量最高;脂多糖刺激后,4种组织的仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因表达量均有变化,且以肠道和体壁表达量的变化最为显著;此外,仿刺参纤维胶凝蛋白-1基因在仿刺参4种组织中的表达量变化具有不同的时序性,表明仿刺参纤维胶凝蛋白-1可能在仿刺参免疫应答中起重要作用。     

异地刺参选育组合的稚幼参生长速率差异性分析

采用Duncan's新复极差测验分析方法,对青岛(Q)、烟台(Y)、威海(W)、日照(R)、长岛(C)的野生刺参群体进行了不同组合的选种繁育技术研究,以当地刺参自交作为对照组,对各组合的体质量日增长率和体长日增长率进行了比较分析.数据分析表明,各选育组的生长优势明显高于对照组.其中,Y(♀)×Q(♂)选育组的体质量日增长率和体长日增长率最高,分别为5.31%/d、3.66%/d,表现出良好的选育优势.研究表明,不同组选育组合之间剌参体长日增长率与体质量日增长率之间有一定的线性关系,但其之间的线性关系不明显.而Q(♀)×W(♂)和W(♀)×C(♂)选育组合的稚幼参体质量日增长率和体长日增长率分别为3.39%/d、2.11%/d;2.63%/d、3.05%/d,说明在同期的一定时间内体质量日增长率与体长日增长率不呈正相关.     

海参体壁及消化道的氨基酸和脂肪酸分析

用氨基酸自动分析仪和气相色谱仪测定海参体壁及海参消化道中氨基酸、脂肪酸的组成和含量。结果表明:海参体壁及消化道中都含有18种氨基酸,分别占体壁干重的37.23%、消化道湿重的7.96%,其中都含有8种必需氨基酸,分别占总氨基酸的31.02%和41.81%;体壁及消化道中脂肪酸分别是19种和21种,其总量为12.931 mg/g(干重)、5.782 mg/g(湿重)。消化道中同时含有DHA和EPA,且EPA的含量最高,达17.36%。     

仿刺参SARM基因的克隆、表达和功能研究

采用RACE方法克隆了仿刺参TLR信号通路MyD88非依赖途径接头分子SARM,命名为AjSARM.AjSARM基因的序列全长3874 bp,开放阅读框为2412 bp,编码803个氨基酸.通过SMART软件对Aj SARM蛋白进行蛋白结构预测,发现Aj SARM蛋白由2个SAM结构域和1个C端TIR结构域组成.采用实...     

不同饲料搭配及投喂量对仿刺参稚、幼参生长和成活的影响

水温(22.8±1.5)℃,将体长1.0~2.0 mm的仿刺参稚参放养到容水40 L的塑料槽中,每槽150头,研究不同饲料搭配及投喂量对稚、幼参生长和成活的影响。在前一试验中,给幼参分别投喂含鼠尾藻、酵母和配合饲料98.0%、2.0%、0%(1组),95.0%、0%、5.0%(2组),30.0%、5.0%、65.0%(3组),60.0%、5.0%、35.0%(4组),90.0%、5.0%、5.0%(5组);投喂量为360.7%~107.1%;在后一试验中,采用第4组的搭配比例,6、7、8、9、10组的投喂量分别为第4组的1/4、1/2、1.0、5/4、3/2。每组4个平行。试验结果表明,稚、幼参摄食不同搭配饲料时,第1个月生长和成活率差异不显著;中期,第1、2组的幼参生长显著快于其他组;后期,第3组生长显著快于其他组。稚、幼参的成活率与配合饲料的添加量呈正相关。在后一试验中,前期稚参的生长速度随投喂量的增加而加快;中、后期,各水槽稚参的总质量随投喂量的增加而增加,但平均每头质量与投喂量不呈正相关,第9组的稚参增长最快,第8组成活率最高,第6、7组的成活率最低。中、后期换水前水中氨氮含量显著高于换水后。文中提出了仿刺参苗种培育期间的适宜投喂模式。     

仿刺参甘露聚糖结合凝集素基因对脂多糖刺激的免疫应答

甘露聚糖结合凝集素是天然免疫系统中重要的模式识别分子。分析了仿刺参甘露聚糖结合凝集素在仿刺参不同组织及脂多糖刺激前后的表达规律,结果显示仿刺参甘露聚糖结合凝集素mRNA在仿刺参的肠道、呼吸树、体腔细胞和体壁均有组成型表达,且体壁的表达量最高;细菌脂多糖刺激后,4个组织的仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量均得到上调,且以肠道和体腔细胞表达量的变化最为显著;另外,肠道、体腔细胞、体壁中仿刺参甘露聚糖结合凝集素表达量峰值的出现具有明显的时序性,而呼吸树自刺激后6h直至取样结束,其表达量呈稳步上升趋势。     

几种物质使刺参脱离附着基效果的比较

水温4～10℃时于1L塑料瓶(容水800mL)中放入5头体质量0.5～7.4g的刺参,适应24h后加入不同体积(质量)分数的酒精(99.7%分析纯)(0%、0.5%、1.0%、2.0%、5.0%、10.0%)、氯化钾(99.7%分析纯)(0.00%、0.40%、0.60%、0.80%、0.10%、1.20%)、氯化钠(99.7%分析纯)(盐度45.0、50.0、55.0、60.0、65.0、80.0、100)和复方中草药(分苗灵)(1∶100、1∶200、1∶300、1∶400、1∶500、1∶600)溶液,观察刺参附着力的变化及化皮率。试验结果表明,酒精体积分数在2.0%以下时,刺参的自动脱落率达90%以上,高于2.0%时,化皮率明显增加。在盐度55.0以下浸泡20min后,刺参的自动脱落率随盐度的升高而上升,12℃时比8℃时增加了近30%。当分苗灵与海水的质量之比为1∶300以下时,刺参在其中浸泡30min后,脱落率最高,浸泡60min 90%以上的刺参脱落,未出现化皮、吐肠等异常现象,分苗后不用再进行消毒处理。