H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致,κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H5、H7、H9亚型(lumpy skin disease virus,LSDV),本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析,设计、合成特异性引物和探针,结合Taq man-MGB探针技术,建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型...     

应用三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸

为了验证三重荧光RT-PCR方法检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸的可行性,应用建立的方法分别检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒抗原,验证该方法的特异性、敏感性和重复性,并用建立的方法检测临床样品。结果为,三重荧光RT-PCR方法能分别特异检出H5、H7和H9亚型禽流感病毒抗原。最低的检出限为H5亚型禽流感抗原(Re-11株)10-7的稀释度,变异系数(CV)为1.25%。检测100份鸡喉拭子,H5、H7亚型禽流感病毒核酸均为阴性,H9亚型禽流感病毒核酸13份阳性,阳性率为13.00%。结果表明,建立的三重荧光RT-PCR方法通过一个反应体系可以检测H5、H7、H9亚型禽流感病毒核酸、具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

禽流感病毒H5和H9亚型多重RT-PCR快速检测方法的建立

根据禽流感病毒（AIV）核蛋白（NP）和血凝素（HA）基因序列，设计1对用来鉴定A型AIV特异性引物（NP—F,NP—R）和2对用来鉴定AIV H5和H9不同亚型特异性引物（H5-F，H5-R；H9-F，H9-R），建立了多重RT—PCR快速检测方法。该方法能同时从一种病毒扩增出2条核酸带。分别为型（NP：330bp）和亚型（H5A：550bp，或H9A：490bp）。通过对105份样品进行检测。并与病毒分离及琼脂扩散（AGP）血清学方法作平行对比，两者之间符合率达100％；试验灵敏度为10^2ELD50。结果表明，建立的多重RT—PCR为检测H5、H9亚型AIV提供了一种快速、经济、易行的技术。     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

H9亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

为建立一种快速准确检测H9亚型禽流感病毒基因的检测方法,根据GenBank中H9亚型禽流感病毒血凝素编码基因进行荧光检测引物和探针设计,建立了一种针对H9亚型禽流感病毒的荧光RT-PCR检测方法。利用该方法进行灵敏度和特异性检测,并用本方法和国家标准中的荧光RT-PCR检测方法,同时对临床样本进行检测。结果显示,仅H9亚型禽流感病毒出现了正常荧光检测曲线,而其他病毒及阴性对照均未出现;检测灵敏度为RNA终浓度10~(-4) ng/μL(1.30×10~4 copies/μL);临床样本检测结果与国标方法一致,符合率为100%。结果表明,该方法特异性强、灵敏度高,可用于H9亚型禽流感病毒检测。     

H9和H6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

试验旨在建立可同时鉴别检测H9和H6亚型禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）的二重RT-PCR方法。根据GenBank中H9和H6亚型AIV的HA基因保守序列,分别设计2对特异性引物,优化引物浓度与退火温度等条件,建立了可同时鉴别检测H9和H6亚型AIV的二重RT-PCR检测方法。用该法对H9和H6亚型AIV混合感染样品、H9亚型AIV单一感染样品和H6亚型AIV单一感染样品进行扩增,结果均得到对应的目的条带,而对其余亚型AIV及其他禽病病原体均未扩增出特异性条带。该法对H9和H6亚型AIV的检测下限均为5×10⁴拷贝/μL。本研究建立的二重RT-PCR检测方法特异性强、敏感性高、稳定性和重复性良好,可同时鉴别检测H9与H6两种亚型AIV,为H9与H6亚型AIV的监测提供技术支撑。     

H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

H7亚型禽流感病毒致病性强、危害性大,是进出口家禽及禽类产品的主要检疫对象。为了加强对H7亚型禽流感病毒的检测,建立新的快速检测方法。通过对GenBank已报道的H7亚型禽流感病毒的HA基因进行序列分析比较,设计了两套分别针对H7N2亚型和H7Nx亚型的特异性引物和用FAM标记的Taq Man MGB核酸探针,建立了H7亚型禽流感病毒实时荧光定量RT-PCR方法(Real-time RT-PCR)。该方法特异性好,不存在假阴性和假阳性的现象;敏感性高,对禽流感病毒H7亚型标准HI抗原检测的敏感性达到10-5,能够满足口岸禽流感病毒快速、准确、有效的检疫需求。     

H9亚型禽流感病毒TaqMan MGB荧光RT-PCR检测方法的建立

根据Gen Bank中发表的H9亚型禽流感病毒(AIV)HA基因保守序列设计合成一对特异性引物和一条Taq Man探针,建立了一种检测H9亚型AIV的荧光RT-PCR方法,利用该方法和商品化试剂盒对临床样本同时进行检测。结果显示,该方法可特异性检测H9亚型AIV,与H3和H5亚型AIV、新城疫病毒、鸭病毒性肠炎病毒、鸡传染性支气管炎病毒、传染性法氏囊病毒、减蛋综合征病毒等主要禽病病毒无交叉反应;该方法检测范围为10-1~10-5个拷贝数,相关系数R2=0.997。对3个不同浓度的RNA进行组间和组内重复性试验,每个浓度的Ct值变异系数均小于2.0%,具有良好的重复性。用本方法和商品化试剂盒对采集的349份野鸟粪便进行检测,两者具有高度的一致性(K=0.85),本研究建立的方法检测临床样本结果更接近真实值。本研究提供了一种快速、准确、敏感和特异的H9亚型AIV检测方法,可为临床诊断和流行病学调查提供可靠的检测依据。宁夏是中亚野鸟迁徙的主要旅居点,应加强野鸟和家禽群体的疫病监测,做到早发现、早诊断、早处置。     

应用荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒

为了解青岛市饲养的家禽是否感染H5亚型禽流感病毒,以制定切合实际的防控措施,2005年1月～2006年9月,对139个养禽场和211个养禽户饲养的家禽采集棉拭子和组织样品,共采集活禽样品27 835份,病死禽样品573份,应用荧光定量RT-PCR技术,进行H5亚型禽流感病毒检测,结果全部为阴性,在分子水平上证明了青岛市无禽流感病毒感染.     

H5亚型禽流感病毒实时荧光RT-PCR方法的建立与应用

H5亚型禽流感病毒HA序列差异越来越大。为更准确地检测H5亚型禽流感病毒,对GenBank中发表的H5亚型禽流感病毒HA序列以及本实验室保存病毒序列进行比对,同时设计1对引物和1条探针,建立了H5亚型禽流感病毒实时RT-PCR方法,并对该方法的反应体系和反应参数进行了优化。以本实验室分离测序确定的30份H5亚型禽流感病毒RNA为模板,将该方法与两种商品化H5亚型禽流感病毒检测试剂盒进行比对,发现该方法与两种商品化试剂盒的检出率分别为100%、98%、98%。敏感性试验显示,该方法可以检测出0.1 fg的RNA模板,灵敏度比两种商品化试剂盒均提高了10倍。结果表明,该方法具有更高的特异性和敏感性,可用于H5亚型高致病性禽流感的早期诊断。     

应用荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒

为了验证荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感病毒的可行性,应用建立的荧光RT-PCR方法检测H7N9亚型禽流感抗原、H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原评估检测方法的特异性,检测不同稀释度的H7N9亚型禽流感抗原,并用建立的方法检测采自三鸟批发市场100份泄殖腔、喉拭子。结果是建立的荧光RT-PCR方法,H7体系能检测出1:10-10抗原稀释度,N9体系能检测1:10-9抗原稀释度,对H9亚型禽流感抗原、H5亚型禽流感抗原、新城疫抗原无交叉反应;检出100份泄殖腔、喉拭子结果均为阴性。结果表明,荧光RT-PCR方法H7N9亚型禽流感病毒具有快速、灵敏、特异的特点,适合对禽类的大规模监测。     

荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒方法的建立与验证

根据H5亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以H5亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.995,灵敏度约为8拷贝/μL,相当于8个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为H5亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、低成本、高通量、生物安全性好的定量检测方法。对178份临床泄殖腔棉拭子样品的检测,该方法结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%,在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示了良好的应用前景。     

H5亚型和N6亚型禽流感病毒二重RT-PCR检测方法的建立

为了建立一种快速、简便的H5亚型、N6亚型禽流感病毒(AIV)的检测方法,根据GenBank中H5亚型、N6亚型AIV的HA和NA基因保守序列,分别设计了2对特异性引物,通过优化条件,建立了H5亚型和N6亚型AIV二重RT-PCR检测方法。特异性试验结果显示,该方法对H5N6亚型AIV特异性扩增出418bp和251bp目的片段,对H5Ny(y≠6)亚型AIV扩增出418bp目的片段,对HxN6(x≠5)亚型AIV扩增出251bp目的片段,对其他亚型和常见的禽病病原体均未扩增出目的片段;敏感性结果显示,该方法对H5亚型和N6亚型最低检测限为1.59×10-5ng/μL。本研究建立的H5亚型和N6亚型AIV检测方法,具有特异性强,灵敏度高的特点,为H5亚型和N6亚型AIV临床检测以及防控提供了有效方法。     

H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法的建立

根据GenBank中H9亚型禽流感病毒HA基因和禽肺病毒F基因的保守序列,通过Blast进行比对,在各自保守的基因序列中分别设计了两对特异性扩增引物,引物扩增的片段大小分别为569bp和424bp,应用这两对引物建立了H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒的二重RT-PCR检测方法,对建立的方法进行了特异性试验、敏感性试验和临床样品验证。对检测为阳性的样品进行克隆和序列分析,以验证本方法的准确性。特异性试验结果表明,所有参试的H9亚型禽流感病毒都能扩增出大小为569bp的片段,参试的禽肺病毒毒株扩增出424bp的片段,没有其他条带出现,而对照的参试毒株在569bp和424bp处没有任何条带;敏感性试验结果表明,本试验建立的方法能检测到10pg的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒RNA模板。应用本试验建立的方法对广西采集的病鸡样品132份进行检测,H9亚型禽流感病毒阳性的样品有6份,禽肺病毒阳性的样品2份;随机各挑取2份H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒阳性PCR产物进行克隆和序列分析,经比对分析,2份H9亚型禽流感病毒阳性PCR产物与H9亚型禽流感病毒(No.JF715045.1)100%同源,2份禽肺病毒阳性PCR产物与禽肺病毒株(No.AF187154)100%同源。本试验建立的H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒二重RT-PCR检测方法具有特异、敏感、快速的特点,可以用于临床快速准确检测H9亚型禽流感病毒和禽肺病毒。     

北美H7亚型禽流感病毒RT-PCR检测方法的建立

本研究通过分析NCBI数据库中H7亚型禽流感病毒HA基因序列,根据该基因设计引物,建立了针对北美H7亚型禽流感病毒HA基因的一步法RT-PCR检测方法,并对反应条件进行了优化。该方法可特异地检出北美H7亚型禽流感病毒HA基因,而未检出欧亚分支H7亚型禽流感病毒H7N2和H7N9、其他亚型流感病毒(H1N1、H3N2、H5N1、H5N8和H9N2),以及新城疫病毒和鸡传染性支气管炎病毒;检测方法的灵敏度可达0.1 pg/μL。该检测方法的建立为监测北美H7亚型禽流感病毒提供了良好的技术支撑,可用于外来禽流感病毒的检测。     

鉴别禽流感病毒H5、H7、H9亚型及N1-N9亚型RT-PCR方法的建立

快速检测和鉴定禽流感病毒(AIV)亚型对该病的防控具有重要意义。参考文献报道设计合成引物,采用二步RT-PCR方法,从H5/H7亚型AIV血凝抑制抗原和H9鸡胚尿囊液中提取病毒RNA,建立禽流感病毒通用、H5/H7/H9亚型和N1-N9亚型鉴定方法。结果表明:针对AIV基质蛋白基因(M)和核蛋白基因(NP)的通用检测方法能有效扩增出目的条带;鉴别H5/H7/H9亚型的复合PCR扩增结果与预期目标一致;鉴别N1-N9亚型PCR方法扩增出N1/N2/N6/N9亚型目的条带;与其他4种常见病原无交叉反应。初步应用该方法检测样品,证明该方法对禽流感快速诊断和亚型鉴定具有潜在的应用价值。     

H5、H9亚型禽流感病毒和新城疫病毒的多重RT-PCR检测

根据Genbank注册发表的H5、H9亚型禽流感病毒(AIV)的HA基因和新城疫病毒(NDV)的HA基因序列,设计多对引物,每种病毒各筛选出一对特异性好、灵敏度高的引物,其中FP1/FP2扩增H5亚型AIVHA基因片断长为545bp;P3/P4扩增H9亚型AIVHA基因片断长为321bp;P11/P22扩增NDVHA基因片断长为672bp。用RT-PCR方法,通过特异性试验、灵敏度试验,H5、H9亚型AIV和NDV引物的灵敏度分别达到了1:104、1:108、1:104稀释度,与传染性支气管炎(IB)、传染性法氏囊病(IBD)、传染性喉气管炎(ILTV)、传染性鼻炎(IC)、霉形体(MS)、H1N1猪流感等抗原无交叉反应。实验结果表明,本研究建立了检测H5、H9亚型AIV和NDV的多重RT-PCR方法,混合引物的最佳退火温度为50℃,鉴定检测仅需4小时。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。