牛病毒性腹泻病毒感染对猪瘟免疫的影响

猪瘟病毒（CSFV）与同属的牛病毒性腹泻病病毒（BVDV）同源性较高,抗原性上有交叉。本次调查对368份猪瘟免疫猪血清样本进行BVDV抗原检测,其中7份呈阳性,阳性率1.90%。对7份BVDV阳性血清采用ELISA和IHA两种方法检测猪瘟（CSFV）抗体水平,抗体合格率偏低,两者的结果符合率为71%。研究表明：BVDV在一定程度上干扰了猪瘟疫苗的免疫效果,影响抗体水平。     

猪瘟病毒中和性单克隆抗体制备及阻断ELISA方法建立

采用毕赤酵母表达的猪瘟病毒(CSFV)重组E2蛋白免疫BALB/c小鼠，经间接免疫荧光(IFA)筛选，获得了17株特异性单抗。经病毒中和试验(VNT)验证，上述单抗均具有CSFV中和活性，其中单克隆抗体3H9的病毒中和效价最高，大于1∶10 240。采用HRP标记的CSFV单抗3H9为阻断抗体，配合酵母表达的CSFV E2蛋白作为包被抗原，建立了一种用于检测猪血清中CSFV中和抗体的阻断ELISA方法。该方法优化后的抗原包被浓度为0.5μg/mL,阻断抗体稀释度为1∶8 000。通过对100份阴性猪血清的检测，确定该方法的阻断率cut-off值为30%。该方法敏感性高，对中和抗体效价低至1∶16的血清检测仍呈阳性；特异性强，仅与CSFV抗体阳性猪血清呈阳性反应，与其他猪病病毒及牛病毒性腹泻病毒(BVDV)抗体阳性猪血清均呈阴性反应；良好的可重复性，批内、批间变异系数分别为0.90%～3.21%、1.89%～6.57%,均小于10%。对188份现有猪血清检测结果显示，该方法与病毒中和试验和IDEXX猪瘟病毒抗体检测试剂盒的符合率分别为96.3%、94.7%。用该方法对南京市浦口区某养殖场...     

猪瘟病毒石门株NS3蛋白的原核表达及其抗体检测间接ELISA的建立

为配合猪瘟新型疫苗的研发,建立了猪瘟病毒NS3蛋白抗体检测间接ELISA,以期达到有效区分新型疫苗免疫猪与自然感染猪(包括常规疫苗接种猪)的目的。以接种猪瘟病毒(CSFV)石门株的PK-15细胞为模板提取总RNA,经特异性PCR扩增获得长度为2 049bp的CSFV NS3基因,将其克隆至插入了具有自聚集自切割功能短肽的原核表达载体pET-32a(+),在大肠埃希菌Rosetta(DE3)中优化表达CSFV石门株NS3基因。Western blot分析表明重组蛋白NS3具有反应原性。将纯化的重组蛋白NS3作为包被抗原建立检测CSFV NS3抗体的间接ELISA,以美国爱德士(Idexx)猪瘟病毒抗体检测试剂盒抗体检测结果为标准,对502份血清样品进行检测。结果表明,所建立方法的特异性为96.9%,敏感性为89.7%,总符合率为95.8%,为猪瘟新型疫苗的推广应用提供了血清学检测方法。     

可溶性E2蛋白作为抗原的检测猪瘟病毒血清抗体间接ELISA方法的建立

以可溶性重组E2蛋白作为抗原,建立了猪瘟病毒(CSFV)血清抗体间接ELISA诊断方法(rE2-ELISA).将猪瘟疫苗毒株E2基因主要抗原区(A-D)基因克隆到表达栽体pGEX-6p-1上,转化E.coli,降低诱导温度至20℃,获得48 000大小E2融合蛋白,部分目的蛋白以可溶性形式表达.Western blotting试验证实,E2融合蛋白可以和CSFV阳性血清发生特异性结合.亲和层析纯化后的E2融合蛋白作为抗原,建立了检测CSFV血清抗体的间接rE2-ELISA方法.该方法的特异性试验结果表明,与PRRSV、PCV2、PPV和PRV阳性血清之间不存在交叉反应;用rE2-ELISA和国外同类试剂盒(CSF-Ab-Kit)检测142份田问血清样品,2种试剂盒的阳性检测率分别为83.81%和88.73%.因此,rE2-ELISA猪瘟抗体检测试剂盒具有良好的敏感性和特异性,适合应用在大规模的CSFV血清抗体的检测工作中.     

猪瘟野毒感染抗体阻断ELISA检测方法的建立与初步评价

以猪瘟野毒E2蛋白为包被抗原、辣根过氧化物酶标记的猪瘟野毒单抗作为酶标抗体,建立检测猪瘟野毒抗体的阻断ELISA方法。猪瘟野毒E2最适包被浓度为0.03μg/mL,待检血清最适稀释度为1∶4,酶标猪瘟野毒单抗稀释度为1∶1 000。用建立的阻断ELISA方法检测369份临床阴性血清,计算阻断率,确定临界值,阻断率>40%为猪瘟野毒抗体阳性,阻断率≤40%为猪瘟野毒抗体阴性。用建立的ELISA方法检测84份血清,其中78份为免疫猪瘟疫苗的血清,6份为猪瘟病毒感染血清。结果显示,78份免疫血清均检测为猪瘟野毒抗体阴性,6份猪瘟感染血清均检测为猪瘟野毒抗体阳性。因此可初步判定该方法可用于鉴别诊断猪瘟病毒自然感染动物和C株疫苗免疫动物的血清抗体,并为临床检测猪瘟野毒抗体提供便捷、快速,精准的检测工具,对猪瘟的临床诊断、预防以及猪瘟净化工作具有非常重要的参考意义。     

单克隆抗体捕捉猪瘟病毒抗原ELISA方法的建立

分别用原核表达的猪瘟病毒（CSFV）主要抗原E2蛋白和猪瘟基因疫苗免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合与克隆筛选出5株稳定分泌CSFV抗体的杂交瘤细胞株1E2、1G7、3A2、3B7和4B6.间接免疫荧光和Western-blotting试验结果表明,5株单抗均与CSFV E2蛋白和全病毒抗原反应.将筛选的CSFV特异性单抗1E2、3B7和4B6纯化后等量混合后包被酶标板（捕捉抗体）,与兔抗CSFV IgG（检测抗体）联合应用,建立起CSFV抗原捕捉ELISA（AC-ELISA）方法.随后采用方阵滴定法确定了单抗与多抗的最适工作浓度及判定检测结果的OD450临界值.最后以建立的AC-ELISA检测CSFV细胞培养物、CSFV攻毒死亡猪的病料和临床猪瘟组织样品,结果表明,该方法敏感、特异、重复性好,与病毒分离和RT-PCR方法符合率分别为86.2%和90.3%.     

CHO细胞表达牛病毒性腹泻病毒E2蛋白及免疫原性分析

旨在利用悬浮培养CHO细胞表达系统制备牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV) E2蛋白,并鉴定纯化E2蛋白的免疫原性。本研究以BVDV-1 NADL株基因序列为基础,构建BVDV E2蛋白的重组真核表达质粒pcDNA3.1-BVDV-E2,转染经悬浮培养的CHO细胞进行分泌表达,收集细胞培养上清,进行亲和层析法纯化,SDS-PAGE电泳鉴定蛋白表达和纯化,Western blot鉴定与His抗体和BVDV阳性血清反应性,利用纯化蛋白免疫新西兰大白兔,用细胞间接免疫荧光(IFA)和ELISA鉴定E2蛋白的反应活性。纯化E2蛋白经BCA蛋白定量试剂盒检测后表达量高达1.228 mg·mL^-1;Western blot结果显示,利用His抗体和BVDV阳性血清均可检测到目的蛋白的特异性条带;新西兰大白兔一免后第7天利用间接ELISA可检测到血清抗体阳性,并持续至免疫后第28天,血清抗体效价水平达到1∶1 024 000;IFA试验结果显示,该血清抗体可检测到BVDV感染MDBK细胞中E2蛋白的表达,进一步证实纯化的E2蛋白具有良好的免疫原性和特异性。本研究成功利用CHO悬浮培养真核表达系统制备了纯化的BVDV E2蛋白,该蛋白具有良好的免疫原性,为BVDV的诊断方法及其新型亚单位疫苗研制奠定了基础。     

猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达及Dot-ELISA建立研究

为建立基于猪瘟病毒E2基因主要抗原区表达产物的猪瘟抗体斑点杂交ELISA方法,应用RT-PCR方法扩增了猪瘟病毒E2基因的主要抗原区(dE2),经EcoR I、Xho I双酶切,与经同样双酶切的原核表达载体pET-28a (+)连接,加入适量IPTG诱导表达,SDS-PAGE和Western blotting分析结果表明,成功表达的重组蛋白分子量约32.4 KDa,能与CSFV阳性血清特异性结合,为CSFV抗体检测提供了有效工具。     

检测猪瘟病毒E0抗体ELISA方法的建立与应用

E0蛋白是猪瘟病毒(CSFV)重要的结构蛋白之一,能刺激机体产生中和性保护抗体,同时也是作为鉴别诊断的标识之一.本研究通过RT-PCR扩增得到石门株E0基因,构建了重组质粒pET-28a-E0,原核表达E0目的蛋白后鉴定了其免疫反应性.将纯化后的目的蛋白进行梯度稀释,建立了 ELISA检测方法,优化反应条件如下:最佳蛋...     

猪瘟病毒E0+E2基因的串联表达及多克隆抗体制备

串联表达猪瘟病毒(classical swine fever virus, CSFV)E0和E2蛋白，并制备多克隆抗体鉴定其免疫原性，为进一步研究亚单位疫苗和猪瘟ELISA抗体检测方法提供材料。应用PCR技术分别扩增CSFV E0和E2基因片段，运用重叠PCR将其串联扩增后克隆至pET-28a载体，构建重组表达质粒pET-28a-E0+E2。通过大肠杆菌表达系统表达重组蛋白E0+E2,切胶纯化后免疫昆明小鼠制备血清，通过间接ELISA方法测定抗体水平，间接免疫荧光(IFA)分析多克隆抗体的免疫原性和特异性。结果显示，37℃,1 mmol/L IPTG诱导条件下，E0+E2蛋白能够以包涵体形式表达，经纯化复性后免疫小鼠，制备的血清能与感染CSFV的细胞特异性反应。在大肠杆菌中高效表达了E0+E2蛋白，制备的多克隆抗体具有较高的特异性和反应性。     

BVDV-1 E2蛋白抗原表位的串联表达及其多克隆抗体的制备

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）与猪瘟病毒（CSFV）的E2蛋白具有部分同源性，可导致血清学交叉反应。为准确检测BVDV，排除CSFV的干扰，以柔性氨基酸（GSGS）将BVDV-1 NADL株E2蛋白的5个特异性抗原表位（E1～5）串联（E1-E1-GSGS-E2-E2-GSGS-E3-E3-GSGS-E4-E4-GSGS-E5-E5，命名为5BE），构建原核表达载体pET-28a-5BE，诱导表达重组蛋白His-5BE；将纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠，制备多克隆抗体，并以间接ELISA和Western Blot方法检测多克隆抗体的效价及反应性。结果显示：体外表达获得的重组蛋白His-5BE大小为22 kD；经ELISA检测，制备的His-5BE多抗血清效价至少达到1:160 000；经Western Blot检测，制备的抗血清1:500稀释时具有良好的反应性。结果表明，本研究成功获得了BVDV 5BE重组蛋白及其多克隆抗体，为后续BVDV单克隆抗体制备及检测方法建立奠定了基础。     

牛病毒性腹泻病毒E2蛋白的多克隆抗体制备及鉴定

为制备牛病毒性腹泻病毒(BVDV)重组E2蛋白的兔源多克隆抗体,本研究利用表达BVDV E2蛋白的重组质粒pET30a-E2转化E.coli BL21(DE3),经诱导表达获得重组E2蛋白。Western blot检测显示纯化蛋白能够与BVDV参考阳性血清反应。以纯化的重组E2蛋白免疫新西兰白兔制备多克隆抗体,病毒中和试验测定其中和效价为1:2048,间接免疫荧光和western blot试验表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的BVDV重组E2蛋白兔源多克隆抗体可应用于BVDV的检测,同时为进一步建立检测BVDV E2蛋白的ELISA方法奠定基础。     

非洲猪瘟病毒p30蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA抗体检测方法的建立

为建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的ASFV p30重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备单克隆抗体。以重组p30蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的p30单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化,建立了一种检测ASFV抗体的阻断ELISA方法。ROC曲线分析显示,该方法最佳阻断率临界值为16.63%。该方法与CSFV、FMDV-O/A、PRRSV、PEDV、SVA的阳性血清均无交叉反应;最低能检出1∶128稀释的阳性血清;批内和批间变异系数(CV)均＜10%。用本方法与商品化试剂盒平行检测208份血清样品,Kappa值为0.96,表明具有高度一致性。上述结果表明,本研究建立的阻断ELISA方法具有较高的特异性和敏感性,可用于血清ASFV抗体的检测,为ASFV流行病学调查及猪群疫情监控提供技术支持。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区高效表达及间接ELISA抗体检测方法的建立和应用

利用大肠杆菌表达猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区,建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法。依据大肠杆菌密码子偏好性对猪瘟病毒E2基因主要抗原区的稀有密码子进行同义替换,克隆至pET-30a(+),转化大肠杆菌BL21(DE3)构建重组表达菌,并将纯化重组蛋白作为抗原建立猪瘟病毒间接ELISA抗体检测的方法。对重组蛋白进行SDS-PAGE和Western blot检测,结果显示获得分子量为30 ku的重组蛋白,占细菌总蛋白的41%,与猪瘟抗体特异性反应强;间接ELISA重复性检测显示批内变异系数为3.72%,批间变异系数为4.75%;特异性检测显示,与猪圆环病毒、蓝耳病病毒、伪狂犬病病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒和口蹄疫病毒的抗体阳性血清无交叉反应,并且对566份样品的临床检测结果显示与爱德仕猪瘟阻断ELISA试剂盒的阳性符合率为90.80%,阴性符合率为93.29%,总符合率为91.52%。结果表明密码子优化后E2重组蛋白实现高效表达,建立的猪瘟病毒间接ELISA抗体检测方法成本低、准确率高,可进一步开发应用。     

猪瘟病毒E2蛋白主要抗原区的原核表达及其间接ELISA检测方法的建立与应用

采用RT-PCR方法扩增猪瘟病毒(CSFV)E2蛋白主要抗原区基因,克隆入原核表达载体pET32a(+),转化大肠埃希菌BL21构建重组表达菌,经SDS-PAGE和Western blot鉴定目的蛋白得到成功表达。利用纯化的重组蛋白作为包被抗原,通过反应条件优化,建立了间接ELISA抗体检测方法。ELISA抗原最适包被浓度为0.5μg/mL(0.05μg/孔),最佳封闭液为5g/L BSA,待检血清最适稀释度为1∶100,作用时间为1h,酶标抗体最适稀释度为1∶2 000,最适作用时间为45min,室温显色10min。用该方法检测牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清结果均为阴性;批内和批间重复试验变异系数分别<5%和<8%,表明本方法具有较好的特异性和重复性。应用△E2-ELISA对350份血清样品进行检测,阳性率为77.71%,高于IDEXX试剂盒检测阳性率(67.14%),与IDEXX试剂盒阳性符合率91.06%,阴性符合率50%,总符合率77.43%。表明本试验建立的间接ELISA方法适于临床CSFV血清抗体的检测。     

猪细小病毒间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种敏感、特异、高通量的猪细小病毒抗体检测方法,参照猪细小病毒(PPV)VP2蛋白的基因序列设计合成1对特异性引物,PCR扩增了VP2蛋白主要抗原区域,将目的片段克隆至p ET30a原核表达载体中,获得了以可溶形式表达的重组VP2蛋白,重组蛋白纯化后,经免疫印迹检测显示具有良好的抗原性;以纯化蛋白为包被抗原,经间接ELISA反应条件的优化,建立了检测PPV抗体的间接ELISA方法。结果表明:用该方法检测猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪伪狂犬病毒(PRV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性血清,结果均为阴性;批内重复性试验的变异系数小于5%,批间重复性试验的变异系数小于10%;与血凝抑制试验(HI)方法的符合率为94.49%;应用该方法检测869份疫苗免疫猪血清样品,免疫合格率为87.92%;检测248份未免疫疫苗猪血清样品,阳性感染率为7.25%。     

牛病毒性腹泻病毒重组p80蛋白的间接ELISA方法的建立

为建立以牛病毒性腹泻病毒(BVDV)非结构蛋白p80为包被抗原的间接ELISA方法,本研究将重组质粒pET30a-p80转化至大肠杆菌BL21(DE3)表达菌,将转化菌培养并诱导后,通过SDS-PAGE证实了p80蛋白以包涵体形式获得了表达,将纯化后的重组p80蛋白作为包被抗原,通过方阵滴定优化反应条件,建立了检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法。特异性试验结果显示,该方法与BVDV阳性血清反应呈阳性,而与牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型、牛呼吸道合胞体病毒、口蹄疫病毒及猪瘟病毒等常见病原的阳性血清无交叉反应,特异性较强。敏感性试验结果显示本实验建立的间接ELISA方法在阳性血清11 280倍稀释时检测结果仍呈阳性,而病毒中和试验结果显示该阳性血清稀释度在1512时检测结果就已为阴性,表明该方法的敏感性较高。重复性试验结果显示批内批间变异系数均小于10%,表明该方法重复性较好。采用本实验建立的方法与病毒中和试验同时检测90份牛血清,结果显示二者的符合率为95%。利用本研究建立的间接ELISA方法对188份采自国内两个不同地区的牛血清样品进行了检测,检出BVDV阳性血清162份,阳性血清检出率为86.2%。本研究建立的检测BVDV血清抗体的间接ELISA方法可用于国内BVDV的血清流行病学调查,为相关疫病的防控提供技术支持。     

牛病毒性腹泻病毒重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

为建立一种简单快速、敏感特异、高通量的牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)抗体检测方法,采用原核表达方法对BVDV E2基因中免疫原性强的1段序列进行截短表达,获得了具有良好反应活性的重组E2蛋白,以重组E2蛋白为包被抗原建立了检测BVDV抗体的间接ELISA方法。结果显示:该方法检测牛副流感病毒3型(BPIV-3)、牛轮状病毒(BRV)、牛冠状病毒(BCV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)阳性血清均为阴性,检测BVDV抗体的灵敏度可达1∶12 800,批内和批间重复性试验的变异系数分别小于5%和10%,与中和试验的符合率为94.44%。应用该方法检测国内外5个生产厂家的53批次细胞培养用牛血清样品,阳性污染率达39.62%;检测589份临床牛血清样品,阳性感染率为34.80%。研究表明,建立的BVDV重组E2蛋白间接ELISA抗体检测方法具有良好的特异性、敏感性、重复性和适用性,为BVDV感染的监测提供了重要工具。     

2011—2014年丹阳某养猪场猪瘟抗体检测结果分析

<正>为了及时了解猪瘟抗体免疫状况,笔者团队多年来采用阻断ELISA方法定期对该猪场进行血清样品猪瘟抗体检测,通过几年的抗体检测,猪瘟抗体水平有了一定的提高,猪瘟免疫程序更加优化,猪瘟防控有了一定的效果。猪瘟(CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的一种高度接触性传染病,给全球养猪业造成巨大的经济损失。我国一直高度重视猪瘟的防治,自1956年制定以免疫猪瘟兔化弱毒疫苗为     

小反刍兽疫病毒N蛋白阻断ELISA方法的建立

小反刍兽疫(PPR)是一种跨国传播的重大烈性传染病,主要发生于山羊和绵羊等小反刍动物,具有高发病率和死亡率。小反刍兽疫病毒(PPRV)N蛋白是抗体检测的主要靶蛋白,本研究将PPRV Nigeria 75/1毒株的N蛋白进行原核表达,重组蛋白经鉴定和纯化后免疫BALB/c小鼠。取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞融合,筛选针对PPRV N蛋白的阳性单克隆细胞株,获得了具有阻断效果的单克隆抗体1B11株。经免疫荧光方法鉴定该单克隆抗体与PPRV Nigeria 75/1毒株发生特异性反应。用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,辣根过氧化物酶标记1B11抗体作为阻断抗体,建立了检测PPRV抗体的阻断ELISA方法。经优化反应条件,抗原的最佳包被浓度为2.5μg/mL,阻断抗体的最佳浓度为1μg/mL,待检血清1∶2稀释反应1 h,底物反应时间为10 min,阴阳性检测临界值为阻断率为58.5%。特异性试验证明该方法与山羊副流感病毒3型(CPIV3)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、边界病病毒(BDV)等阳性血清不发生交叉反应。通过对234份血清样品进行检测,该方法与商品化试剂盒符合率为91%(213/234)。由此表明,建立的阻断ELISA方法可用于PPRV临床样品的抗体水平检测,为PPRV疫苗免疫效果检验及PPRV根除提供了基础。