龙血树DCDPK2基因的克隆及表达分析

通过RACE技术克隆龙血树CDPK基因的全长cDNA,并对基因序列进行相关分析与基因表达分析。结果表明:该基因全长为1 810 bp,编码区长度为1 587 bp,编码528个氨基酸,其氨基酸序列具有CDPK基因编码氨基酸的所有典型结构特征;经序列比对发现其核酸序列与玉米CDPK基因的同源性高达81%,氨基酸序列与其它植物中的CDPK氨基酸序列同源性很高。该基因命名为DCDPK2基因。对未经血竭诱导和诱导的龙血树组培苗进行半定量RT-PCR表达分析,发现在添加了诱导物的组培苗中DCDPK2基因的表达显著增强。     

东乡野生稻苗期低温诱导表达新基因BGIOSGA013293-DX的过表达载体构建与转化

结合表达谱数据分析,参考公共数据库中的序列信息设计引物,利用RT-PCR技术,从东乡野生稻中获得了1个在低温诱导条件下高表达的螺旋—环—螺旋结构域蛋白基因BGIOSGA013293-DX的全长c DNA,并构建了其过表达载体。序列比对分析表明,该基因位点在93-11中编码308个氨基酸,而在东乡野生稻中编码335个氨基酸,比93-11多27个氨基酸。且这27个氨基酸连续分布在一起,另外还有1个氨基酸的差异。利用农杆菌介导法将BGIOSGA013293-DX转入水稻受体品种93-11,获得了9株过表达转基因水稻植株,经潮霉素抗性标记基因PCR阳性检测和GUS检测,获得的转基因植株为携带BGIOSGA013293-DX的阳性植株。     

小麦逆境胁迫基因TaSKIP的克隆、定位及初步表达分析

非生物逆境是小麦生长、发育及产量形成的主要限制因子之一。为揭示小麦抗逆胁迫响应机制,并为培育转基因抗逆种质奠定基础,本研究利用同源克隆的方法从普通六倍体小麦中国春中克隆出TaSKIP基因并进行序列分析及基因定位,同时对TaSKIP基因在PEG6000胁迫下的表达模式进行分析。结果表明,共克隆得到3个TaSKIP基因,其中2个基因被定位于6A和6D染色体上。序列分析表明,TaSKIP-6A编码区长为1 827bp,编码608个氨基酸,TaSKIP-B和TaSKIP-6D编码区长均为1 824bp,编码607个氨基酸。氨基酸序列比对分析表明,小麦TaSKIP蛋白与水稻、玉米和大麦等禾本科植物SKIP蛋白的同源性均大于88%,而且含有相同的SKIP/SNW结构域。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qRTPCR)检测结果表明,TaSKIP在模拟干旱胁迫条件下表达量上调,暗示该基因在小麦非生物逆境胁迫响应中起重要作用。     

香蕉MaERF-1基因的克隆、序列分析及表达载体构建

从香蕉中克隆了1个乙烯响应因子(ERF)Ma ERF-1。序列分析表明,该基因存在1个完整的开放阅读框(ORF)729 bp,编码243个氨基酸。多序列比对和进化树分析表明,Ma ERF-1所编码的蛋白与其他植物中ERF编码的蛋白具有较高的一致性。其中与马来西亚野生香蕉同源性最高达98%,与油棕、菠萝、海枣、葡萄、荷花、烟草的Ma ERF编码的氨基酸序列的同源性分别为65%、60%、59%、54%、53%、51%。Ma ERF-1编码的蛋白质分子量为26 139.03 u,理论等电点p I为7.81,其亲水性氨基酸均匀分布在整个肽链中,多于疏水性氨基酸。通过PCR和酶切反应鉴定成功构建该基因的表达载体。     

玉米雄性不育基因Zmms1的同源克隆及生物信息学分析

利用水稻雄性不育相关基因Osms1同源克隆玉米中的同源基因Zmms1,用生物信息学方法对水稻Osms1及玉米Zmms1基因核苷酸序列以及蛋白质结构、亲水性和疏水性及进化树等进行分析。结果表明,水稻雄性不育相关基因Osms1编码区长度为2 232 bp,编码679个氨基酸,Zmms1编码区长度为2 461 bp,编码670个氨基酸。通过对ms1蛋白功能结构域进行分析发现,Zmms1和Osms1同为PHD-ZF超家族成员,二者具有相同的功能结构域和近似的三级结构,因此推测,Zmms1可能与Osms1具有相似的功能。     

茶树谷胱甘肽过氧化物酶编码基因CsGPX1功能分析

为明确茶树[Camellia sinensis(L.)O.Kuntze.]谷胱甘肽过氧化物酶(Glutathione peroxidases,GPX)编码基因CsGPX1的功能,本文利用茶树转录组数据克隆获得CsGPX1的编码区全长序列,进行序列比对与分析,在此基础上,将CsGPX1在烟草中进行过表达获得转CsGPX1基因烟草,并比较野生型烟草与转基因烟草耐旱性的差异,验证CsGPX1功能。序列分析表明,CsGPX1编码序列(CDS)长723 bp,编码240个氨基酸。BLAST比对发现,该基因与桃树(Prunus persica)的GPX基因具有高度同源性(>85%)。CsGPX1编码的氨基酸序列具有GPX蛋白保守特征序列和区别于其他家族成员的特有的结构域——磷脂氢谷胱甘肽过氧化物酶(PHGPX)。干旱胁迫处理结果显示,过表达CsGPX1烟草株系抗旱性强于野生型。GPX酶活性测定结果表明,转基因植株的GPX酶活性高于野生型植株。以上研究结果表明,过表达CsGPX1可提高转基因烟草的耐旱能力,说明CsGPX1可能与茶树的耐旱性能相关。本研究为提高茶树的耐旱性能研究提供了新的理论途径,并对降低茶园管理的成本具有一定的积极意义。     

小麦β-酮脂酰CoA合成酶基因KCS的克隆与酵母表达

超长链脂肪酸是生物体内众多重要物质的合成底物。KCS基因编码β-酮脂酰CoA合成酶,该酶具有底物特异性,参与超长链脂肪酸延伸的缩合反应,是超长链脂肪酸合成的限速步骤。为了探究小麦KCS基因在超长链脂肪酸合成中的功能,采用同源克隆的方法从小麦(Triticum aestivum L.)中克隆出KCS基因后,利用生物信息学对其编码序列进行分析,并在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中对其进行真核表达。结果表明,小麦TaKCS6基因的开放阅读框为1 287bp,编码428个氨基酸残基。结构域预测结果显示,TaKCS6蛋白含有III型聚酮合酶脂肪酸延伸酶和C末端3-酰基ACP合酶III结构域,属于KCSs蛋白家族。序列比对分析结果显示,TaKCS6氨基酸序列与拟南芥及其他植物的KCS6氨基酸序列在两个功能结构域上和活性位点保守。酵母表达结果显示,TaKCS6基因编码的蛋白参与C24以上超长链脂肪酸的延伸。     

玉米光周期敏感基因ZmELF4的克隆及其亚细胞定位

以热带玉米自交系CML288为供试材料,根据拟南芥ELF4基因保守序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆了ELF4在玉米上同源基因的全长cDNA序列(GenBank上的登录号为HQ009862)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长683 bp,开放阅读框为432 bp,编码了144个氨基酸,与拟南芥、水稻的氨基酸序列同源性分别高达62%和75%,此外它们还共同包含一个高度保守的DUF1313未知功能结构域。利用基因重组技术分别构建了能够高效表达的过量表达载体pBI-ZmELF4和带有GFP标记的融合表达载体pGIT-ZmELF4-GFP,利用融合表达载体进行洋葱表皮瞬时表达实验,结果将ZmELF4定位于细胞核内,说明该基因在细胞核内起作用。     

红海榄脱水素基因(RsDHN1)的克隆及表达分析

采用RT-PCR和RACE技术对已获得的红海榄根部其中一个差异表达基因进行克隆,通过Blast分析和序列比对可知,该基因全长cDNA序列包括146bp的5'端非编码区,43bp的3'端非编码区和一个编码241个氨基酸的开放阅读框,命名为RsDHN1基因。该cDNA编码的蛋白具有植物脱水素蛋白的特征性结构,属于SKn类脱水素蛋白,与其它植物的SKn类脱水素蛋白具有43%～55%的氨基酸序列同源性。半定量RT-PCR分析表明,盐胁迫对RsDHN1基因的表达有明显上调作用。     

拟南芥AtTTG1基因的克隆及用于转化花生的MAR调控表达载体构建

黄曲霉毒素污染对花生产业危害巨大,通过基因工程改变花生果种皮结构以提高花生抗黄曲霉能力。根据GenBank中拟南芥AtTTG1基因的cDNA编码区设计引物,通过RT-PCR克隆AtTTG1基因,结果显示,克隆获得的片段长1026bp,与基因库中数据比对相同,该片段编码341个氨基酸,预测其蛋白分子量为86.96KDa,等电点为4.85。结合实验室已获得的花生果种皮特异启动子S19和MAR序列调控的植物表达载体pLMAR,构建了植物高效表达载体pLMAR-S19-TTG1,并将其导入根癌农杆菌EHA105。为进一步对花生进行遗传转化,获得转基因高抗黄曲霉花生奠定基础。     

玉米DCL1基因鉴定及其自然等位变异分析

根据生物信息学分析,同源性克隆分离玉米DCL1候选基因,鉴定该基因组织与逆境响应等表达特征,并分析其自然等位变异。结果表明,目标候选基因全长7 408 bp,与拟南芥和水稻DCL1基因氨基酸序列高度保守,相似度分别为91%和77%。mRNA定量PCR分析表明,该基因在幼叶和吐丝期雌穗中表达丰度分别是幼茎的75.35倍和16.21倍;高盐、脱水、ABA、低氮、低磷胁迫处理条件下,幼苗中高盐和ABA处理呈下调表达,低氮和低磷处理呈显著上调表达,脱水处理无显著变化。核苷酸与氨基酸序列的保守性、组织与逆境响应差异表达特征均与拟南芥和水稻等相似。87份玉米自交系10×全基因重测序数据分析结果表明,该基因遗传变异丰富,共83个位点存在自然变异,但外显子区域和主要的功能结构域序列相对保守,约2/3的自然变异集中在内含子区域,外显子区域的27个自然变异位点只有8个位点在16个材料存在氨基酸差异。     

玉米热激蛋白ZmHSP70-12基因的克隆及表达分析

热激蛋白70(HSP70)是原核和真核细胞中普遍存在的一种高度保守的分子伴侣。从玉米中克隆1个HSP70家族成员。该基因cDNA序列全长为1 992 bp,开放阅读框为2 352 bp,编码663个氨基酸,蛋白质分子量约75.0 kD。蛋白结构预测及同源比对分析表明,该基因编码蛋白含ATPase位点和HSP70保守结构域,与拟南芥AtHSP70-12序列高度相似,命名为ZmHSP70-12。蛋白亚细胞定位显示,ZmHSP70-12蛋白在内质网中表达。实时荧光定量PCR分析表明,ZmHSP70-12对非生物胁迫高温、干旱均具有明显的应答反应,推测ZmHSP70-12是玉米中与胁迫逆境相关的基因。     

玉米蜕皮激素合成酶基因ZmCYP92A1的克隆和表达分析

采用RT-PCR结合RACE技术,从玉米中克隆ZmCYP92A1,GenBank登录号为KY270496.1。该基因全长1 713 bp,开放阅读框为1 551 bp,编码517个氨基酸。预测ZmCYP92A1蛋白分子量为58.58 kD,理论等电点为6.44,存在2个跨膜结构域,1个信号肽,有1个P450保守结构域。多序列比对表明,ZmCYP92A1蛋白与其他物种的CYP92A1蛋白具有极高的相似性。系统发生分析揭示,CYP92A1蛋白与属于CYP75亚家族的类黄酮3-单加氧酶的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果发现,非生物胁迫(干旱、高盐、低温和脱落酸)均诱导ZmCYP92A1基因的表达,表明该基因参与植物抵御非生物胁迫。     

玉米耐旱相关基因dbf1的序列变异分析

玉米dbf1 基因在干旱胁迫下的编码产物与DIP₁蛋白相结合,调控植物激素脱落酸（ABA）响应基因rab17 的表达,从而提高耐旱性。以B73的dbf1 基因组序列为模板,对104个玉米自交系的dbf1 基因进行测序,研究玉米dbf1 基因的序列多态性。多态性分析表明,在全长为2 118 bp的序列中共发现48个SNP和12个InDel。尽管大部分变异位点集中在非编码区,但编码区的1个InDel和3个非同义突变位点的变异可以产生氨基酸序列改变。玉米dbf1 基因的全长序列和编码区序列的变异位点可以分别将该基因划分成33和11种单倍型,并且编码7种蛋白质。在供试材料中,dbf1 基因至少经历了9次重组,中性检测表明,该基因的进化没有偏离中性选择。     

玉米株型相关基因ZmDwarf4的克隆及表达分析

以松散型玉米自交系沈137为材料,利用同源克隆法成功克隆与水稻Dwarf4基因同源的玉米Dwarf4基因。序列分析发现,该基因cDNA序列全长1 626 bp,开放阅读框1 521 bp,编码506个氨基酸,与高粱、水稻、拟南芥的氨基酸同源性分别为95%、89%和71%。Real-Time PCR分析表明,ZmDwarf4基因的表达量为3～11叶期表达量逐渐增加,9～11叶期达到最大量,12～19叶期表达量逐渐降低,推测ZmDwarf4基因正向调控玉米叶夹角的大小。ZmDwarf4基因的表达量在叶片中最高,在叶枕中最低。不同激素处理的结果表明,用植物激素（IAA）处理的样品ZmDwarf4基因的表达量始终高于对照;用Brassinolide（BR）处理的样品6叶期ZmDwarf4基因的表达量高于对照,7～10叶期该基因的表达趋势与对照基本一致,但始终低于对照;用IAA+BR处理的样品,该基因的表达趋势与对照基本一致,但高于对照。ZmDwarf4参与玉米BR生物合成途径,进而调控其相关株型建成。     

青稞HvnWRKY26基因的克隆及表达分析

WRKY家族转录因子广泛参与植物的生物和非生物胁迫过程。为探索WRKY家族转录因子在青稞抗条纹病过程中的作用,本课题组前期利用条纹病菌分别侵染抗病青稞品种昆仑14号和感病品种Z1141,并进行转录组测序,发现一个在侵染时期差异表达的WRKY基因家族成员。序列分析发现,该基因的开放阅读框为765 bp,可编码255个氨基酸,具有典型的WRKY结构域,属于WRKY基因家族。Uniprot注释结果表明,该蛋白为HvnWRKY26。启动子区域预测表明,该区域含有脱落酸和茉莉酸响应元件以及与干旱、低温、盐胁迫和防御应激等逆境胁迫相关的顺式作用元件。序列比对分析显示,HvnWRKY26蛋白与其他物种中同源蛋白的氨基酸序列一致性均不高,但该蛋白与大麦HvWRKY26蛋白的WRKY结构域序列完全相同。系统进化分析表明,青稞HvnWRKY26与大麦WRKY26的亲缘关系最近;进一步对HvnWRKY26及与其亲缘关系较近的大麦、玉米、水稻WRKY蛋白进行进化分析,发现这些WRKY蛋白被分为A、B和C三大类,其中HvnWRKY26蛋白属于A类。RNA-seq和qRT-PCR分析结果表明,青稞在遭受条纹病菌侵染时,HvnWRKY26基因的相对表达量在抗病品种昆仑14号和感病品种Z1141中均显著上调表达,且抗病品种的表达量显著高于感病品种,推测HvnWRKY26基因在青稞抗条纹病过程中发挥重要作用。     

普通小麦TaTPR1基因的克隆及表达分析

具有TPR基序的蛋白质被认为能够介导蛋白质间的相互作用,并且参与多种生物学过程,如细胞周期调控、转录调控、过氧化物酶等蛋白质的运输、信号传导和蛋白质折叠等。为了在小麦分子育种研究中获得更多有价值的候选基因,本研究采用电子克隆和RT-PCR方法从小麦中克隆得到1个TPR类基因,命名为TaTPR1。该基因ORF长度972bp,推测编码包含323个氨基酸残基的蛋白,相对分子质量34.9kD,理论等电点为5.89。氨基酸序列分析表明,该蛋白在142~207区和207~274区分别含有TPR类基因家族特有的保守结构域(TPR_16和TPR_11)。进化和聚类分析表明,小麦TaTPR1基因与粗山羊草AtTPR15基因、乌拉尔图小麦TuTPR15基因的亲缘关系较近,蛋白相似度分别为91.28%和91.55%。Real-time PCR表达特性分析显示,该基因为组成型表达,在根、茎、叶中均表达;幼苗期茎中表达量较高,随幼苗的生长,茎中表达量上调显著;该基因表达受高盐的强烈诱导,也受水分、低温和外源ABA胁迫诱导。     

玉米ZmFAR1基因的克隆与表达分析

FARs为脂酰辅酶A还原酶，在植物生长发育和抵御非生物胁迫过程中起着重要作用。为进一步研究FARs在玉米中行使的生物学功能，在玉米中克隆1个脂酰辅酶A还原酶1基因(ZmFAR1)，该基因全长1 883 bp，开放阅读框长1 491 bp，编码496个氨基酸，分子量为55.983 k Da。生物信息学分析表明，ZmFAR1蛋白的分子式为C₂₅₂₂H₄₀₁₀N₆₉₀O₇₀₁S₂₄，为稳定的碱性亲水蛋白，存在59个磷酸化位点，未发现信号肽，存在跨膜结构域，最大可能定位于细胞质。氨基酸残基组成中主要以α螺旋和无规则卷曲为主。系统进化树分析表明，ZmFAR1蛋白与南荻和高粱的FAR蛋白相似度最高。利用实时荧光定量PCR技术对ZmFAR1在模拟盐、干旱两种非生物胁迫条件下对根、茎、叶3种组织的表达模式进行研究，结果表明，ZmFAR1呈现组织特异性表达，在叶中的表达量最高。盐和干旱处理下，ZmFAR1的表达量出现明显变化，推测ZmFAR1可能在不同程度参与了玉米对非生物胁迫的应答。