“睡美人”转座子系统介导EGFP转染鸡SSCs条件优化的研究

利用"睡美人"转座子系统介导增强型绿色荧光蛋白(Enhanced Green Fluorescent Protein,EGFP)报告基因,比较和优化了电穿孔转染条件和精原干细胞(spermatogonial stem cells,SSCs)对G418的耐受能力.结果表明,在SB与PT-EGFP的比为1:10,质粒浓度为15μg/mL,细胞处于对数生长期,且细胞密度为106~107/mL时,精原干细胞在电场强度为270V,脉冲时程为80μs,转染后在4℃静置10 min的条件下转染效率最高.浓度为400 μg/mL的G418对转染后的SSCs进行快速筛选6d时,出现了EGFP阳性克隆.     

鸡胚胎干细胞的分离和培养

实验从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2%的鸡血清、2mmol/LL-谷氨酰胺、1mmol/L丙酮酸钠、5.5×10-5mol/Lβ-巯基乙醇、10μL/mL非必需氨基酸以及含1000IU/mL白血病抑制因子(LIF)、10ng/mL碱性成纤维生长因子(bFGF)和5ng/mL干细胞生长因子(SCF)的高糖DMEM对细胞进行培养和传代,可以获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞(ES)。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。同时通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。     

鸡胚胎干细胞分离培养和单细胞克隆的制备

从鸡第X期胚胎中分离胚盘,以鸡成纤维细胞为饲养层,用添加了10%的胎牛血清、2％的鸡血清、2mmol／L L-谷氨酰胺、1mmol／L丙酮酸钠、5．5×10^-5mmol／L β-巯基乙醇、10μL／mL非必需氨基酸、以及含1000U／mL LIF、10ng／mL bFGF和5ng／mL SCF的高糖DMEM对细胞进行培养和传代。利用鸡第X期的胚胎干细胞,采用口吸管法、细胞稀释法和克隆环法3种方法,制备单细胞克隆,采用细胞化学法和免疫荧光法检测细胞表面标志物。结果显示,可获得传至5～6代的鸡胚胎干细胞。通过对传代培养后的鸡ES细胞进行AKP染色鉴定和SSEA-1的鉴定,证实细胞未发生分化,具有胚胎干细胞的特征。通过不同分离胚盘方法和不同消化时间的比较得出药勺法提取胚盘简单易行,原代消化5～8min的ES细胞适合于传代培养。口吸管法、细胞稀释法和克隆环法单细胞克隆形成率分别为0、4.2％和1．0％。经AKP活性和SSEA-1免疫荧光鉴定均呈阳性,扩增出的克隆能稳定增殖不分化。结果表明,细胞稀释法操作简单易行,试验时间短,对细胞伤害小,为鸡ES单细胞克隆进一步建系提供了可行的方法。     

电穿孔导入绿色荧光蛋白基因于绵羊胎儿成纤维细胞研究

本文应用质粒pEGFP Cl带有水母绿色荧光蛋白 (GFP)基因和新霉素抗性基因 (Neor)两种报告基因转染胎儿成纤维细胞 ,进行转染条件优化。首先 ,通过成活率确定转染脉冲时程和场强 ,发现有三种组合是最适的组合 ,它们分别为 :时程 5ms,场强 1.2 5～ 1.5kV/cm ;时程 15ms时 ,场强 1.0～ 1.2 5kV/cm ;时程 2 5ms时 ,场强 0 .75～ 1.0kV/cm。接着采用场强 1.2 5kV/cm ,时程 15ms ,研究转染的温度、电导介质、细胞状态、DNA用量和细胞密度对转染效率的影响 ,结果表明电导介质为Dhanks,DNA用量为 4 μg/mL ,对数期细胞密度为 1× 10 6～ 1× 10 7个 /mL ,电击前后在 4℃下各静置 10min时 ,能获得最佳转染效率。     

黄牛胎儿皮肤成纤维细胞的分离培养及电转染条件的优化

为了进一步优化黄牛胎儿皮肤成纤维细胞的电转染条件,试验采用组织块贴壁的方法培养黄牛胎儿皮肤成纤维细胞,以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因,进一步优化黄牛胎儿皮肤成纤维细胞电转染条件。通过控制电压(200～600 V)、脉冲时间、电击次数等电转染条件,采用不同的条件组合,用电穿孔法将质粒PEGFP-N1电转染培养的黄牛胎儿皮肤成纤维细胞,再通过荧光显微镜分析电转染效率。结果表明:最佳的电转染条件是电压为500 V,脉冲时间为2 ms,电击次数为4次。     

脂质体法转染山羊骨骼肌特异细胞条件的优化

试验旨在通过脂质体转染法检测pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达情况,并探索其最佳的转染条件。在构建的适合携带外源基因的山羊骨骼肌特异表达载体pIMAU-EGFP基础上,以绿色荧光蛋白为报告基因,采用脂质体转染法检测了pIMAU-EGFP载体在山羊骨骼肌细胞中的表达,并对转染条件进行了摸索。试验结果表明,成功把测序验证正确的pIMAU-EGFP载体转染到山羊骨骼肌细胞中,筛选的最佳转染条件:脂质体与质粒的最佳比例为1：2,质粒浓度为3.5 μg/μL,细胞密度不低于80%,以转染24~36 h观察记录转染效率为宜。本试验初步建立了转染山羊骨骼肌细胞的方法,绿色荧光蛋白可作为报告基因优化脂质体转染条件,这将为快速和规模化筛选山羊肉质特性相关基因提供新思路和研究方法。     

人类α-actin 启动子真核表达载体的构建及应用

利用PCR技术克隆了人类α-actin基因的启动子（约450bp），尝试用去掉启动子的pEGFP—N1作为框架结构，成功构建了真核表达载体pEGFP-N1-α-actin—P。应用Lipofectamine 2000将所构建的pEGFP-N1-α-actin-P转染入小鼠ES细胞。通过比较，发现在本实验室条件下，质粒DNA浓度以3．0～5．0μg／mL，转染时间约在2～3h最佳。200μg／mL的G418较适宜于靶细胞的转染与筛选。得到表达心肌a—actin和GFP的小鼠ES细胞，基本维持小鼠ES细胞的形态。PCNA染色结果表明，转染后的小鼠ES细胞具有增殖能力。α—actin抗体免疫组化染色结果表明，转染后细胞表达α-actin和GFP，揭示构建的真核表达载体pEGFP-N1-α-actin-P转染小鼠ES细胞，可能促进其向心肌细胞分化并对其筛选。     

enJSRV囊膜蛋白及其受体的瞬时表达与绵羊绒毛膜滋养层细胞融合的诱导研究

旨在深入研究内源性绵羊肺腺瘤病毒(enJSRV)囊膜蛋白在绵羊胎盘形成过程中的作用,本研究体外培养了蒙古绵羊绒毛膜滋养层细胞,采用RT-PCR技术扩增出enJSRV-env基因及其受体Hyal2基因全长序列,定向克隆于真核表达载体pEGFP-C1上。优化绒毛膜滋养层细胞电转染条件和测定电转效率。将构建好的真核表达质粒分别电转染到绒毛膜滋养层细胞中,在荧光显微镜下观察enJSRV囊膜蛋白及其受体Hyal2的瞬时表达情况。并研究高表达enJSRV-env基因及通过RNA干扰沉默enJSRV-env基因对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合活性的影响。结果显示,真核表达质粒构建成功,分别命名为pEGFP-C1/enJSRV-env及pEGFP-C1/Hyal2。研究表明,绵羊绒毛膜滋养层细胞最佳电转染条件为脉冲电压150 V,脉冲时间5.0 ms,电击2次,间隔50 ms。转染pEGFP-C1/enJSRV-env质粒及pEGFP-C1/enJSRV-env与pEGFP-C1/Hyal2共转染的绵羊绒毛膜滋养层细胞中多核细胞数目明显增加,平均每个视野分别可以观察到1.8和2.3个多核细胞。说明enJSRV-env对绒毛膜滋养层细胞的细胞融合有一定的促进作用。本研究为进一步探究enJSRV囊膜蛋白的结构和功能及绒毛膜滋养层细胞融合机理提供试验基础。     

影响水牛胎儿成纤维细胞转染效率的因素

实验对电穿孔法和阳离子脂质体法转染水牛胎儿成纤维细胞的条件进行了系统摸索,获得了较好的DNA转染参数。电穿孔法转染时脉冲时间为15ms,电场强度为40～50V/m时,细胞的死亡率处于20%～50%之间,比较适合外源DNA转入水牛胎儿成纤维细胞。将脂质体与DNA的比例控制在8μL:2μg,可获得较高的转染率。相同培养条件下,脂质体法比电穿孔能获得更多的转基因抗性细胞集落,转染DNA的纯度和细胞的状态也明显影响脂质体法的转染效率。     

3种介导猪NR2F2基因转染PK15细胞方法的比较研究

试验旨在研究3种转染方法对猪肾上皮细胞（PK15）的转染效率，为以PK15细胞为模型研究外源基因的功能提供参考。本研究以PK15细胞为研究对象，用脂质体、电穿孔、慢病毒3种转染方法转染后，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达，采用实时荧光定量PCR检测EGFP和NR2F2基因的表达情况，采用CCK-8检测细胞存活率，进而比较3种方法的转染效果。结果显示，转染PK15细胞后，电穿孔和慢病毒方法转染效率极显著高于脂质体（P<0.01），但电穿孔方法和慢病毒方法之间差异不显著（P>0.05）；EGFP和NR2F2基因的实时荧光定量PCR结果显示慢病毒方法效果最好，脂质体方法较差，与细胞转染效率基本一致；CCK-8结果显示，电穿孔转染后细胞存活率最低，极显著低于对照组（P<0.01），脂质体方法显著低于对照组（P<0.05），慢病毒方法与对照组间差异不显著（P>0.05）。综合考虑转染效率及细胞活性，本研究认为慢病毒转染方法最适合转染PK15细胞，为今后高效转染PK15细胞提供了理想的方法。     

柔嫩艾美耳球虫电穿孔转染条件的优化

低转染效率一直是利用基因转染技术研究柔嫩艾美耳球虫的主要屏障。为了进一步提高现有的转染效率,本研究分别利用传统的Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪和新型的NucleofectorⅠ核转仪对柔嫩艾美耳球虫子孢子的转染条件进行了优化。通过对外源DNA浓度、电场强度、环境温度及NucleofectorⅠ核转仪的内置程序这些关键参数的探索,最终发现利用Bio-Rad Gene Pulser电穿孔仪设置电压为2000 V,电容25 μF,利用4 mm电击杯进行电转时,转染效率最高,达到3.8×10-4,此时最佳质粒浓度为50 μg/107子孢子。     

抗猪繁殖与呼吸综合征病毒转基因细胞系的建立

采用脂质体法将具有抑制猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)复制的shRNA质粒pEGFP-N1-shRNA导入PK-15细胞中,经G418药物筛选后,分离扩增绿色荧光蛋白阳性细胞,获得抗PRRSV转基因PK细胞系。通过对转染方法和条件的优化,确立最佳的转染及筛选步骤;对得到的阳性转基因细胞进行冷冻-解冻,并作PCR检测。结果表明,G418最佳筛选浓度为600μg/mL,脂质体与质粒的最佳转染比例为7∶2,最佳转染时间为24 h。本研究成功建立抗PRRSV转基因细胞系,为进一步的功能验证及体细胞核移植奠定了基础。     

鸡胚精原细胞体外转染EGFP方法的比较

以增强型绿色荧光蛋白（Enhanced green fluorescent protein,EGFP）为报告基因体外转染鸡胚胎精原细胞（Chicken embryonic spermatogonial cells,CESCs）,比较磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法转染EGFP的效率,以获得高效的体外转染方法。本研究分离孵化16d的鸡胚睾丸,获取CESCs,体外培养和传代扩增,传至第2代后进行碱性磷酸酶（AKP）活性和阶段特异性表面抗原-1（Stage specific embryonic antigen-1,SSEA-1）免疫荧光鉴定。运用磷酸钙、脂质体（梭华-Sofast）、电穿孔3种方法体外转染第2代CESCs,荧光细胞计数法分析转染效率。结果表明：与磷酸钙法、脂质体法相比,电穿孔法可获得更高的细胞成活率和转染率（68％ vs 39％、65％,19．70％ vs 2．92％、9．73％）,差异显著（P〈0．05）。因此得出,电穿孔法是将外源基因导入鸡胚精原细胞的适宜方法。     

阳离子脂质体转染家蚕培养细胞的技术体系研究

阳离子脂质体转染家蚕培养细胞是家蚕基因功能研究的重要技术之一。利用阳离子脂质体Lipofectamine2000与pBac[A3Neo+A3EGFP]转基因表达载体,对家蚕卵巢细胞BmN-SWU1、BmN-SWU2、BmN和草地贪夜蛾卵巢细胞Sf21进行了外源DNA质量、脂质体用量、转染细胞密度和转染孵育时间等4个转染条件的优化实验,筛选到了阳离子脂质体转染效率最高的细胞系BmN-SWU1。BmN-SWU1细胞的最佳转染条件为:外源DNA0.6μg,脂质体2.5μL,细胞密度1×105mL-1,无血清条件下孵育24 h。此条件下转染效率可达55.08%。用抗生素G418筛选转染后的BmN-SWU1细胞,建立了GFP转基因细胞系。     

乳酸乳球菌高效电转化方法的建立

以乳酸菌诱导型表达质粒pNZ8149为载体,Lactococcus lactisNZ3900为受体,采用电转化方法研究电场强度、电击杯规格、受体菌株的生长状态、感受态细胞浓度及分装体积、质粒浓度、电击脉冲时间以及电击杯使用次数等因素对电转化效率的影响。结果表明：在固定电阻200Q、电容25μF条件下,收获对数生长前期的乳球菌制作感受态细胞,并以80μL体积分装,采用2mm规格的电击杯,加入浓度为1．2μg／μL的质粒,在电场强度和脉）中时间分别为10kV／cm和5ms的条件下完成电击转化。转化后的菌液恢复培养2h后涂板计数,转化效率最高可以达到2．6×10^4CFU／μgDNA。研究结果为进一步构建乳酸菌高效表达系统和食品级基因工程乳酸菌株奠定了方法基础。     

Fat-1基因载体构建及其在家鸡中的体外表达

试验旨在构建一种适合于家禽体外表达的ω-3脂肪酸脱氢酶Fat-1基因的真核生物表达载体,为后续转基因鸡的生产奠定基础。根据家鸡密码子使用频率,对秀丽隐杆线虫Fat-1基因进行优化改造;将改造后的Fat-1基因(cFat-1)连接至pLL3.7表达载体,构建重组质粒pLL3.7-cFat-1;经PCR、酶切、序列分析等手段对重组质粒进行鉴定;用胰酶消化法培养鸡成纤维细胞,利用TurboFect^TM转染试剂将pLL3.7-cFat-1转染体外培养的成纤维细胞;通过RT-PCR检测和绿色荧光观察分析cFat-1基因在细胞中的表达。结果表明cFat-1基因在鸡成纤维细胞中高效转录并表达,成功构建了可在家禽体外表达cFat-1基因的特异性表达载体。本研究首次获得可在家禽体外表达cFat-1基因的转基因细胞系,证实了经基因改造后cFat-1基因可在家禽体外的高效转录和表达,为后续制备富含ω-3脂肪酸的转基因鸡奠定基础。     

Generation of Sperms Containing EGFP‐LacZ Following Transfection of Chicken Testis with a Eukaryotic Dual Reporter Vector

Male germ cells modified by foreign genes can be used to generate transgenic chicken. In this study, in vivo transfection of chicken testis with an EGFP‐LacZ dual reporter expression vector was performed. Large‐scale plasmid DNA preparation of the EGFP‐LacZ eukaryotic expression vector was carried out and efficient transfection of chicken testicle cells using the prepared plasmid DNA was confirmed in vitro. The reporter plasmid was directly injected into adult rooster testes. Semen samples were collected on 10‐days post‐transfection and every other day thereafter; and a total of six collections were made. Semen slides were subjected to fluorescence microscopy and β‐galactosidase activity assay to identify sperms carrying the reporter genes. The presence of EGFP and LacZ was further confirmed by PCR amplification with sperm genomic DNA as template. The testicles of those birds were subjected to cryostat sectioning, fluorescence microscopy and β‐galactosidase activity assay. The results showed that sperms with green fluorescence were not observed on semen slides; however, sperms positive for β‐galactosidase were detected. Specific amplicons of EGFP and lacZ were detected in four of the six sequentially collected semen samples. Fluorescence microscopy of the corresponding semen slides revealed yellow‐green fluorescence, but not clear green fluorescence. The β‐galactosidase activity assay and GFP histochemistry using monoclonal antibodies demonstrated positive staining for subsets of testicle cells. Together, these results showed that direct injection of the dual reporter vector into adult rooster testis allowed in vivo transfection of chicken sperm precursor cells, which further developed into sperm containing EGFP‐LacZ.