猪圆环病毒2型SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型(PCV2)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×10~1拷贝/μL,与猪圆环病毒1型(PCV1)、猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳病病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、乙型脑炎病毒(JEV)核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明:建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒3型荧光定量PCR检测方法的建立及其在猪体中的组织分布研究

为了解猪圆环病毒3型(PCV3)在猪体中的组织分布情况,针对PCV3 Cap蛋白基因设计筛选出一对特异性引物和探针,通过对荧光PCR引物、探针浓度进行优化,建立了基于TaqMan探针实时荧光定量PCR技术的PCV3检测方法,并应用该方法对人工感染PCV3猪的多种组织器官进行病毒含量检测。结果显示,建立的PCV3实时荧光定量PCR检测方法特异性较好且灵敏度高,可检测低至1 copy/μL的PCV3病毒核酸量,而对其他几种常见猪病毒病原的检测结果均为阴性。PCV3主要存在于肺脏、淋巴结,在扁桃体和脾脏中有少量存在。试验表明,所建立的荧光定量PCR检测方法可用于PCV3的快速定量检测,对PCV3在猪体中的组织分布情况的研究为进一步揭示PCV3的组织嗜性和致病机理提供理论依据。     

猪圆环病毒2型和3型检测方法建立及初步应用

为快速检测并鉴别猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)病毒。本文研究参考GenBank中PCV2和PCV3高度保守片段分别设计了探针引物,成功建立了一种双重TaqMan荧光定量检测方法。结果显示：该方法特异性好,可鉴别 PCV2、PCV3与其他猪病病毒;PCV2最低检测下限为1.00×10¹ copies/μL,PCV3最低检测下限为1.00×10⁰ copies/μL;重复性高,批内、批间的变异系数分别为0.01%～0.02%和0.02%～0.05%;本研究采用建立的方法与商品试剂盒同步检测猪只样品440份,PCV2样品符合率为97.47%,PCV3样品符合率为96.85%;测序结果显示,PCV2均为2d亚型,PCV3均为3c亚型。结果表明,建立的双重TaqMan荧光定量检测方法具有良好的特异性、敏感性且快速、准确,节约成本,可为PCV2和PCV3的监测与防控提供技术支撑。     

猪圆环病毒3型TaqMan荧光PCR检测方法的建立

为建立快速、简便检测猪圆环病毒3型(PCV3)的方法。本研究根据GenBank中已登录的PCV3 ORF1基因序列,设计了1对特异性引物和1条TaqMan探针,通过优化反应条件,建立了检测PCV3的TaqMan荧光PCR检测方法。结果显示,该方法特异性好,不与其他常见猪病病原体发生交叉反应,检测PCV3灵敏度可达12拷贝/μL,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法可对PCV3进行快速诊断,适合现场检测,为PCV3相关疾病的诊断和防控奠定了基础。     

针对猪瘟病毒E2蛋白的实时荧光定量PCR方法的建立及应用

根据猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)E2基因的保守序列,设计合成一套特异性引物和TaqMan探针,通过对反应体系和反应条件进行优化后,检测其特异性和灵敏性。结果显示,本研究建立的实时荧光定量PCR在101～108范围内线性相关系数为0.997,能够检测到相当于10 copies/μL的病毒核酸,比常规PCR检测方法敏感性强;采用建立的实时荧光定量PCR方法检验猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒和猪圆环病毒2型呈现阴性结果,特异性强;变异系数为0.09%～0.7%,小于1%,具有良好的重复性。本研究建立的猪瘟病毒实时荧光定量PCR方法为临床上猪瘟病毒的诊断和定量研究提供了重要的检测工具。     

猪流行性腹泻病毒和猪圆环病毒3型二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法的建立

为建立同时快速检测猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪圆环病毒3型(PCV3)的二重PCR方法,本研究根据GenBank中登录的PEDV M基因和PCV3 Rep基因高度同源保守序列设计并合成2对特异性引物,分别扩增PEDV M基因与PCV3 Rep基因,经过反应条件优化,建立了检测PEDV与PCV3的二重SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR方法。结果显示:该方法对PEDV和PCV3的检测结果为阳性,而对猪圆环病毒2型、猪传染性胃肠炎病毒和猪轮状病毒等8种常见的病原体均未检测到荧光信号;且具有良好的线性关系,R^2为0.99;应用本方法对PEDV和PCV3的最低检出量分别为37.6拷贝/μL和61.2拷贝/μL;组内和组间变异系数均小于2%。结果表明:本试验建立的PEDV和PCV3二重实时荧光定量PCR方法具有良好的特异性、敏感性、重复性,为快速、高效、定量检测PEDV和PCV3提供了技术帮助。     

猪圆环病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

本研究以猪圆环病毒2型(PCV2)核衣壳蛋白ORF2基因为目的基因,设计合成特异性引物和探针。PCR扩增得到目的基因,并克隆到pMD18-T载体,筛选得到标准阳性质粒。通过对荧光定量PCR反应条件的优化,建立了PCV2的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。试验结果表明,该方法特异性强,对猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)等猪常见病原的检测结果均为阴性;与普通PCR方法相比,其敏感性高出100倍,可达100拷贝/μL;对临床样品的检测证明,该方法可有效检测出淋巴结、肺脏等组织中的PCV2。     

猪圆环病毒3型实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异、灵敏的猪圆环病毒3型(PCV3)实时荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3全基因组序列高度保守区域设计了一对特异性引物和探针,通过对反应体系和扩增条件进行优化,建立了能够特异性检测PCV3的荧光定量PCR方法。该方法对7.87×10~3～7.87×10~9拷贝/μL的PCV3标准质粒呈现良好的线性关系,最低检出浓度为7.87×10~1拷贝/μL,比常规PCR的灵敏度高100倍。与猪伪狂犬病毒、猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪乙型脑炎病毒、猪传染性胃肠炎病毒和猪流行性腹泻病毒均无交叉反应,具有良好的特异性。不同浓度质粒标准品的组内和组间重复性试验结果均显示变异系数(CV)小于1%,重复性较好。对2018～2020年从四川省不同地区收集的329份正常猪血清及187份疑似PCV阳性临床样品进行检测,得出PCV3阳性率分别为31.3%和38.5%,流行率较高。上述结果表明,本研究建立的荧光定量PCR方法能够快速灵敏地检测PCV3,为PCV3的临床检测及流行病学调查奠定了基础。     

非洲猪瘟病毒K196R基因实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种准确、特异、高效、快速的非洲猪瘟病毒定量检测方法,本研究根据非洲猪瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)早期表达基因K196R的基因序列,设计了TaqMan荧光定量PCR引物及探针,通过优化退火温度、引物及探针浓度,建立了快速检测ASFV的TaqMan荧光定量PCR检测方法。结果表明,该方法选择的引物具有高度灵敏性和特异性,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法的标准曲线具有良好的线性关系(R~2=0.998),对ASFV核酸最低检测下限为1.3拷贝,且与猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型等多种病原不存在交叉反应。本研究建立的K196R基因实时荧光定量PCR检测方法为非洲猪瘟疫情提供了一种新型、灵敏和特异的早期检测方法。     

猪圆环病毒3型TaqMan荧光定量PCR方法的建立和初步应用

为了灵敏而便捷的检测猪圆环病毒3型(PCV3),根据PCV3ORF2基因组保守序列设计合成4对引物,先使用荧光染料(SYBR)定量PCR法验证其能否有效扩增目的片段,并根据结果和引物对所扩增序列的交集进一步设计TaqMan探针,通过优化反应条件和反应体系建立快速检测PCV3的实时荧光定量PCR检测方法。结果显示,SYBR染料法和TaqMan探针法均能有效地扩增PCV3标准质粒以及其他阳性样品,并且对1.29×10~2~1.29×10~9拷贝·μL~(-1)的PCV3标准质粒(Pmd18-t-Cap)呈现良好的线性关系,该方法的检测灵敏度为1.29×10~2拷贝·μL~(-1),比常规PCR的灵敏度高100倍,该方法与猪圆环病毒2型、猪轮状病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒等病毒基因以及猪链球菌、猪肺炎支原体等细菌基因均无交叉反应,具有良好的特异性;批次内重复和批次间重复试验结果显示变异系数(CV)均小于1.5%,呈良好的可重复性。用该方法对2016年至2017年间收集的124份来自湖北省等地的猪病料DNA样品进行检测,结果显示本地区PCV3阳性率为8.06%(10/124),PCV2和PCV3共感染率为8.06%(10/124)。上述结果表明,本研究建立TaqMan荧光定量PCR能够灵敏特异的检测圆环病毒3型,为圆环病毒3型的临床检测提供有效手段。     

非洲猪瘟病毒TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

建立一种TaqMan荧光定量PCR检测方法,用于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)保守结构蛋白P72基因的检测。参照GenBank登录的ASFV P72相关基因序列,设计合成1对特异性引物与1个TaqMan探针,通过对反应条件和反应体系进行优化,建立了快速检测ASFV的TaqMan实时荧光定量PCR方法,对该方法的灵敏性、特异性与重复性进行了验证。结果显示,该方法能有效扩增1.0×10~0～1.0×10~9拷贝/μL ASFV-P72标准质粒,建立的标准曲线呈现良好的线性关系;检测灵敏度为1.0×10~0拷贝;对猪流行性腹泻病毒、猪δ冠状病毒、高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病毒等病原不发生交叉反应;重复性试验结果显示变异系数(CV)小于1%。结果表明,本试验建立的TaqMan荧光定量PCR检测方法具有良好的灵敏性、特异性和重复性,可用于临床样本中ASFV的检测,从而更好地对ASF疫情进行监测和诊断。     

猪圆环病毒2型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法克隆了猪圆环病毒2型 (porcine circovirus 2,PCV2) 衣壳蛋白（capsid protein,CAP）基因,构建了重组质粒p-18T-CAP,并将其作为标准阳性模板。参照GenBank收录的PCV2 ORF2基因设计合成1对特异性的引物和与该引物相匹配的特异探针,通过对反应条件进行优化,以定量的10倍系列稀释的质粒p-18T-CAP为标准品进行TaqMan荧光定量PCR扩增,建立了一种检测PCV2的TaqMan荧光定量PCR方法。试验结果显示,该方法与猪圆环病毒 1 型、猪流感病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒等均无交叉反应;该方法最低可检测到4.53×10²拷贝/μL,比PCR检测方法高100倍;其标准曲线线性范围是10²～10⁹拷贝/μL,且具有良好的重复性。     

鉴别猪圆环病毒2型和3型双重TaqMan MGB探针FQ-PCR检测方法研究

建立一种快速、特异鉴别检测猪圆环病毒2型(PCV2)和猪圆环病毒3型(PCV3)的双重TaqMan MGB探针FQ-PCR方法,本研究以PCV2的Rep蛋白和PCV3的Cap蛋白基因作为靶基因,各设计1对特异性引物和1条TaqMan MGB探针,经优化各反应条件和进行敏感性、特异性、重复性和干扰性试验,建立鉴别检测PCV2/PCV3的双重FQ-PCR方法。结果显示：该方法可特异性扩增PCV2、PCV3核酸,与猪伪狂犬病病毒(PRV)等8种病原及阴性对照无交叉反应,特异性较强;对PCV2和PCV3阳性质粒标准品的最低检出限均可达10 copies/μL,敏感性较高;PCV2/PCV3批内/批间重复试验变异系数(CV)值均在3%以下,表明方法稳定性、重复性较好;干扰性试验表明在两种病毒阳性质粒起始模板相差较大时该方法不会影响对其中任一病毒核酸的检出和准确定量。对42份临床疑似PCV感染样品检测结果与PCV2 、PCV3基因测序结果符合率100%。本研究建立的双重FQ-PCR方法具有敏感性高达10 copies/μL、特异性强、在同一反应体系中能同时快速鉴别检测PCV2、PCV3等优点,可用...     

猪圆环病毒3型TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立猪圆环病毒3型(PCV3)荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中PCV3基因序列设计特异性引物和探针,经过反应体系和条件优化,建立了特异性检测PCV3的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法。该检测方法在4.78×10~1拷贝/μL～4.78×10~9拷贝/μL质粒标准品范围内均有良好的线性关系;该方法特异性试验结果显示,其与多种常见猪病病毒均无交叉反应,特异性良好;本研究建立的方法敏感性是常规PCR方法的100倍,敏感性较高;批内批间重复性试验变异系数均小于2.3%,重复性良好。对临床样品的检测结果显示,该方法对PCV3的检出率高于常规PCR方法,并且PCV3阳性样品多存在混合感染情况。该方法的建立为PCV3的实验室诊断及流行病学调查提供了快速、准确的检测手段。     

PCV4 SYBR Green I实时荧光定量PCR方法的建立及应用

为建立一种灵敏、可快速检测猪圆环病毒4型（PCV4）的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法,根据PCV4 Rep基因的保守区域设计引物,建立针对PCV4的SYBR Green I实时荧光定量PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏性和重复性进行评价。结果显示,该检测方法的Ct值与标准品在5.64×102~5.64×109 copies/μL范围内呈良好的线性关系,R2为0.999,斜率为-3.638,检测下限为5.64×102 copies/μL,且无非特异性扩增。利用该方法对56份临床样品进行检测,发现PCV4核酸阳性率为3.57%,比普通PCR更灵敏可靠。结果表明,本试验建立的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法可用于PCV4的快速诊断。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型（duck adenovirus A,DAdV-A）TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原（如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌）检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%（6/85）,PCR方法的阳性率为5.88%（5/85）,且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

鸭腺病毒A型TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立

试验旨在建立鸭腺病毒A型(duck adenovirus A,DAdV-A)TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。根据DAdV-A Hexon基因序列设计特异性引物和探针,建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性进行检测,用建立的TaqMan实时荧光定量PCR检测方法和常规PCR方法同时对福建地区临床收集的85份番鸭源病料进行DAdV-A感染的检测,比较其符合率。结果表明,试验成功建立了检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,其扩增相关系数为0.996,扩增效率为99.9%;特异性强,对鸭常见病原(如鸭瘟病毒、鹅细小病毒、番鸭细小病毒、鸭圆环病毒、鸭源大肠杆菌、鸭疫里默氏杆菌和鸭源禽多杀性巴氏杆菌)检测均为阴性;灵敏度高,最低检测限为8.37拷贝/μL;重复性好,组内变异系数和组间变异系数分别为0.54%~1.28%和0.61%~2.39%。对临床送检的85份病料,TaqMan实时荧光定量PCR方法的阳性率为7.06%(6/85),PCR方法的阳性率为5.88%(5/85),且PCR检测的阳性样品经TaqMan实时荧光定量PCR方法检测均为阳性,符合率为100%。本研究建立了基于TaqMan探针检测DAdV-A的实时荧光定量PCR检测方法,为鸭群中开展DAdV-A的分子流行病学研究提供了有效技术手段。     

猪PRRSV和PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立及应用

为快速及定量的检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV2),本研究根据GenBank中登录的PRRSV和PCV2基因组确定了其基因保守序列,分别设计其特异性探针和引物,建立了PRRSV-PCV2双重TaqMan荧光定量PCR检测方法。特异性试验显示该方法对猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪伪狂犬病毒及猪瘟病毒的检测结果均为阴性。对PRRSV和PCV2的检测灵敏度均达10拷贝/μl。重复性试验结果显示批内、批间变异系数均小于4%。应用该方法对60份已知临床病料进行检测,结果检出PRRSV和PCV2阳性感染率分别为30.67%和35%,混合感染率为11.67%,与已知结果的符合率为100%。该方法具有敏感、快速、特异、定量、重复性、稳定性好等优点,在用于PRRSV和PCV2感染的快速鉴别诊断的同时,在细胞培养特性以及疫苗生产检测中也具有广阔的应用前景。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒抗原含量实时荧光定量PCR检测方法的建立

依据GenBank公布的猪圆环病毒2型Cap基因序列,在保守区域设计特异性引物和TaqMan探针,优化反应体系,建立评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,对方法的特异性、敏感性和重复性进行试验,并验证灭活剂用量和灭活时间对检测结果的影响。结果显示：该方法只对猪圆环病毒2型基因有特异性扩增,其他3种对照病毒基因的扩增结果均为阴性;检测灵敏度达到10^2.0 TCID₅₀/mL,比普通PCR方法高100倍;方法的重复性好,对同一样品进行10次检测,变异系数为2.28%;不同灭活剂用量和灭活时间对结果的影响较小,不会因各厂家使用的灭活剂用量和灭活时间不同,影响疫苗对比实验的公平性。该研究成功建立了一种评价猪圆环病毒2型灭活疫苗中病毒含量的实时荧光定量PCR检测方法,用于猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中病毒抗原含量的定量,其结果可以反映不同猪圆环病毒2型灭活疫苗样品中抗原含量差异,为研究猪圆环病毒2型灭活疫苗病毒抗原含量评估方法提供了新的思路。