ST细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了筛选与猪细小病毒（porcine parvovirus,PPV）结构蛋白VP2相互作用的宿主蛋白,深入研究病毒入侵及致病的分子机制,本试验建立了ST细胞酵母双杂交cDNA文库。采用RNeasy Min Kit提取ST细胞的总RNA,反转录合成cDNA第一链之后,通过SMART技术合成了双链cDNA,并利用同源重组的方法,构建了ST细胞的酵母cDNA文库。结果显示,文库滴度为8.1×10⁸ CFU/mL,插入的双链cDNA片段大小为250~1 000 bp,平均大小约为500 bp,文库的重组率为96%。此文库可用于筛选与病毒相互作用的ST细胞宿主蛋白,为进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础。     

梨酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

酵母双杂交是检测蛋白质之间相互作用的有效手段。构建梨酵母双杂交cDNA文库,能为利用酵母双杂交技术探究梨基因功能的互作机制提供技术支撑。本研究以沙梨主栽品种‘圆黄’梨的叶片和果肉为材料,采用Trizol法提取其RNA,利用SMART技术经LD-PCR合成全长cDNA,通过同源重组法与pGADT7载体连接,再电转化至大肠杆菌菌株。经检测,构建的cDNA文库滴度为1.76×108 cfu/mL,文库片段插入阳性率为100%,片段长度主要分布在600~1500 bp。该研究结果表明,构建的cDNA文库质量较高,完整性较好,能为后续利用酵母双杂交技术鉴定基因的互作蛋白奠定基础。     

金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库的构建和鉴定

以四川省金堂黑山羊卵巢为材料,从其卵巢组织中提取总RNA,应用SMARTTM cDNA library construction技术,构建以真核表达栽体pGAT17-Rec为基础的黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库.结果表明,提取的RNA的A260/A280为1.95,28S与18s带浓度及亮度比值约为2.文库ds cDNA弥散较长,分布在0.2～3 kb,成瀑布条带状,而且在接近1 kh的区域有密集的条带,为高丰度表达基因.根据生长菌落计数,共获得1.6×106个转化子,文库插入片段大小约为0.1～2 kb.成功构建了金堂黑山羊卵巢酵母双杂交cDNA文库,为黑山羊多胎相关因子的基因筛选奠定了基础.     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

为了更系统的研究病毒在猪肠道内侵入及致病的分子机制,本试验以猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cells,IEC)为模型,应用RNeasy Min Kit从猪IEC中提取细胞总RNA,反转录后,利用SMART技术合成双链cDNA(ds-cDNA),通过同源重组的方法构建猪IEC酵母双杂交cDNA文库。结果显示,文库的滴度为8.4×10⁸ CFU/mL,插入的ds-cDNA片段大小为0.5~2.0 kb,平均长度约为1.1 kb,文库重组率为100%。此文库为筛选与猪腹泻病毒相互作用的宿主蛋白及进一步阐明病毒的致病机制奠定了基础,为研制有效的药物或疫苗提供了依据。     

Vero E6细胞酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

To seek out proteins which interact with structural proteins of porcine epidemic diarrhea virus （PEDV） in Vero E6 cells and study the mechanisms of viral infection.We created a Vero E6 cDNA yeast hybrid library. The total RNA of Vero E6 was extracted using Trizol method, and double strands cDNA was synthesized by SMART technique. We created a Vero E6 cDNA library by using homologous recombination in yeast. The results showed that the titer of cDNA library was 9.7×10⁸ CFU with the average of inserted fragments about 1.6 kb, and the recombination rate was 87%. These data indicated that the yeast two-hybrid cDNA library of Vero E6 was successfully constructed and might be useful for screening the host proteins interacting with structure protein of PEDV.     

牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA文库的构建及鉴定

旨在构建酵母双杂交牛源犬新孢子虫cDNA表达文库,进而为研究新孢子虫功能结构以及为其入侵宿主致病机理研究提供良好的试验体系。体外培养牛源犬新孢子虫延边株,纯化并提取虫体总RNA,应用SMART技术合成双链cDNA(ds cDNA)。利用CHROMA SPINT+TE-400Columns纯化柱纯化ds cDNA,并与线性化的p GADT7-Rec共转化酵母菌菌株Y187,以同源重组的方式在酵母细胞内构建牛源犬新孢子虫酵母双杂交cDNA表达文库。结果显示,文库容量为5.78×108cfu/m L,随机挑取23个单克隆进行菌落PCR检测,插入的双链c DNA片段大小为400~4 000 bp,平均长度在2 000 bp左右,文库重组率为100%,此文库可用于酵母双杂交筛选。试验为筛选新孢子虫与宿主之间相互作用蛋白研究奠定了基础。     

猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)与猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)蛋白质间相互的作用,本研究使用SMART技术成功构建了猪肺泡巨噬细胞酵母双杂交cDNA文库。首先提取PAM总RNA,使用SMART RACE法经LD PCR合成双链cDNA,运用SMART技术,通过同源重组的方法将双链cDNA与pGADT7-Rec质粒共转化进酵母Y187感受态,再利用营养缺陷的方法在SD/-Leu平板上筛选阳性克隆,最终构建的文库滴度达到了6.96×10~7 CFU/mL,重组率初步计算达到95%,插入片段范围在200~2 000bp。本研究为PRRSV致病蛋白的筛选以及相关疾病的研究奠定了基础。     

猪小肠上皮细胞酵母双杂交cDNA文库的构建

猪小肠上皮细胞(intestinal epithelial cell,IECs)是猪流行性腹泻病毒(Porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)在宿主体内感染的靶细胞,为了研究PEDV在体内与宿主细胞蛋白之间的互作关系以便于揭示其致病机理,本研究以IECs为研究对象,提取了IECs的总RNA,利用SMART技术经过反转录、扩增和纯化获得双链cDNAs后,将其与pGADT7-Rec和carrier DNA共同转化至酵母Y187菌株,进行选择性培养基(SD/-Leu)筛选以及文库容量及质量的鉴定。结果显示,本研究构建的IECs-cDNA文库其库容量为1.3×10~8 pfu/mL,插入cDNA片段长度为250～2500 bp,文库阳性率达100%。本研究结果表明构建的IECs-cDNA文库具有较好的多态性,为后续研究PEDV与宿主细胞蛋白之间的互作关系提供了有力支持。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。     

柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的构建

为了筛选柔嫩艾美耳球虫子孢子入侵相关的蛋白,利用酵母双杂交体系构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库。提取纯化的子孢子总RNA,经MMLV-RT反转录合成cDNA第一链后,利用LD-PCR扩增合成双链cDNA(ds cDNA),dscDNA经纯化柱CHROMA SPINT+TE-400 Columns纯化剔除小于200 bp的片段。将纯化后dscDNA、pGADT7-Rec及Carrier DNA共转化到已经制备好的酵母感受态细胞Y187中,dscDNA与pGADT7-Rec以同源重组的方式在细胞内进行连接,经过缺陷性培养基(SD/-Leu)的筛选得到酵母双杂交cDNA文库。结果显示,构建的柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库的转化率为4.33×105/μg pGADT7-Rec,文库滴度为3.62×107 cfu/m L。随机挑取32个单克隆进行PCR检测,插入片段大小为200~2000bp,重组率为93.75%,并以该文库作为模板,用柔嫩艾美耳球虫5对特异性引物进行PCR扩增,获得了这5个基因片段。结果表明成功构建了柔嫩艾美耳球虫子孢子酵母双杂交cDNA文库,为进一步筛选和研究球虫入侵互作蛋白奠定了基础。     

MDCC-MSB1细胞酵母双杂交cDNA表达文库的构建与鉴定

提取生长状态良好的MDCC-MSB1细胞的mRNA,以5'端标记有生物素的Oligo dT primer为引物反转录,合成双链后连接Adapter。分级纯化后,通过BP重组反应构建入门文库,滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.1×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1190 bp,阳性重组率为100%。入门文库扩增后提取质粒,通过LR重组反应转化为表达文库,平均滴度为1×10⁵ CFU/mL,文库总容量为1.2×10⁶ CFU,平均插入片段长度为1087 bp,重组率为100%。构建的表达文库具有较高的质量,为研究鸡传染性贫血病毒的受体及其细胞嗜性奠定了基础。     

牛骨骼肌酵母双杂交cDNA文库构建

为构建应用于酵母双杂交系统的牛骨骼肌cDNA文库,利用Trizol法提取牛骨骼肌总RNA,采用SMART技术PCR扩增合成cDNA第二链片段,并与文库线性载体pGADT7-Rec共转化酵母菌Y187构建酵母双杂交文库。结果显示文库容量达到1．7×10^7cfu／mL,插入片段主要在0．5～3kb范围内,文库重组率为80％。以上结果表明该文库质量好,能够通过筛选文库得到与目的蛋白相互作用的蛋白质。     

酵母双杂交随机肽库的设计及构建

构建一个含16个氨基酸的酵母双杂交随机肽库,设计合成编码16肽的随机DNA片段,PCR扩增随机DNA片段,经限制性内切酶BamHI和EcoRI酶切后克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,构建酵母双杂交随机肽库质粒pGADT7GH-RP并检验其库容。结果表明,扩增获得编码16肽的随机DNA片段,并成功将随机DNA片段克隆入酵母表达质粒pGADT7GH,与GAL4AD形成融合蛋白,其库容为1.28×107。从而成功地构建了酵母双杂交随机肽库。     

豫南黑猪心脏cDNA文库的构建与鉴定

以豫南黑猪心脏为供试材料,采用改进的异硫氰酸胍法提取心脏总RNA。通过SMART技术反转录合成全长cDNA,经LD-PCR扩增后与pMD18-T载体连接并转化细菌DH5α,测定滴度和重组率,构建成豫南黑猪心脏全长cDNA文库。经初步检测,原始文库的滴度为1.8×10^5cfu/mL,重组率约为94.4%。从原始文库随机挑取13个单菌落过夜培养,提取质粒,经HindⅢ和EcoRⅠ双酶切,凝胶电泳显示插入片段大小在0.3～2.0kb之间。     

绵羊DRA基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

根据绵羊DRA基因序列和酿酒酵母表面展示载体pYD1上的多克隆位点设计特异性引物,从绵羊组织中提取总RNA并逆转录,利用PCR技术扩增得到DRA基因,克隆获得762 bp目的片段,并提交GenBank,登录号:KR422362。将该基因通过双酶切连接到表面展示载体pYD1 上,成功构建了酿酒酵母表面展示重组质粒pYD1-DRA。将DRA基因外显子2两端进行基因点突变,形成新的酶切位点,继而对外显子2设计特异性引物,对绵羊大样本进行DNA池化,并将外显子2扩增产物测序,分析其多态性获得多态位点。重组质粒双酶切得到246 bp具有多态性的外显子2,将其连接到经同样酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRA-TB上,成功构建了酿酒酵母表面展示库。将其转化用于表面展示的酿酒酵母EBY100感受态细胞中,得到酵母转化子,挑取酵母菌的单克隆通过PCR 扩增及序列测定证实了DRA基因库已成功整合到酿酒酵母基因组中。经半乳糖诱导后,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测得到DRA基因库已成功展示在酵母细胞表面。     

成人肝cDNA文库的构建

用异硫氰酸胍／盐酸胍法从人肝组织中提取ＲＮＡ，通过Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）纤维柱分离出ｍＲＮＡ。以ｍＲＮＡ为模板，含ＮｏｔⅠ接头的Ｏｌｉｇｏ（ｄＴ）为引物，在逆转录酶ＳｕｐｅｒＳｃｒｉｐｔⅡＲＴ催化下合成单链ｃＤＮＡ（ｓｓｃＤＮＡ），再在Ｅ．ｃｏｌｉＤＮＡ聚合酶Ⅰ与ＲＮａｓｅＨ和ＤＮＡＬｉｇａｓｅ共同作用下，ｓｃＤＮＡ拷贝成双链ｃＤＮＡ（ｄｓｃＤＮＡ）。经放射自显影测定，合成有全长ｃＤＮＡ片段。平末端ｄｓｃＤＮＡ与ＳａｌⅠ接头连接，ＮｏｔⅠ酶切后，通过过柱取掉小于５００ｂｐ的ｃＤＮＡ片段，大片段ｃＤＮＡ与载体ｐＳＰＯＲＴ１连接，转化受体菌ＤＨ５α，经稀释测定出含有重组子的文库大小为３．３×１０６。该文库适合于筛选低丰度ｍＲＮＡ的ｃＤＮＡ克隆。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHCⅡDRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在105个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。     

绵羊DRB1基因外显子2酵母表面展示库的构建及鉴定

为了揭示布鲁氏菌病的致病机制并研制其新型分子疫苗,试验利用酿酒酵母展示系统展示绵羊白细胞表面抗原DRB1基因,构建DRB1基因外显子2的酵母表面展示库。参照GenBank中绵羊MHC Ⅱ DRB1基因序列设计引物,以绵羊脾脏组织cDNA为模板,反转录扩增得到预期长度的产物,双酶切连接到克隆载体pEASY-T1,命名为pEASY-T1-DRB1。双酶切连接到表面展示载体pYD1上,成功构建了表面展示重组质粒pYD1-DRB1。以pEASY-T1-DRB1为模板,将DRB1基因外显子2两端进行点突变,产生新的酶切位点,然后对外显子2设计特异性引物。对500个绵羊样本进行DNA池化,扩增DRB1基因外显子2序列,双酶切后连接到经相同酶双酶切的表面展示重组突变载体pYD1-DRB1-TB上,构建酿酒酵母表面展示库。转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,计算库容量。将其转化酿酒酵母EBY100感受态细胞,经半乳糖诱导,通过免疫荧光法在荧光显微镜下检测。结果显示,绵羊DRB1基因成功整合到酵母基因组中,酵母展示库的库容量在10⁵个以上,DRB1基因库成功展示在酵母细胞表面。由此说明,该库可用于下一步布鲁氏菌抗原肽的筛选。