贝氏隐孢子虫单克隆抗体的研究

作者采用杂交瘤技术获得两株分泌贝氏隐孢子虫特异性抗体的杂交瘤细胞－２Ｈ１１和２Ｃ７，经３～４次克隆化后，阳性率均达１００％。染色体数分别平均为９４和９５。经分析，两株单克隆抗体识别抗原分子区的相关位点，为今后进行贝氏隐孢子虫的诊断及免疫学研究奠定了基础。     

抗鼠隐孢子虫单克隆抗体的研究

利用鼠隐孢子虫卵囊脱囊物免疫ＢＡＬＢ／Ｃ小鼠，取脾细胞与ＳＰ２／Ｏ细胞融合，经过３￣４次有限稀释法克隆化，获得５株持续分泌抗体的杂交瘤细胞株。所获抗体均属ＩｇＧ１。ＩＦＡ检测结果表明：２Ｇ７株单抗作用于卵囊壁抗原，而ＩＡ４、２Ｅ７、３Ｇ３、４Ａ７株单抗作用于子孢子表面抗原。诱生腹水经过反复冻融、冻干及硫酸铵沉淀后，抗体活性无明显变化。５株单抗均不与贝氏隐孢子虫及柔嫩艾美尔球虫产生交叉反应，与小孢隐     

安氏隐孢子虫肌动蛋白部分编码基因的表达及免疫保护性

以筛选安氏隐孢子虫T7噬菌体展示文库获得的肌动蛋白（CA42）部分编码基因的序列设计特异性引物,扩增目的基因CA42,构建重组表达载体pET-28a-CA42,通过大肠杆菌BL21的诱导表达,产物经SDS-PAGE和Western-blotting鉴定。然后纯化重组蛋白,免疫BALB／c进行体液和细胞免疫水平的检测,并观察重组蛋白对微小隐孢子虫的交叉保护性效果。结果显示,成功构建重组原核表达质粒pET-28a-CA42,Western-blotting显示重组蛋白约为19ku,能被安氏隐孢子虫免疫小鼠的多克隆抗体识别。重组蛋白免疫BALB／c小鼠的抗体水平差异显著（P〈0．05）,CD4^＋T淋巴细胞数差异均显著,CD4^4／CD8^＋T淋巴细胞数的值与佐剂对照组和空白对照组相比差异均显著（P〈0．05）。各组小鼠经接种微小隐孢子虫卵囊后,试验组与各对照组相比卵囊减少率为32．2％,差异均显著（P〈0．05）。结果表明,成功表达了重组安氏隐孢子虫肌动蛋白,纯化的重组蛋白具有一定的免疫原性和交叉保护性。     

应用巢式PCR-RFLP方法鉴别微小隐孢子虫、安氏隐孢子虫和火鸡隐孢子虫的研究

应用巢式聚合酶链反应（Nested PCR）-限制片段长度多态性 （restriction fragment length polymorphism, RFLP）方法对微小隐孢子虫（C．parvum）、安氏隐孢子虫（C．andersoni）和火鸡隐孢子虫（C．meleagrides）的鉴别进行了研究。结果显示C．parvum BOCC2、C．andesoni BOCC2和C．meleagrides CHCC1扩增产物片段大小分别为830bp、828bp和828bp，扩增产物分别经VspI酶切后形成3种不同的RFLP图谱，根据RFLP图谱可鉴别C．parvum、C．andersoni和C．meleagrides。本研究为我国隐孢子虫的分类和隐孢子虫病的分子流行病学研究打下了良好基础。     

猪隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展

隐孢子虫病是一种全球性的人兽共患病 ,猪隐孢子虫病世界各地均有报道 ,严重威胁着人类和动物的健康。本文对猪隐孢子虫病的病原分类、虫体形态和生活史、流行病学特点、诊断、防治等方面目前研究状况进行了综述 ,为猪隐孢子虫病的有效防制提供参考     

牛隐孢子虫和隐孢子虫病的研究进展

从牛隐孢子虫病的病原分类、内生发育史、体液免疫和细胞免疫、流行病学特点、诊断、防治等几方面阐述了牛隐孢子虫和隐孢子虫病的研究现状，总结了前人对牛隐孢子虫3个有效种的生物学特性研究的结果，为进一步了解牛隐孢子虫病的流行病学及有效防制该病提供了参考。     

隐孢子虫病流行病学研究进展

隐孢子虫病是一种呈世界性分布的人畜共患原虫病 ,该病给畜牧业生产造成严重的经济损失 ,是艾滋病患者的主要致死因素之一。本文就隐孢子虫的感染情况、感染来源、传播途径、年龄、性别及季节性等进行综述 ,并讨论了尚未解决的问题。     

家蚕微孢子虫单克隆抗体的制备及鉴定

用家蚕微孢子虫(Nosema bombycis)总蛋白为抗原,采用长程免疫法免疫BALB/c小鼠,取4次免疫后的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞用PEG-1500进行细胞融合,第1次融合率为13.3%,第2次融合率为55.4%。建立间接酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA),用于检测杂交瘤细胞上清中的单克隆抗体。初检阳性率分别为4.68%和5.26%。经3次亚克隆筛选获得了2株能稳定分泌抗家蚕微孢子虫的单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为2G10和2B10。间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence test,IFAT)和Western-bloting分析证实所获得的单克隆抗体是特异针对家蚕微孢子虫蛋白的,将在孢子孢壁蛋白的研究中发挥重要作用。     

抗隐孢子虫鼠基因型CP15/60蛋白单克隆抗体的制备与鉴定

为获得高特异性的抗隐孢子虫单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb),以原核表达的隐孢子虫鼠基因型(Cryptosporidium mouse genotype)子孢子表面抗原CP15/60为免疫原,免疫Balb/c小鼠。取免疫鼠脾细胞与SP2/0细胞进行融合,用间接ELISA方法进行抗体效价测定,有限稀释法进行亚克隆。以常规染色体分析法进行杂交瘤细胞的染色体分析,用McAb亚类鉴定试剂盒鉴定McAb亚型、间接ELISA法测定相对亲和力及交叉反应性、Western blot检测抗体的特异性。结果获得了2株能稳定分泌抗重组CP15/60(recombinant CP15/60,rCP15/60)的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为B4F7和D8H5,其腹水抗体效价均达到1∶107;染色体数目B4F7株为97条±4条、D8H5株为90条±7条,且观察到标志染色体;McAb亚型均为IgG1,轻链均为κ链;相对亲和力常数B4F7株为0.009μg/mL、D8H5株为0.016μg/mL;2种McAb均与rCP15/60蛋白发生特异性反应,与柔嫩艾美耳球虫卵囊可溶性蛋白、弓形虫裂殖子蛋白以及日本血吸虫虫体蛋白均无交叉反应,证实本试验获得了2株高特异性的抗隐孢子虫McAb。     

分泌抗鸡Ig单抗杂交瘤细胞系的建立与单抗生物学特性的鉴定

从传染性法氏囊病病毒（ＩＢＤＶ）单克隆抗体（ＭｃＡｂ）杂交瘤细胞系１Ｄ１０、１Ｇ１中得到了３株能稳定分泌抗鸡免疫球蛋白（Ｉｇ）ＭｃＡｂ的杂交瘤细胞系１Ｂ７、１Ｄ７、３Ｇ６。其抗体类和亚类均属ＩｇＧ２ｂ，腹水的ＥＬＩＳＡ效价≥１∶２５６００，琼扩效价为１∶８～１∶１６。３株ＭｃＡｂ能与鸡血清中的Ｉｇ出现沉淀反应，琼扩在２４ｈ以内出现清晰的沉淀线，而不能和鸭、鸽、鹌鹑等禽类及异种动物血清出现沉淀线。纯化的鸡ＩｇＧ、ＩｇＭ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ后，分别用纯化并经辣根过氧化物酶（ＨＰＲ）标记的１Ｂ７、１Ｄ７、３Ｇ６单抗酶结合物进行免疫印迹试验证明，３株单抗识别的均为ＩｇＧ、ＩｇＭ分子的轻链     

抗隐孢子虫子孢子表膜单链抗体基因的克隆和核苷酸序列分析

应用RT－PCR技术，从分泌具有抗隐孢子虫子孢子表膜单克隆抗体（McAb)的杂交瘤细胞3D6中扩增出抗体VH和VL基因，用linker(Gly4Ser)3基因，将VH和VL基因连接成ScFv基因，并将其克隆至pMD-18T载体中。经核苷酸序列分析证实，VH、VL基因和linker基因拼接正确，基因全长为720bp。经计算机分析，VH和VL基因均为新发现的基因序列，符合功能性重排的鼠抗体可变区基因特征。VH和VL基因分别属于鼠免疫球蛋白重链Ⅱ（A）和轻链κⅢ家族。     

微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白抗体检测ELISA方法的建立

为建立快捷的含病毒隐孢子虫的检测方法,本研究利用已构建的微小隐孢子虫病毒衣壳蛋白重组表达质粒表达并纯化重组蛋白,建立以该重组衣壳蛋白为包被抗原检测抗体的间接ELISA检测方法.经优化后间接ELISA的最佳条件为:抗原包被浓度为0.25 μg/孔,被检血清稀释度为1:200,酶标二抗稀释度为1:2000,封闭液为含5％脱脂奶粉的PBST溶液.该方法检测安氏隐孢子虫阳性血清,柔嫩艾美尔球虫阳性血清,蓝氏贾第虫阳性血清,弓形虫阳性血清与微小隐孢子虫阳性结果均为阴性.该方法灵敏度为1:1600,特异性较强且具可重复性,可用于含病毒隐孢子虫的抗体检测及流行病学调查.     

微小隐孢子虫端粒序列及端粒酶活性的研究

为了探讨我国微小隐孢子虫(C.parvum)的端粒序列,试验根据国外已报道的端粒重复序列5’-CCTAAA-3’设计寡聚核苷酸探针(CCTAAA)5,并用地高辛标记,C.parvum基因组DNA经Bal31-HindⅢ酶切后进行Southern印迹杂交鉴定;并在此基础上,采用改进的端粒重复序列扩增(TRAP)法首次对子孢子和卵囊时期C.parvum的端粒酶活性进行检测。结果表明:C.parvum基因组DNA与探针(CCTAAA)5杂交,获得了较好的杂交条带,随着Bal31-HindⅢ酶切时间的延长,杂交信号逐渐减弱,说明C.parvum端粒序列定位在染色体的末端,与国外报道的C.parvum端粒序列一致,为5’-CCTAAA-3’;检测C.parvum端粒酶活性时发现,子孢子时期端粒酶具有活性,卵囊中未检测到端粒酶活性。     

Distribution of Cryptosporidium parvum subtypes in calves in Germany

Cryptosporidium DNA was extracted from 134 faecal specimens from pre-weaned calves from different German Federal States (age range, 3–15 days old), which tested positive for oocysts by microscopic analysis. The 18S rDNA gene and the oocyst wall protein gene (COWP) were used as targets for PCR and RFLP techniques. Cryptosporidium species were identified by using SspI, MboII and RsaI endonucleases for the digestion of 18S rDNA and COWP amplified fragments, respectively. In all samples, restriction patterns corresponding to Cryptosporidium parvum were identified, which is in agreement with abundant literature data indicating C. parvum as the most common species in pre-weaned calves. In order to estimate the genetic heterogeneity among C. parvum calf isolates, 53 samples chosen to represent different German Federal States were successfully subtyped by sequence analysis of the highly polymorphic 60-kDa glycoprotein gene. All isolates belonged to the allele IIa (with seven subtypes), with the exception of one isolate that belonged to the allele IId. Moreover, three novel subtypes of the allele family IIa have been found. This study confirms the utility of genotyping and subtyping tools in characterizing the transmission of Cryptosporidium spp. This is the first molecular epidemiological report about subtyping of Cryptosporidium bovine isolates in Germany.     

Concurrent response to challenge infection with Cryptosporidium parvum in immunosuppressed C57BL/6N mice

We investigated the response to challenge infection with Cryptosporidium parvum oocysts in immunosuppressed C57BL/6N mice. In the primary infection, fecal oocyst shedding and parasite colonization were greater in immunosuppressed mice than in nonimmunosuppressed mice. Compared with primary infection, challenge infection with C. parvum didn''t show any oocyst shedding and parasite colonization. Especially, oocyst shedding and parasite colonization from the mice infected with heat-killed oocysts were not detected. After challenge infection with C. parvum oocysts, however, these mice were shedding small numbers of oocysts and parasite colonization. Except normal control and uninfected groups, the antibody titers of other groups appear similar. Based on the fecal oocyst shedding, parasite colonization of ilea, and antibody titers in the mice, these results suggest that the resistance to challenge infection with C. parvum in immunosuppressed C57BL/6N mice has increased.     

小球隐孢子虫gp15基因的克隆与核苷酸序列分析

为了给小球隐孢子虫(Cryptosporidium parvum)核酸疫苗的研制提供基因材料，用聚合酶链式反应(PCR)技术，从牛源小球隐孢子虫基因组中扩增了子孢子表面蛋白CPl5的gpl5基因(413bp)，然后将其克隆到pMDl8-T载体中，用Sanger’s双脱氧法对重组质粒中的插入片段进行序列分析。将测得的核苷酸序列及其推导的氨基酸序列与国外报道的序列进行同源性比较，结果表明核苷酸同源性为99．2％，氨基酸同源性为100％。     

免疫乳中特异性抗体对3种细菌所致小鼠腹泻的被动免疫保护作用

以9株人肠道病原茵(大肠杆茵3株、志贺氏茵3株、沙门氏茵3株)制备的混合抗原对孕牛进行系统免疫，以获得对人致病肠道杆茵具有特异性的牛乳抗体。其免疫初乳中针对9种致病肠道杆茵的特异性IgG效价为2^11-2^12，为非免疫初乳的128-256倍；免疫常乳中针对9种致病肠道杆茵的特异性IgG效价为2^6-2^8。为非免疫常乳的16-64倍。动物实验表明，免疫初乳及效价为1：64的免疫常乳对肠产毒性大肠杆茵、鼠伤寒沙门茵、福氏志贺茵所致小鼠腹泻均有保护作用，这是由免疫乳中特异性IgG所决定的。     

阿维菌素单克隆抗体的制备与鉴定

将与牛血清白蛋白（BSA）偶联的阿维菌素人工合成抗原AVM-BSA免疫8周龄雌性BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术获得了2株分泌抗阿维菌素特异性抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为2F2和2H10.生物学特性鉴定的结果表明,2株杂交瘤细胞株诱生腹水的效价为1∶6 400,分泌的抗体亚型均为IgM;间接竞争酶联免疫吸附试验结果表明,抗体的50%抑制质量浓度（IC50）为101 ng/mL,2株单克隆抗体与伊维菌素、多拉菌素、红霉素和白霉素均无交叉反应,证实单克隆抗体2H10具有很强的特异性,可用于阿维菌素药物残留免疫分析方法的建立.