中国玉米矮花叶病毒6K1基因的克隆及序列分析

 玉米矮花叶病毒(MDMV)病分布于世界各主要玉米产区,近年在我国北方地区发生流行,导致玉米和高粱大面积减产,造成了严重损失。由于缺少抗病品种,目前对该病的防治主要是采取传统的方法。通过对MDMV的分子生物学及传播机制进行系统研究,有可能找到对该病毒有效而持久的控制措施。     

甘蔗花叶病毒福建分离物外壳蛋白基因的克隆及序列分析

 A fujian isolate of Sugarcane mosaic virus named SCMV-FJ was isolated from infected sugarcane. Cloning and sequence analysis of the coat protein gene of this isolate was carried out. A pair of primers was designed and synthesized based on the nucleotide sequences of coat protein genes of sugarcane mosaic viruses reported. The coat protein gene of SCMV-FJ was amplified from the extracted total RNA of the infected sugarcane by using RT-PCR, and cloned into the pMD18-T vector. The sequencing result indicated that the cloned segment included a 1137 bp open reading frame(ORF) and a 228 bp 3' untranslated region, in which the ORF comprised the whole coat protein and part of the nuclear inclusion b. The nucleotide and the deduced amino acid sequences of the coat protein gene were compared with those of the other isolates or strains of SCMV subgroup reported in GenBank. The result showed that it shares 56.8%-97.1% and 55.3%-99.4% homology in nucleotide and the putative amino acid sequences, respectively, with the highest amino acid homology of 99.4% with SCMV-D. Thus it was identified as a SCMV-D. This experiment provided a rapid, sensitive and relatively inexpensive method for RT-PCR detection of SCMV. At the same time, the cloning of SCMV-FJ coat protein gene provided the foundation for plant gene engineering against SCMV.     

芜菁花叶病毒欧亚分离物HC-Pro基因的克隆和序列分析

 16个芜菁花叶病毒(Turnip mosaic virus,TuMV)欧亚分离物分别来自奥地利、丹麦、德国、匈牙利、尼泊尔和英国6国。利用免疫捕获反转录PCR(Immunocapture RT-PCR,IC-RT-PCR)对16个分离物的HC-Pro(Helper component pro-teinase)基因进行PCR扩增,扩增产物克隆后进行序列测定,HC-Pro基因序列长度均为1374个核苷酸,编码458个氨基酸。16个分离物的HC-Pro基因核苷酸序列同源性为79.5%~99.8%,所编码的氨基酸同源性为94.1%~99.8%。对16个分离物及GenBank上已报道的其它14个TuMV的HC-Pro基因核苷酸的系统进化树分析表明:在16个TuMV欧亚分离物中,除了来自亚洲的分离物N23属Asian-BR组,其余15个来自欧洲的分离物都属于world-B组,其中分离物H1归属world-wide亚组,另外14个分离物则归属New World亚组。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0％～97.5％之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2％～97.1％之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。     

小麦黄花叶病毒罗田分离物细胞质内含体蛋自基因的序列分析

 利用RT-PCR,获得了小麦黄花叶病毒湖北罗田分离物细胞质内含体(CI)蛋白基因的cDNA克隆。序列分析结果表明,湖北罗田分离物CI基因由1977个核苷酸组成,编码一个由659个氨基酸组成的蛋白质。与已报道的河南潢川、四川雅安、江苏扬州及日本分离物序列比较,不同分离物之间核苷酸序列同源性在95.0%~97.5%之间,相应推导的氨基酸序列同源性在93.2%~97.1%之间。并对CI蛋白的功能进行了讨论。     

中国小麦花叶病毒(CWMV)复制酶基因在病株体内的表达分析

中国小麦花叶病毒(Chinese wheat mosaic virus,CWMV)是引起我国小麦花叶病的重要病原之一,其基因组由2条单链正义RNA片段(RNA1-2)组成。本研究根据发表的基因组序列设计特异性引物,扩增了CWMV复制酶基因的部分片段(nt102~1101),并克隆至原核表达载体pGEX-6P1,然后导入大肠杆菌E.coli BL21(DE3)pLysS中诱导表达。重组的复制酶蛋白经亲和层析纯化后免疫家兔制备多克隆抗体。Western-blot分析表明该抗体具有高度的特异性,能用于病株体内CWMV复制酶蛋白的检测。检测分析显示在病株体内,CWMV基因组RNA1可直接充当其复制酶基因的mRNA;在感染的细胞中,其复制酶组分主要是RNA1 ORF1编码的蛋白,分子量约153 kDa,且特异性地定位于膜结构上。     

影响麦二叉蚜传播玉米矮花叶病毒效率的因素分析

玉米矮花叶病毒（ＭＤＭＶ）在田间主要依靠介质蚜虫非持久性方式传播,通过麦二叉蚜（Ｓｃｈｉｚａｐｈｉｓｇｒａｍｉｎｕｍ）对ＭＤＭＶ传毒效率影响因素的分析,发现接毒蚜获毒前禁食与否及禁食时间的长短与传毒效率呈高度正相关,从蚜量与传毒效率的关系来看,多头蚜虫的传毒效率均比单头蚜高,随着ＭＤＭＶ浓度和传毒蚜量的增加,传毒效率也随之提高,单蚜获毒１０ｍｉｎ后不禁食其传毒效率最高,随着禁食时间的延长,其传毒效     

基于重组酶聚合酶扩增技术的玉米矮花叶病毒快速检测方法的建立

玉米Zea mays L.是重要的粮饲兼用作物。重要检疫性病毒玉米矮花叶病毒maize dwarf mosaic virus(MDMV)一直威胁玉米生产,为预防外来有害生物入侵,本研究以玉米可能携带的MDMV为目标,根据MDMV外壳蛋白(coat protein,CP)保守基因序列,基于重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification,RPA),设计了3对RPA引物,筛选并优化了反应体系,建立了MDMV的快速检测方法,最终的RPA反应体系中引物终浓度为0.4 μmol/L,反应温度为42℃,反应时间为20 min。该方法可特异性检测MDMV,对MDMV CP阳性质粒样品的检测灵敏度可以达到105拷贝/μL(≈369 fg/μL),高于RT-PCR的检测灵敏度。该方法具有快速准确等优点,可用于玉米种子或植株中携带MDMV的检测。     

菜豆普通花叶病毒长豇豆分离物外壳蛋白基因的序列分析及原核表达

 根据普通生物学和血清学特性,长豇豆病毒病的病原被鉴定为黑眼豇豆花叶病毒(Blackeye cowpea mosaic virus,Bl CMV)、豇豆蚜传花叶病毒(Cowpea aphidborne mosaic virus,CABMV)和黄瓜花叶病毒(Cucumbermosaic virus,CMV)。     

辽宁省流行的玉米矮花叶病毒原种类鉴定研究初报

 辽宁省近年发生流行的玉米矮花叶病,经研究鉴定系由玉米矮花叶病毒(Maize dwarf mosaic virus,MDMV)所引起,各玉米产区过去未见此病发生,它危害玉米和高粱,有逐年加重的趋势。     

一个抗玉米矮花叶病新基因位点的发现和细胞学定位

 在抗性遗传研究的基础上,根据等位性分析并通过细胞遗传学研究推断,黄早4所带有的一个抗病基因位于第6染色体长臂上,在Mdm1和T6~9b的易位断点之间,靠近着丝点,相距Mdm1大约在1.9~4.5个交换单位,与易位断点相距33.8个交换单位。该抗病基因不同于已正式命名的位于第6染色体短臂上的抗病显性基因Mdm1,为新的基因位点,该基因对当前流行并造成危害的玉米矮花叶病B株系表现为隐性遗传,建议命名为mdm1(t)。     

MDMV HC-Pro在玉米叶片中的积累及免疫定位

 本文以感病自交系Mo17、掖107和抗病自交系黄早四为材料,研究了玉米矮花叶病毒(MDMV)和MDMV辅助成份-蛋白酶(HC-Pro)在叶片中的积累动态和细胞内定位。结果表明,在接种后3 d,MDMV就在掖107和Mo17接种叶的上位叶积累到了相当高的程度,6 d后达到高峰;而MDMV在黄早四中的浓度一直低于在掖107和Mo17中的浓度。在接种掖107和Mo176 d后,MDMV HC-Pro在上位叶中的积累到达高峰,而在黄早四植株中MDMV HC-Pro直到第9 d才到最高,而且浓度一直低于感病自交系掖107和Mo17。麦二叉蚜从发病植株上获毒后的传毒效率变化与MDMV、MDMV HC-Pro在叶片中的积累动态一致。通过胶体金标记对MDMV HC-Pro进行免疫定位,发现在细胞质中、与质膜相联系的风轮状内含体、片层凝集状内含体、细胞质高密度物质和病毒粒子周围有金标记,说明在这些部位有MDMV HC-Pro的存在。     

基于MaxEnt模型预测玉米矮花叶病毒的潜在适生区

为明确玉米矮花叶病毒 （maize dwarf mosaic virus, MDMV）在未来气候条件下在全球以及我国的潜在适生区,通过整理现有文献记载的MDMV发生分布数据,运用MaxEnt模型与ArcGIS10.2软件预测MDMV在历史和未来2个时间区段不同气候条件下（低胁迫情景SSP126和高胁迫情景SSP585）的潜在地理分布。结果显示,所建MaxEnt模型的受试者工作特征（receiver operatingcharacteristic, ROC）曲线下面积 （area under curve, AUC）值为0.911,表明预测结果可靠性高。MDMV的潜在分布受最冷月最低温 （仅此变量时贡献率最高,为67.9%）和年降水量 （除此变量时贡献率最低,为2.1%）的影响最大。历史气候条件下, MDMV在北美洲、南美洲南部、欧洲、非洲南部及北部、中亚以及大洋洲南部广泛适生;在我国除东北北部、内蒙古自治区东北部、新疆维吾尔自治区南部、西藏自治区北部、四川省东部、广西壮族自治区、广东省和海南省以外的大部分地区适生;未来气候条件下, MDMV在世界范围内的分布呈现北半球向北、南半球向南的变化趋向,在我国的分布则呈现向北收缩趋势。     

两种人工接种方法鉴定RNA干涉介导的转基因玉米对矮花叶病的抗性

本研究采用两种人工接种方法,以玉米成株期病情指数为指标,鉴定了63个转基因玉米株系的田间抗病性。结果表明,T4代转化株系‘47’和‘13h2-3’的抗病性达R抗级,超过抗病对照‘H9-21’。有82.5%(52/63)的转基因株系抗病性比未转化对照显著提高,表明用反向重复的RNA干涉表达载体转化玉米,可获得转基因抗病毒材料,且干涉片段适度延长可增加获得抗病材料的几率。另外,本文通过两种病毒接种方法的比较,发现采用玻璃纤维刷苗床穿刺接种比常规石英砂摩擦接种具有更小的误差。     

水稻草状矮化病毒沙县分离株基因组第六片段的序列分析

 根据已报道的水稻草状矮化病毒(Rice grassy stunt virus,RGSV) IRRI分离株第6片段的RNA序列设计引物,通过RT-PCR得到覆盖RGSV沙县分离株(RGSV-SX)基因组第6片段全长序列的cDNA克隆并进行序列分析,发现其与IRRI分离株的核苷酸序列同源性高达99.3%,并对这一结果的可能原因作出分析。     

几种蚜虫对MDMV传毒效率及其口针中病毒附着位点(VAS)的免疫荧光标记

 本研究在测定了5种蚜虫对玉米矮花叶病毒(MDMV)传播效率的基础上,采用免疫荧光(FITC)标记方法,观察到蚜虫口针中MDMV附着位点(VAS)的存在。结果发现不同蚜虫之间的传毒效率及VAS有一定的差异。其中,以麦二叉蚜(Schizaphis graminum)的传毒效率最高,达66.8%。并且其VAS也最明显,位于口针末端约50μm处。通过试验发现,尽管在VAS存在的情况下,用提纯的不含HC的MDMV进行蚜虫传毒试验,其传毒率为零。只有当HC与MDMV共同存在的情况下才可有效传播。至于蚜虫是如何释放病毒的还不清楚。根据试验结果初步认为,蚜虫对MDMV的传播是一个"识别-吸附-释放"的过程。     

几种蚜虫对MDMV传毒效率及其口针中病毒附着位点(VAS)的免疫荧光标记

 本研究在测定了5种蚜虫对玉米矮花叶病毒(MDMV)传播效率的基础上,采用免疫荧光(FITC)标记方法,观察到蚜虫口针中MDMV附着位点(VAS)的存在。结果发现不同蚜虫之间的传毒效率及VAS有一定的差异。其中,以麦二叉蚜(Schizaphis graminum)的传毒效率最高,达66.8%。并且其VAS也最明显,位于口针末端约50μm处。通过试验发现,尽管在VAS存在的情况下,用提纯的不含HC的MDMV进行蚜虫传毒试验,其传毒率为零。只有当HC与MDMV共同存在的情况下才可有效传播。至于蚜虫是如何释放病毒的还不清楚。根据试验结果初步认为,蚜虫对MDMV的传播是一个"识别-吸附-释放"的过程。     

小麦黄色花叶病毒不同分离物外壳蛋白(CP)基因序列的比较分析

 核苷酸序列分析结果表明,小麦黄色花叶病毒(W YMV)不同分离物的外壳蛋白基因存在一定的差异。邓州分离物CP基因在其31~33nt处均缺失了3个核苷酸,其余分离物与潢川分离物及日本分离物长度一致,均为882nt。不同分离物CP基因核苷酸序列同源性为97.3%~98.9%,由此推导的氨基酸序列同源性为97.6%~99.3%,外壳蛋白N末端的110个氨基酸和C末端的55个氨基酸在各个分离物间是高度保守的。潢川分离物有5个氨基酸与其它5个分离物明显不同。WYMV不同分离物外壳蛋白序列分析结果进一步确认了WYMV与WSSMV为Bymovirus属的2种不同病毒。