绿盲蝽超气门蛋白ALUSP的克隆、原核表达及纯化

【目的】克隆绿盲蝽超气门蛋白基因（ALUSP）,获得原核表达的重组蛋白,为ALUSP的功能研究奠定基础,也为进一步解析绿盲蝽蜕皮及变态发育的机制提供理论依据。【方法】根据已知昆虫的USP基因序列设计简并引物,获得ALUSP的保守序列;再通过设计特异性引物,利用RACE方法,分别克隆ALUSP 5′及3′段序列,然后通过拼接获得ALUSP全长序列;应用生物信息学方法,对ALUSP基因序列特征及其所编码蛋白的特性进行分析,建立系统进化树;将含有ALUSP的T载体经EcoR I及Xho I双酶切,构建ALUSP原核表达载体pEGX6P1-ALUSP,将该表达载体分别在15、25、30和37℃条件下进行诱导表达,再通过GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析后获得ALUSP功能区纯化蛋白。【结果】ALUSP开放阅读框长1 005 bp,编码334个氨基酸,预测分子量56.63 kD,理论等电点8.42;序列特征分析表明,该基因翻译后的蛋白质具有超气门蛋白的典型特征,由A/B域（249 bp）、C域（198 bp）、D域（69 bp）和E域（489 bp）组成,其中C域高度保守,包含2个锌脂结构并含有1个P-盒和1个D-盒,且含有由8个氨基酸构成的核定位信号,D域含有1个识别DNA元件的T-盒,E域含有1个由8个α螺旋和1个β折叠形成袋状结构;氨基酸比对结果表明,ALUSP的氨基酸序列与稻绿蝽USP序列一致性最高（57.82%）,与其他昆虫的USP序列一致性较低,如膜翅目的Melipona scutellaris（46.05%）、Scaptotrigona depilis（45.94%）;系统进化树分析结果显示,半翅目与膜翅目、直翅目等昆虫的USP较为分化,位于不同分支,ALUSP与稻绿蝽USP进化关系最近,可能来源于共同的祖先。EcoR I和Xho I双酶切的重组克隆载体可成功亚克隆到pEGX-6P-1载体上,命名为pEGX6P1-ALUSP;经37℃、1.0 mmol•L-1的IPTG诱导的pEGX6P1-ALUSP重组质粒可特异性表达1个约65 kD的蛋白,并且该重组ALUSP蛋白主要以包涵体形式存在;收集含有目的基因的菌株进行GST琼脂糖亲和层析和分子筛层析,最后进行复性和纯化后在65 kD附近仅出现1条清晰的特异性条带,表明已得到纯化的靶蛋白。【结论】克隆了ALUSP全长,其具有昆虫超气门蛋白的典型特征,并获得了原核表达的重组蛋白。     

绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1的克隆、表达谱分析及结合特征

 【目的】克隆、组织特异性表达以及荧光结合特征分析绿盲蝽 (Apolygus lucorum Meyer-Dür)化学感受蛋白（chemosensory protein,CSP）。【方法】设计特异性引物,用RT-PCR技术克隆绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,使用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术对AlucCSP1组织特异性表达进行研究,在BL2（DE3）工程菌株中用pGEX-4T-1载体进行原核表达,并在GSTrap FF柱中纯化和去标签蛋白。使用bis-ANS作为荧光配基,研究AlucCSP1蛋白与58种气味标样和5种棉花次生代谢物质的结合特征。【结果】得到了绿盲蝽化学感受蛋白基因,命名为AlucCSP1（GenBank登录号：JN573217）。该序列阅读框全长393 bp,编码130个氨基酸残基,N端有一段长17个aa的信号肽,具有4个保守的半胱氨酸残基。绿盲蝽AlucCSP1几乎全部在雌虫触角中表达。构建pGEX/AlucCSP1原核表达载体,在BL21（DE3）工程菌株中表达出分子量约为39 kD的融合蛋白,用亲和层析法纯化、经凝血酶作用去除标签蛋白获得纯化的AlucCSP1蛋白,该蛋白与棉酚、单宁、槲皮素、芦丁水合物亲和力较强,结合常数分别为13.4、32.7、19.7、38.5 μmol•L-1。【结论】克隆得到绿盲蝽化学感受蛋白基因AlucCSP1,在雌性触角内特异表达,并进一步得到约13 kD的AlucCSP1纯蛋白。为研究AlucCSP1在绿盲蝽化学感器中的作用奠定了基础。     

绿盲蝽G蛋白偶联受体激酶2基因（Al GRK2）的表达分析及在绿盲蝽生长发育中的功能

【目的】克隆绿盲蝽(Apolygus lucorum)G蛋白偶联受体激酶2基因(AlGRK2)cDNA序列,明确其时空表达谱,阐明外源蜕皮激素(20E)对AlGRK2表达的影响,分析AlGRK2在绿盲蝽生长发育中的作用,为进一步研究其在蜕皮激素信号转导通路中的功能打下基础。【方法】RACE法克隆获得AlGRK2全长,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析不同日龄绿盲蝽及雌成虫不同组织中AlGRK2的表达谱,分析外源20E诱导及RNAi处理后,AlGRK2 mRNA表达的应答反应及对绿盲蝽生长发育主要参数(发育历期、若虫体重及成虫羽化率)的影响。【结果】AlGRK2 cDNA序列全长2 715 bp,开放阅读框2 106 bp,编码701个氨基酸,ExPASy预测其蛋白分子量为80.2 kD,理论等电点为6.56;蛋白结构分析显示AlGRK2包含4个结构域,即G蛋白信号调节区(RGS,54—175 aa)、丝氨酸/苏氨酸激酶结构域(S-TKc,191—454 aa)、丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶的伸展部分(S-TK-X,455—534 aa)和PH结构域(PH,558—655 aa),其中...     

绿盲蝽的发生及防治

介绍了绿盲蝽在棉花上的发生特点,总结了其防治措施,以期为绿盲蝽的防治提供参考。     

梨小食心虫卵黄原蛋白基因的鉴定及表达分析

为明确重要果树害虫梨小食心虫(Grapholita molesta)卵黄原蛋白(Vitellogenin,Vg)基因功能及其生殖调控机制,为GmVg基因功能的深入研究奠定理论基础,克隆鉴定了梨小食心虫卵黄原蛋白基因(GmVg)并进行生物信息学分析,通过qRT-PCR分析GmVg在梨小食心虫不同发育时期、不同性别和不同组织的表达模式。结果表明,GmVg基因全长5 573 bp,开放阅读框(ORF)5 364 bp,编码1 787个氨基酸,信号肽长度为15个氨基酸,分子式为C₉₀₄₁H₁₄₀₉₀N₂₅₄₄O₂₇₄₃S₅₇;氨基酸组成中丙氨酸(Ala)、谷氨酸(Gln)和丝氨酸(Ser)占比最大,分别为8.2%、7.9%和7.8%,酸性残基的数量(Asp+Glu)为187个,碱性残基的数量(Arg+Lys)为204个,预测蛋白质分子质量和等电点分别为204.1 ku和8.79,具有Vitellogenin-N、DUF1943和VWD共3个典型保守结构域。GmVg成虫期的表达量显著高于...     

棉田绿盲蝽的药效筛选及防治对策

通过研究棉田绿盲蝽发生规律,结合津南区气候特点等因素,选用6种药剂进行防效对比试验,从而筛选出防效较好的4种复配制剂,并提出了不同时期的防治对策。     

天津冬枣绿盲蝽的发生及综合防治

绿盲蝽是冬枣上的一种毁灭性害虫,近年来在天津冬枣产区发生严重,极大地威胁了冬枣生产。本文详细阐述了天津冬枣产区绿盲蝽的为害特点、生活史、发生原因及综合防治方法,以期帮助减缓其危害,为枣业生产提供保障。     

绿盲蝽雷帕霉素靶蛋白的克隆、抗体制备及在蜕皮激素诱导下的应答

[目的]克隆绿盲蝽( Apolygus lucorum )雷帕霉素靶标全长基因( AlTOR ),研究AlTOR时空表达特性及在外源蜕皮激素(20E)诱导下的应答响应,进一步获得原核表达的重组蛋白及制备多克隆抗体,分析该抗体的特异性,为后续研究AlTOR蛋白功能打下基础.[方法]RACE法克隆AlTOR基因序列全长,q...     

棉田绿盲蝽发生规律及防治技术

棉田绿盲蝽自2000年以来在宁河县及其周边地区呈逐年严重发生态势,本文就近年来绿盲蝽发生规律及防治技术进行了综述。     

棉田不同方式插种向日葵对绿盲蝽种群数量的影响

采用对比试验方法,系统调查了转基因抗虫棉田内不同种植管理方式插种向日葵对绿盲蝽种群数量的影响。结果表明：向日葵对绿盲蝽具有明显的诱集作用,向日葵施氮肥可以明显提高其对绿盲蝽的诱集能力;棉田插种向日葵能减少棉田绿盲蝽的发生危害;棉田插种向日葵、施氮肥并防治其上绿盲蝽能大大强化棉田仅插种向日葵减少棉田绿盲蝽发生危害的作用。     

绿盲蝽在枣树上的发生及防治

对绿盲蝽的危害特征、生活习性、发生规律及防治措施进行概述,以期对生产上有效防治绿盲蝽提供参考。     

牡丹泛素延伸蛋白基因片段克隆与表达分析

采用RT-PCR技术从牡丹(Paeonia suffruticosa)花瓣中克隆得到泛素延伸蛋白基因的cDNA片段,该片段长423bp,编码140个氨基酸残基,命名为PsUBQ,GenBank登录号为JN699053。PsUBQ编码的蛋白是在泛素单体后融合了1个核糖体S27a多肽,经多重序列比对发现该蛋白与拟南芥(Arabidopsis thaliana)、甜樱桃(Prunus avium)、葡萄(Vitis vinifera)等高等植物泛素延伸蛋白的氨基酸序列具有很高的一致性。实时荧光定量PCR分析表明:PsUBQ在牡丹不同组织间表达较稳定,且在切花开放各级别花瓣中呈组成型表达。PsUBQ的克隆与表达为进一步探讨牡丹开放衰老进程中泛素对激素信号的作用机制打下基础,同时为研究牡丹目标基因的表达提供校正标准。     

绿盲蝽TRPA1基因的鉴定及功能分析

【目的】克隆绿盲蝽（Apolygus lucorum）TRPA1基因,明确其在成虫不同组织中的表达分布,研究绿盲蝽TRPA1基因的功能,阐明绿盲蝽感受温度的分子基础。【方法】在绿盲蝽转录组测序的基础上,通过生物信息学方法分析转录组数据,得到编码绿盲蝽TRPA1基因的cDNA序列片段。根据已知的cDNA序列,设计引物。采用RT-PCR及RACE（rapid-amplification of cDNA ends）技术克隆TRPA1基因的全长序列,并通过DNAMAN软件及BLAST分析测序结果。测序正确后,使用在线工具SMART及TMpred预测TRPA1蛋白的锚蛋白重复序列（Ankyrin repeats）及跨膜结构域序列。通过序列比对,构建昆虫TRP（transient receptor potential）通道的家族进化树,分析绿盲蝽TRPA1与其他物种同源基因的相似性及进化地位。以GADPH为内参基因,利用RT-PCR检测绿盲蝽TRPA1在成虫触角、头、喙、足、腹等不同组织中的相对表达量。通过爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录技术研究绿盲蝽TRPA1对温度刺激的反应。【结果】通过绿盲蝽转录组数据预测得到TRPA1基因的4个cDNA序列片段,经过RT-PCR及RACE技术克隆得到了绿盲蝽TRPA1的全长序列,并命名为AlucTRPA1。AlucTRPA1开放阅读框全长3 672 bp,编码1 223个氨基酸。通过在线工具SMART及TMpred预测分析结果表明,AlucTRPA1含有16个锚蛋白重复序列结构及6个保守的跨膜结构域。序列比对及进化树分析结果显示,昆虫TRPA家族包含TRPA1、Painless、Pyrexia及Water witch,AlucTRPA1属于昆虫TRPA1亚家族。AlucTRPA1与其他昆虫的同源基因具有很高的相似性,特别是与同属半翅目的豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）的同源性高达65.1%。成虫组织表达谱分析结果表明,AlucTRPA1在成虫触角中的表达量最高,头、喙、足、腹中也都有表达。爪蟾卵母细胞体外表达结合双电极电压钳记录结果表明20℃至40℃逐渐上升的温度可以直接激活AlucTRPA1通道,且两次连续重复的温度刺激未引起AlucTRPA1通道的钝化。【结论】AlucTRPA1在绿盲蝽成虫的触角、头等组织中均有表达,且在爪蟾卵母细胞表达的AlucTRPA1能被20℃至40℃逐渐上升的温度刺激直接激活,推测AlucTRPA1在绿盲蝽体内是直接的温度感受器,参与调控绿盲蝽对生活环境温度的感知行为。     

绿盲蝽的发生及综合防治

对绿盲蝽在德州市棉花及果树上的发生、为害和综合防治策略进行了调查研究.结果表明,该虫在德州市一年发生5代,第1～2代为害果树,第2代成虫转主于棉花,在棉花上繁殖第3～4代,第5代成虫于10月初开始迁回果树产卵越冬,主要以卵在枣树多年生枣股芽鳞内和地面双子叶作物及杂草上越冬;防治上应抓住关键时期,采取大面积统一防治、将该虫消灭在孵化期和成虫羽化及转移为害之前的防治策略.     

绿盲蝽在苹果上暴发原因及防治策略

绿盲蝽象在我国苹果产区的发生和危害程度呈进一步严重趋势,本文分析了苹果绿盲蝽的生活习性和嫩叶、幼果的为害症状,以及与气候条件、环境的关系,并提出了当前我国苹果绿盲蝽的综合防治策略。     

枣园林下不同草本植物生境中粘虫板 对绿盲蝽的诱集效果

为探究枣园不同生草类型生境中粘虫板对绿盲蝽的诱集效果,于2018年6月下旬至10月上旬在3种不同生草类型的样地中使用4种颜色粘虫板诱集绿盲蝽。结果表明,荠菜+三叶草带粘虫板的全年诱集虫量显著低于荠菜+灰绿藜带,但显著高于空白对照带(F=64.01,P0.000 1),且蓝色粘虫板中的荠菜+灰绿藜带显著大于荠菜+三叶草带(F=35.60,P0.000 1);荠菜+三叶草带与对照带的诱集虫量6月、10月最多,7月、8月最少,而荠菜+灰绿藜带的诱集虫量8月份最多。枣园人工生草显著的加剧了绿盲蝽的聚集,以荠菜+灰绿藜为代表的杂草为绿盲蝽提供了良好的栖息环境。研究结果明确了生草的类型对绿盲蝽聚集的影响,为实际生产中枣园绿盲蝽的综合防治提供了科学依据。     

绿盲蝽在冬枣树上的发生规律及防治技术

绿盲蝽是天津市冬枣产区的主要害虫。本文作者经过几年观察和试验,从该害虫的危害症状、发生规律、发生严重的原因分析及防治技术几个方面进行了归纳总结,以期为枣农有效防治绿盲蝽象提供技术指导。     

棉田绿盲蝽的发生 危害及综合治理

本文对绿盲蝽在德州市棉花及果树上的发生、危害及综合治理策略进行了调查研究。结果表明,该虫在德州市一年发生5代,主要以卵在枣树多年生枣股芽鳞内和地面双子叶作物及杂草上越冬。第1代危害果树,第2代开始成虫转主于棉花,在棉花上繁殖第3代,第5代成虫于10月初开始迁回果树产卵越冬。防治上应抓住关键防治时期,采取大面积统一防治,将该虫消灭在孵化期和成虫羽化及转移危害之前的防治策略。     

不同类型杀虫剂对绿盲蝽室内毒力及田间药效评价

采用室内玻管药膜法和田间药效试验相结合的方法,评价了几种不同类型杀虫剂对绿盲蝽的应用前景。结果表明：锐劲特（氟虫腈）、马拉硫磷和丁硫克百威有望成为防治绿盲蝽的理想药剂。提出了科学使用现有药剂和开展绿盲蝽抗药性监测,已成为当前棉田绿盲蝽治理中势在必行的工作。     

枣树绿盲蝽象防治中存在的问题及对策

枣树是静海县的传统主栽树种,是农民经济收入的重要来源。近年来,绿盲蝽象在静海县发生严重,每年因此虫为害造成枣树减产20%以上,给农民带来很大经济损失。根据近年对西翟庄、唐官屯、大丰堆、静海镇、王口镇等乡镇枣园的调查,发现当前绿盲蝽象防治中存在一些问题,并提出了有效防治对策。