2013－2019年广西边境地区低致病性禽流感病毒监测分析

为了解广西边境地区低致病性禽流感病毒（low pathogenic Avian influenza virus，LPAIV）的流行情况，本研究对2013-2019年在广西边境地区的规模养殖场和活禽市场采集的33 964份家禽棉拭子样品，采用鸡胚接种方法进行病毒分离，并结合血凝抑制试验和RT-PCR等方法鉴定禽流感病毒的亚型。结果显示，共有3 892份样品分离到LPAIV，2013-2019年的样品病毒分离率分别为17.39%、11.23%、13.59%、9.31%、9.09%、9.12%和15.21%，总分离率为11.46%，其中2013年样品的病毒分离率最高。分离到的LPAIV包括H1、H3、H4、H6、H9、H10和H11 7种亚型，样品病毒分离率分别为0.14%、4.37%、0.19%、4.06%、2.69%、0.01%和0.003%。其中活禽市场分离到H1、H3、H4、H6、H9、H10和H11 7种亚型流感病毒，样品病毒分离率分别为0.19%、5.53%、0.21%、5.29%、3.41%、0.01%和0.004%，总分离率为14.64%；而养殖场分离到H3、H4、H6和H9 4种亚型流感病毒，样品病毒分离率分别为1.26%、0.12%、0.79%和0.78%，总分离率为2.95%，养殖场的分离率远低于活禽市场（14.64%）。鸡源样品的病毒分离率为5.77%，水禽样品的病毒分离率为15.10%，环境样品的病毒分离率为21.67%，水禽和环境样品的病毒分离率远高于鸡。结果表明，当前广西边境地区家禽携带多种亚型LPAIV，水禽是高风险禽群，应进一步加强监测和防控；活禽市场污染严重，应进一步加强对活禽市场的监管力度，建立和实施更加科学有效的活禽市场运营机制。     

一株H9N2亚型禽流感病毒鸡胚培养工艺研究

为了探讨H9N2亚型禽流感病毒在鸡胚上最佳培养工艺,试验采用H9N2亚型禽流感病毒分离株以不同稀释倍数接种不同鸡胚(SPF及普通鸡胚)、不同日龄鸡胚及不同培养时间收获鸡胚尿囊液,比较不同培养条件下制备出的鸡胚尿囊液的产量及病毒效价。结果表明:H9N2亚型禽流感病毒接种无禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~(4 )～1×10~5倍,接种带有禽流感病毒(H9亚型)HI母源抗体鸡胚的最佳病毒稀释倍数为1×10~3～1×10~4倍,最佳接种日龄为10日龄,最佳培养时间为96～120 h。说明采用优化的鸡胚培养方法生产H9N2亚型禽流感病毒可以得到高质量、高产量的病毒液。     

华东某活禽市场新城疫病毒和低致病性禽流感病毒的初步分离与鉴定

为了解春季活禽市场新城疫病毒(NDV)和低致病性禽流感病毒(LPAIV)的携带情况,2016年3~4月采集华东某活禽市场健康家禽的泄殖腔新鲜棉拭样品100份(鸡源样品40份,鸭源28份,鹅源32份)。以鸡胚接种方法分离病毒,接种后5 d收集鸡胚尿囊液用于血凝试验,共获得7株具有HA活性的病毒,均来源于水禽。采用双重RT-PCR对分离毒株进行鉴定,同时对NDV的F基因和AIV的M基因进行扩增,并对扩增的测序进行分析。结果显示:从样品中分离到NDV 4株,为ClassⅠ系列毒株;分离到AIV 3株,M基因遗传演化分析显示,其中2株病毒与国内流行的H6亚型AIV遗传关系较近,另外1株病毒与国内流行的H9亚型AIV毒株遗传关系较近。     

鸡血清4型禽腺病毒与HH9亚型禽流感病毒亚型禽流感病毒、新城疫病毒混合感染的鉴定

试验对临床疑似血清4型禽腺病毒与H9亚型禽流感、新城疫混合感染鸡的病例进行了病毒分离与鉴定。通过接种鸡胚、血凝和血凝抑制试验、琼脂扩散试验、PCR鉴定,确定该病例为三种病毒混合感染。动物回归试验证明,1 000 ELD_(50)病毒量对2日龄SPF鸡致死率达到100%,剖检病变呈现典型心包积液-肝炎综合征,而H9亚型禽流感和新城疫病变特征不明显,说明混合感染中血清4型禽腺病毒病变非常典型,H9亚型禽流感和新城疫则呈现非典型病变。     

H6亚型禽流感病毒的分离鉴定与生物学特性分析

为了解低致病性禽流感病毒(LPAIVs)在广西地区家禽中的流行情况,对广西地区活禽市场的家禽进行LPAIVs流行病学监测,分离鉴定出7株H6亚型禽流感病毒(AIV)。通过在广西地区活禽市场采集家禽咽喉和泄殖腔棉拭子样品,将其接种SPF鸡胚,收集尿囊液进行HA和HI试验,结果显示这7株只与H6亚型AIV的阳性血清发生反应,产生血凝抑制现象,初步鉴定为H6亚型AIV。通过HA和NA基因的克隆与测序鉴定,进一步确定为H6亚型AIV,与NA基因存在5种组合,包括H6N1、H6N2、H6N5、H6N6和H6N8。鸡致病性试验表明分离株可感染但不致死SPF鸡,并通过咽喉和泄殖腔排毒,结合HA裂解位点附近的氨基酸序列,表明所分离到的7株H6亚型AIV符合LPAIV的特征。     

禽流感H9亚型SD696株疫苗生产工艺改进试验

分别采用10日龄和12日龄SPF鸡胚增殖禽流感H9亚型SD696株病毒,并改变后孵化温度,将死亡高峰期、最终死亡率、平均单胚收获量、尿囊液血凝价HA、病毒含量EID50进行对比,结果表明用12日龄SPF鸡胚比用10日龄SPF鸡胚增殖禽流感H9亚型SD696株病毒,死亡高峰期推迟12-24 h,最终死亡率、尿囊液的HA和EID50无差异,平均单胚收获量提高了2-3mL。35℃培养比37℃培养鸡胚死亡高峰期延迟、最终死亡率降低、平均单胚收获量提高、尿囊液的血凝价HA及病毒含量EID50偏高。选择12日龄SPF鸡胚,35℃培养温度为生产工艺,既提高疫苗产量,降低成本,又能够提高产品的质量。     

H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2012年10月,在江苏省已进行过禽流感疫苗免疫的某肉鸡养殖基地,出现了一种以严重呼吸障碍、气管栓塞、突发死亡为特征的疾病。取典型病例鸡脑、肺脏、脾脏、咽拭子和泄殖腔拭子,经过初步处理后,接种于9日龄SPF鸡胚,经过培养纯化,获得一株病毒。通过血凝试验、血凝抑制试验和分子生物学试验以及动物回归试验等研究,最终确诊该病为H9亚型禽流感,分离的病毒为H9亚型禽流感病毒。     

四株Ⅰ群禽腺病毒的分离与鉴定

将从临床采集的发病鸡组织处理后经绒毛尿囊膜接种7日胚龄SPF鸡胚,通过PCR方法对鸡胚培养物进行鉴定,确定分离到4株Ⅰ群禽腺病毒。结合免疫学试验、病理学试验以及动物回归试验对病毒进行特性研究,结果表明分离的病毒均能致鸡死亡并表现出临床症状。使用针对Ⅰ群禽腺病毒Hexon基因的特异性引物对病毒进行基因测序分析发现,分离株均属于基因C型血清4型禽腺病毒。     

5-氟脱氧尿核苷对SPF鸡胚最适浓度的测定及对禽痘病毒的抑制作用

用不同浓度的5-氟脱氧尿核苷(FUdR)接种10日龄SPF鸡胚,每个浓度分别接种5枚鸡胚,0.2 mL/枚,同时,设接种同剂量生理盐水的空白对照SPF鸡胚5枚,置37℃孵化培养。18日龄时全部打开鸡胚,观察鸡胚变化。将试验组鸡胚与对照组相比较,以接种鸡胚全部不出现任何异常变化的药物浓度确定为最适浓度。试验结果表明FUdR对10日龄鸡胚的最适浓度为250μg/mL,此浓度对禽痘病毒(属DNA病毒)的生长有明显的抑制作用。试验表明,以10日龄SPF鸡胚作为试验动物,可以用FUdR鉴定病毒的核酸类型。     

鹅禽Ⅰ型副粘病毒病的快速鉴别诊断

用禽流感免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽流感或禽Ⅰ型副粘病毒感染的鹅病例,结果为禽流感阴性;取病鹅肝、脾混合病料进行病毒分离,分离鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞(RBC),HA滴度为6 log2,并可被康复鹅血清、抗鸡新城疫(NDV)阳性血清所抑制,而不能被禽流感(H5、H9)标准阳性血清抑制。分离病毒人工感染易感雏鹅,引起100%的发病和死亡,并有与自然病例相似的症状和病变;人工感染42日龄SPF鸡出现100%的发病和死亡。根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定,证明该鹅群患禽Ⅰ型副粘病毒病。说明用禽流感免疫胶体金试验可以实现对禽流感、禽Ⅰ型副粘病毒病的快速鉴别诊断。     

鹅禽I型副粘病毒病的快速鉴别诊断

用禽流感免疫胶体金试验诊断一发病率高、死亡快、疑似禽流感或禽I型副粘病毒感染的鹅病例，结果为禽流感阴性；取病鹅肝、脾混合病料进行病毒分离，分离鸡胚尿囊液能凝集鸡红细胞（RBC），HA滴度为6log2，并可被康复鹅血清、抗鸡新城疫（NDV）阳性血清所抑制，而不能被禽流感（H5、H9）标准阳性血清抑制。分离病毒人工感染易感雏鹅，引起100％的发病和死亡，并有与自然病例相似的症状和病变；人工感染42日龄SPF鸡出现100％的发病和死亡。根据临床症状和病变情况、免疫胶体金试验以及病毒分离和鉴定，证明该鹅群患禽I型副粘病毒病。说明用禽流感免疫胶体金试验可以实现对禽流感、禽I型副粘病毒病的快速鉴别诊断。     

2株H9N2亚型禽流感病毒对鹌鹑的致病性

选用分离于湖北省某2个城市活禽市场的2株鸡源H9N2亚型禽流感病毒毒株(A/chicken/Daye/DY0602/2017)和(A/chicken/Jinmen/JM0305/2017),将病毒以10~(7.0) EID_(50)/100μL的剂量滴鼻感染28日龄鹌鹑,均未见明显的临床症状。组织病理学结果显示,2个毒株均可导致鹌鹑心脏、肺脏、气管、喉头较为严重的病理损伤,且毒株DY0602感染组鹌鹑比毒株JM0305感染组鹌鹑心脏、肺脏组织表现出更严重的病理损伤;免疫组化结果显示,毒株DY0602感染组鹌鹑肺组织中病毒表达量更高。这些数据表明,鹌鹑对活禽市场鸡源H9N2亚型禽流感病毒易感,并且不同地区的H9N2亚型禽流感病毒可以导致鹌鹑表现出明显的致病性差异,建议加强对活禽市场H9N2亚型禽流感病毒的检测,进而及时为鹌鹑禽流感的防控制定有效措施。     

雏鸡传染性脑脊髓炎病毒的分离与初步鉴定

用神经胶质细胞培养和6日龄SPF鸡胚卵黄囊接种,分离出一株病毒,经免疫荧光及琼脂扩散试验,证明该病毒为禽传染性脑脊髓炎病毒.     

禽脑脊髓炎病毒HMM08株的分离鉴定及生物学特性研究

为明确禽脑脊髓炎(AE)病毒自分离流行毒株的生物学特性,以用于禽脑脊髓炎灭活疫苗的研制,以发病雏鸡脑组织为材料,进行SPF鸡回归试验、PCR检测、SPF鸡胚分离培养有限稀释纯化、特异性试验等,得到一株禽脑脊髓炎病毒,命名为HM08株,对该分离毒株的生物学特性进行研究的结果表明:该毒株纯净、无外源病毒污染,E1代病毒含量达到10~(5.56)EID_(50)/0.2 mL,E2代至E15代病毒含量稳定在10~(7.0)EID_(50)/0.2 mL以上;100倍稀释的E1代毒种,经卵黄囊途径接种6日胚龄SPF鸡胚,12 d内,引起AE特征性病变的病变率达100%;用E1代毒按照500 EID50/只对1日龄、7周龄的SPF鸡脑内接种,出现AE特征性病变的病变率达100%;以该毒制成的疫苗0.3 mL/羽份免疫鸡,能获得100%保护。表明HM08株是一株较好的AE疫苗候选毒株。     

中药笃温康体内外的抗病毒作用效果研究

本试验旨在研究笃温康的体内外抗病毒效果。以H9亚型禽流感病毒为供试病毒,将不同含量病毒与笃温康混合并接种于SPF鸡胚,72 h后无菌收取每个鸡胚尿囊液,用0.75%鸡红细胞测定尿囊液血凝价;以H9亚型禽流感病毒和传染性支气管炎病毒混合液为供试病毒,人工感染SPF鸡,感染后不同时间用笃温康进行治疗,观察其病理变化。试验结果表明,笃温康体外能够抑制病毒10倍稀释液对0.75%鸡红细胞的凝集,对H9禽流感病毒在鸡胚内复制具有抑制作用。提示笃温康对感染IBV病毒、H9禽流感病毒的SPF鸡具有较好的保护作用,而且随着笃温康用量的增加,其保护作用增强。     

2015—2019年广西柳州市活禽市场低致病性禽流感病毒监测

为了解广西柳州市活禽市场低致病性禽流感病毒的流行及分布情况,2015年6月—2019年5月持续在柳州市8个活禽市场采集鸡鸭喉头/泄殖腔棉拭子样品1 425份(麻花鸡500份、麻鸭925份),通过SPF鸡胚培养,采用HA和HI试验进行鉴定,并对结果进行统计分析。结果显示:共检出阳性样品156份,阳性率为10.95%(156/1 425);分离出6种亚型,阳性率从高到低依次为H3、H4、H9、H6、H11和H13,其中H13亚型为广西地区首次报道发现,样品来源于麻鸭;从种属分布和混合感染情况来看,鸭群中6种亚型均有感染,但以H3、H4亚型为主,主要表现为混合感染,而鸡群中只有4种亚型,以H9亚型为主。结果表明,柳州市活禽交易市场低致病性禽流感病毒亚型复杂,尤其是麻鸭,且有新亚型出现,病毒变异重组风险加剧,需要坚持活禽市场禽流感病毒长期监测。     

8株H9亚型禽流感病毒的分离鉴定与抗原交叉保护性分析

为了探讨河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒的流行情况及抗原的差异性,试验采用病毒分离鉴定及交叉攻毒免疫保护试验对8株H9亚型禽流感病毒进行了抗原差异性分析。结果表明:利用SPF鸡胚从疑似感染H9亚型禽流感病毒的病料中分离鉴定出8株病毒,这8株病毒诱导的SPF鸡产生的HI抗体效价基本相同,能抵抗不同毒株的攻击。说明河南省鹤壁市H9亚型禽流感病毒流行毒株间具有较好的交叉保护力。     

3株H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

为了获得H9亚型禽流感病毒(AIV)流行毒株并掌握流行毒株的分子特征和致病性,采用病毒分离、血凝性试验、鸡胚半数感染量(EID₅₀)测定、HA基因序列分析、致病性试验、交叉保护性试验等对3份临床疑似H9亚型AIV感染病料进行了研究。结果:3份临床病料样品可引起10日龄SPF鸡胚规律性死亡,3株分离毒株对1%鸡红细胞的凝集效价分别10log₂、11log₂和10log₂;对SPF鸡胚的EID₅₀分别为10^-8.83/mL、10^-9.50/mL和10^-9.0/mL;与2018年上海分离毒株亲缘关系较近,进化树处于同一分支;对SPF雏鸡的发病率分别为80%、100%和90%;均未引起SPF雏鸡死亡;彼此之间具有100%的交叉保护率,商品化禽流感(H9亚型)灭活疫苗对3株分离毒株的保护率分别为100%、90%和100%。本试验成功分离鉴定到了3株低致病性H9亚型AIV流行毒株,并证实当前商品化疫苗对H9亚型AIV流行毒株仍具有较好的保护效果。     

山东省鸡新城疫病毒弱毒株的初步分离

某鸡场饲养的罗曼产蛋鸡群爆发了典型的新城疫 ,采集病料接种11日龄SPF鸡胚进行病毒分离。经致鸡胚病变、回归试验、血凝和血凝抑制试验结果表明 ,所分离到的病毒系鸡新城疫病毒弱毒株 ,定名为NDV—S1。     

草鸡源H9亚型禽流感病毒的分离与鉴定

2010年4月,安徽省某草鸡养殖场发生一起以严重呼吸困难、急性死亡为特征的病例。取发病典型的鸡内脏,按常规方法处理后,接种10日龄SPF鸡胚,经有限稀释法纯化,获得一株病毒,通过HA、HI、分子生物学以及动物回归等试验,最终确诊该病为H9亚型禽流感。