SPATA3基因克隆及其在牦牛和犏牛睾丸中的差异表达研究

旨在克隆牦牛精子发生蛋白3（spermatogenesis associated 3,SPATA3）基因,并检测其在牦牛不同组织及在不同发育时期牦牛和犏牛睾丸中的表达水平,探讨SPATA3对睾丸发育和精子成熟的影响,为进一步研究该基因在精子形成过程中的作用机制提供理论依据。本试验以牦牛为研究对象,利用RT-PCR克隆技术获取牦牛SPATA3 cDNA序列,使用生物信息软件分析其结构和功能,并检测其在牦牛心、肝、脾、肺、肾、脑、小肠、卵巢、子宫和睾丸组织中的表达谱。通过实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR,RT-qPCR）检测SPATA3基因在牦牛和犏牛睾丸不同发育时期的表达规律;采用免疫组化技术检测SPATA3在牦牛和犏牛睾丸中的细胞定位及表达差异。结果显示,SPATA3基因CDS区为693 bp,编码230个氨基酸,与黄牛、野牦牛和水牛的同源性较高;SPATA3仅在耗牛睾丸组织中特异性表达,其它组织未见其表达。RT-qPCR结果显示,SPATA3基因在牦牛睾丸发育过程中均有表达,其中成年期（4~5岁）睾丸中的表达极显著高于胎牛时期（5~6月,P<0.01）,且其在牦牛不同发育时期睾丸中的表达均极显著高于犏牛（P<0.01）。免疫组化结果发现,SPATA3在圆形精子、长形精子细胞胞浆中均表达,且成年期牦牛睾丸中该基因的表达水平极显著高于犏牛（P<0.01）。综上表明,SPATA3在遗传进化中高度保守,且在牦牛和犏牛睾丸组织中差异表达,该基因低表达可能引起精子形成障碍,从而参与精子成熟进程,但具体功能有待进一步的研究。     

GSTM3基因在牦牛和犏牛睾丸及附睾组织中的表达研究

谷胱甘肽S-转移酶Mu 3(GSTM3）是一种必需的抗氧化酶,其在精子中的存在与精子的耐冷性、质量和生育能力有关。为研究GSTM3的表达与雄性牦牛繁殖功能的关系,本研究对牦牛附睾GSTM3基因进行克隆、生物信息学分析,并应用实时荧光定量PCR分析GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中的表达情况。结果表明,牦牛GSTM3基因CDS区序列长度为678 bp,编码225个氨基酸;GSTM3基因编码蛋白为弱酸性且不具有跨膜结构,分子式为C1204H1857N319O340S19,分子量和等电点分别为26.85 ku和7.29;牦牛GSTM3核苷酸序列与普通牛和瘤牛有较高的种间同源性,分别为99.26%和98.53%;GSTM3基因在牦牛和犏牛附睾以及睾丸组织中均有不同程度的表达,牦牛附睾和睾丸的GSTM3表达量显著高于犏牛。     

牦牛DDAH1和DDAH2基因的克隆测序及其在牦牛和犏牛睾丸中的表达差异

为了测定牦牛DDAH1和DDAH2基因序列并比较其在牦牛和雄性不育犏牛睾丸中的表达,以探究该基因与犏牛雄性不育的联系,试验从牦牛睾丸中提取总RNA,采用RT-PCR技术克隆并测序获得牦牛DDAH1和DDAH2基因的c DNA序列;利用实时荧光定量RT-PCR技术检测这两个基因在牦牛与犏牛睾丸中的表达。结果表明:克隆获得的牦牛DDAH1和DDAH2基因序列分别长959 bp及1 091 bp,均包含858 bp的CDS区。DDAH1基因序列与普通牛相比有4个碱基差异,序列同源性为99.58%,而推导的氨基酸序列仅存在1个氨基酸残基差异;DDAH2基因序列与普通牛比较相差1个碱基,序列同源性为99.91%,推导的氨基酸序列存在1个氨基酸残基差异。DDAH1和DDAH2基因在牦牛和犏牛睾丸组织中均有表达,DDAH1基因在犏牛睾丸组织中的表达量显著高于牦牛(P0.05),是牦牛睾丸组织中表达量的1.5倍;DDAH2基因在犏牛睾丸中的表达量与牦牛相比差异不显著。说明DDAH基因表达在犏牛睾丸中上调可能与其雄性不育有关。     

miR-383在牦牛、犏牛睾丸组织中的差异表达及功能预测

本研究旨在分析miR-383成熟体在雄性牦牛和犏牛F1代睾丸组织中的差异表达,以了解其在精子形成中的重要作用.以发育成熟的牦牛和犏牛睾丸组织为材料,利用实时荧光定量PCR方法检测miR-383成熟体在牦牛及犏牛睾丸组织中的差异表达情况;利用TargetScan和miRanda数据库获得miR-383的靶基因集合,通过David和Gene Ontology在线软件分析miR-383靶基因的生物学功能.实时荧光定量PCR结果显示miR-383成熟体在牦牛和犏牛F1代睾丸组织中表达显著差异(P<0.05),在牦牛睾丸组织中表达量较高,靶基因预测共获得131个靶基因,GO分析及KEGG信号通路分析得到miR-383靶基因功能,这些靶基因参与了细胞增殖、凋亡、核酸合成调控等过程.结合miR-383成熟体的表达差异和靶基因功能预测结果,miR-383可能参与生殖细胞的分化及精子形成调控,为miR-383在犏牛生殖细胞中的功能与调控机制研究提供了理论依据.     

犏牛和牦牛ESCO2基因的序列特征及其在睾丸中的表达对比分析

旨在克隆犏牛和牦牛姐妹染色单体内聚建立蛋白2（establishment of sister chromatid cohesion N-acetyltransferase 2,ESCO2）基因,并分析其在不同发育阶段睾丸中的表达与定位,为进一步解析ESCO2在减数分裂过程中的作用机制提供理论依据。本研究以健康雄性犏牛及牦牛为试验动物,根据年龄分为胎牛组（5~6月龄）、幼年组（1~2岁）和成年组（3~4岁）,每组各3头。通过RT-PCR技术克隆犏牛和牦牛ESCO2基因并进行生物信息学分析,采用实时荧光定量PCR （quantitative real-time PCR,qRT-PCR）检测ESCO2基因在犏牛不同组织中的表达谱,比较分析ESCO2在犏牛和牦牛不同时期睾丸中的表达规律,利用免疫组织化学（immunohistochemistry,IHC）技术检测ESCO2蛋白的细胞定位和表达差异。结果显示,犏牛ESCO2基因（GenBank登录号：MW198470） CDS区为1 833 bp,编码610个氨基酸,与牦牛相比,犏牛ESCO2序列第301~319位多19个氨基酸,另有3个氨基酸突变;犏牛ESCO2蛋白序列与黄牛的同源性高于其他哺乳动物;ESCO2可能与SMC3、SMC1A、PDS5A、PDS5B、STAG2等蛋白相互作用,互作蛋白功能与姐妹染色单体凝聚、减数分裂细胞周期、DNA修复、细胞分裂和染色体重构等生物学过程相关。ESCO2在犏牛各组织中均有表达,但在睾丸中的相对表达水平显著高于其它组织（P<0.05）;在犏牛睾丸中的表达随年龄增长呈上升趋势,幼年和成年时期犏牛睾丸中ESCO2的表达显著低于同时期牦牛（P<0.05）;IHC染色结果发现,雄性犏牛减数分裂阻滞于初级精母细胞,ESCO2蛋白在犏牛初级精母细胞中无表达并与牦牛存在差异。本研究结果表明,犏牛与牦牛的ESCO2基因、蛋白序列差异较大,且在睾丸发育过程中的表达模式差异显著,这可能是引起雄性犏牛减数分裂阻滞及不育的原因之一,其具体作用机制有待进一步研究。     

牦牛、犏牛睾丸组织中SYCP 3基因mRNA表达水平研究

本文采用RT-PCR和荧光定量PCR对牦牛SYCP3基因的组织表达,以及SYCP3基因在牦牛和犏牛睾丸组织中的表达水平进行分析。结果表明,SYCP3基因在牦牛睾丸组织中特异表达,牦牛与犏牛睾丸组织中SYCP3基因的表达水平差异极显著（P〈0．01）。睾丸和附睾组织切片显示,牦牛睾丸组织中可见各级生精细胞,附睾内可见发育良好的精子,而犏牛睾丸组织中无次级精母细胞和更高级生精细胞、附睾内未观测到精子,与人和小鼠SY-CP3基因缺失或表达水平降低出现的表型一致,可以认为SYCP3基因的表达水平可能与犏牛的雄性不育有一定的关系。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛（P<0.01）;此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛（P<0.05,P<0.01）,而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著（P>0.05）。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

HIF-1α和IL-17在牦牛、犏牛及黄牛睾丸中的表达比较研究

本研究旨在比较HIF-1α和IL-17在不同牛睾丸组织中的差异性表达,进一步探究HIF-1α与IL-17在牛睾丸组织中发挥调控功能的关联性。以成年牦牛、犏牛和黄牛的睾丸作为研究对象,采用Western-blot、实时荧光定量PCR法检测HIF-1α及IL-17蛋白和基因在3种牛睾丸组织的表达差异。结果显示,3种牛睾丸组织中HIF-1α与IL-17基因和蛋白表达都存在显著性差异,且在犏牛睾丸组织中的表达均极显著高于牦牛和黄牛(P0.01);此外,牦牛HIF-1α与IL-17蛋白水平表达显著高于黄牛(P0.05,P0.01),而牦牛IL-17基因水平表达与黄牛差异不显著(P0.05)。HIF-1α和IL-17基因和蛋白在不同牛睾丸组织中的表达差异说明其具有种属特异性;而牦牛和犏牛睾丸组织中显著性高表达提示HIF-1α和IL-17对适应低氧环境具有重要的调节作用。     

牦牛CRH基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

为了探讨促肾上腺皮质激素释放激素（corticotropin-releasing hormone,CRH）基因在牦牛繁殖中的调控作用,试验分别采集5头成年母牦牛和5头成年母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫等组织,通过RT-PCR技术及生物信息学软件对牦牛CRH基因编码区进行扩增、克隆及序列分析,并构建系统进化树;采用实时荧光定量PCR法检测CRH基因的组织表达。结果表明,牦牛CRH基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。牦牛与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的CRH基因核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%。系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近,并与其他物种类聚,符合物种进化规律。CRH蛋白分子式为C₉₂₀H₁₅₀₃N₂₇₉O₂₆₃S₃,分子质量为20776.95 u,理论等电点为10.95,其氨基酸组成中亮氨酸（L）、脯氨酸（P）、丙氨酸（A）和精氨酸（R）所占比例较高,分别为15.8%、12.6%、12.1%和10.5%。CRH蛋白为不稳定亲水蛋白,存在信号肽和跨膜结构。CRH蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占41.05%、1.05%、8.42%和49.48%,三级结构分析结果与其相一致。CRH基因mRNA在牦牛下丘脑中表达量最高,显著高于其他组织（P<0.05）,在子宫中表达量最低。牦牛脑垂体前叶CRH基因mRNA表达量极显著高于黄牛（P<0.01）,在卵巢、输卵管中表达量显著高于黄牛（P<0.05）,而两个品种在下丘脑、子宫中的表达量差异不显著（P>0.05）。提示CRH基因在牦牛繁殖调控中具有重要作用。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P<0.05;P<0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P<0.05;P<0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P<0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

牦牛FSHR基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

本研究旨在阐明牦牛促卵泡素受体(follicle stimulating hormone receptor,FSHR)基因CDS序列及其在牦牛生殖轴中表达的特点,为探讨其在牦牛繁殖活动中的调控作用奠定基础。试验采集卵泡期的牦牛与黄牛下丘脑、脑垂体前叶、卵巢、输卵管及子宫组织,通过RT-PCR技术对牦牛FSHR基因cDNA进行扩增、克隆与序列分析;采用实时荧光定量PCR法检测FSHR基因在牦牛与黄牛中的组织表达差异。结果显示,牦牛FSHR基因编码区全长2 088bp,编码695个氨基酸,蛋白质分子式为C6378H10670N2088O2637S576,分子质量为177 263.85u,理论等电点(pI)为4.88,与黄牛、绵羊、山羊和猪氨基酸序列同源性较高(91.50%～99.38%)。FSHR蛋白为酸性不稳定疏水蛋白,存在信号肽与8个跨膜结构;二级结构由延伸链(15.54%)、α-螺旋(42.30%)、β-转角(1.44%)和无规则卷曲(40.72%)组成;系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近;实时荧光定量PCR结果显示,FSHR基因在黄牛、牦牛检测组织中均有表达,牦牛子宫中表达量显著或极显著高于除卵巢外的其他组织(P0.05;P0.01),而黄牛卵巢中表达量显著或极显著高于其他组织(P0.05;P0.01);黄牛卵巢中表达量极显著高于牦牛(P0.01)。说明FSHR基因在动物进化中较为保守,其在牦牛卵巢中表达量低可能影响到牦牛繁殖机能。     

牦牛CRH基因克隆及其在生殖轴中的表达研究

为了探讨促肾上腺皮质激素释放激素(corticotropin-releasing hormone,CRH)基因在牦牛繁殖中的调控作用,试验分别采集5头成年母牦牛和5头成年母黄牛的下丘脑、脑垂体前叶、输卵管、卵巢和子宫等组织,通过RT-PCR技术及生物信息学软件对牦牛CRH基因编码区进行扩增、克隆及序列分析,并构建系统进化树;采用实时荧光定量PCR法检测CRH基因的组织表达。结果表明,牦牛CRH基因编码区全长573 bp,编码190个氨基酸。牦牛与黄牛、猫、鸡、人、小鼠、大鼠和猪的CRH基因核苷酸同源性分别为99.8%、43.3%、36.1%、46.2%、39.0%、38.5%和56.4%。系统进化树表明,牦牛与黄牛亲缘关系最近,并与其他物种类聚,符合物种进化规律。CRH蛋白分子式为C_(920)H_(1503)N_(279)O_(263)S_3,分子质量为20 776.95 u,理论等电点为10.95,其氨基酸组成中亮氨酸(L)、脯氨酸(P)、丙氨酸(A)和精氨酸(R)所占比例较高,分别为15.8%、12.6%、12.1%和10.5%。CRH蛋白为不稳定亲水蛋白,存在信号肽和跨膜结构。CRH蛋白二级结构中α-螺旋、β-转角、延伸链和无规则卷曲分别占41.05%、1.05%、8.42%和49.48%,三级结构分析结果与其相一致。CRH基因mRNA在牦牛下丘脑中表达量最高,显著高于其他组织(P0.05),在子宫中表达量最低。牦牛脑垂体前叶CRH基因mRNA表达量极显著高于黄牛(P0.01),在卵巢、输卵管中表达量显著高于黄牛(P0.05),而两个品种在下丘脑、子宫中的表达量差异不显著(P0.05)。提示CRH基因在牦牛繁殖调控中具有重要作用。     

牦牛NGF基因克隆及其在生殖器官中的表达定位

旨在探究NGF基因的生物学特性及其在母牦牛生殖器官中的表达特性.本研究收集黄体期母牦牛的心、肝、脾、肺、肾以及胎牛期、卵泡期、黄体期、妊娠期母牦牛的卵巢、子宫和输卵管(n=3),利用RT-PCR克隆牦牛NGF基因,并对其序列进行生物信息学分析,利用RT-qPCR技术分析NGF基因的组织表达特性,利用免疫组化技术(IHC...     

黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达水平

Boule基因是DAZ家族成员之一,在生殖细胞中特异表达是精子发生过程中减数分裂的关键调控因子,其表达缺乏可引起减数分裂阻滞和精子生成障碍,导致雄性不育。为揭示Boule基因mRNA表达水平与犏牛雄性不育关系,本研究利用实时荧光定量PCR法,对黄牛、牦牛和犏牛睾丸组织中Boule基因mRNA表达进行定量分析。结果表明:Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平相对都比较高,黄牛与牦牛差异不显著(P>0.05);而Boule基因在黄牛和牦牛睾丸组织中的表达水平显著高于犏牛,黄牛、牦牛与犏牛差异显著(P<0.05)。结果提示,Boule基因在犏牛睾丸组织中低表达与犏牛雄性不育相关,可作为研究犏牛雄性不育的重要候选基因。     

牦牛及杂种后代犏牛的TSPY基因克隆分析

克隆测序了牦牛、犏牛TSPY基因的编码区全序列,并用生物信息学软件分析了该基因的编码区序列、蛋白结构和进化关系.结果表明,牦牛和犏牛TSPY基因编码区序列长度均为954 bp,编码317个氨基酸,牦牛与普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％,犏牛与牦牛、普通牛TSPY基因序列的一致性分别为98.95％、99.79％,杂交后代犏牛与亲本序列差异表现在第113位核酸位点发生了改变(T→T→C),导致第38位氨基酸发生变化(V→V→A).牦牛和犏牛TSPY蛋白含有TSPY家族典型的SET/NAP保守结构域,与人、鼠TSPY蛋白结构域一致,推测牦牛和犏牛TSPY蛋白在雄性减数分裂过程中参与了精原细胞和初级精母细胞的调节.     

牦牛Fas和FasL基因克隆及其在主要组织器官中的表达

为了进一步理解Fas/FasL系统,本研究拟克隆牦牛Fas和FasL基因,并对2个基因在各组织器官中的表达进行检测。采用RT-PCR方法克隆牦牛Fas和FasL基因,并利用相关软件进行生物信息学分析,结合RTPCR方法及免疫组织化学方法对2个基因在牦牛主要组织器官中的表达进行检测。克隆得到了2 605bp的牦牛Fas基因cDNA和1 572bp的FasL基因cDNA序列,与黄牛的相应序列有很高的同源性(分别为99.1%和99.4%)。除了在心中只检测到Fas mRNA外,Fas和FasL mRNA共同表达于所有检测的组织中,且2个基因均在肝、脾、肾、淋巴结、胸腺和睾丸中强表达。免疫组化检测发现FasL蛋白存在于多种体细胞的胞浆中。结果表明,除了在淋巴器官和免疫赦免位点外,Fas和FasL还强表达于其他器官如肾和肝,表明Fas/FasL系统比以前所了解的要复杂。     

类乌齐牦牛SIRT3基因克隆与生物信息学及差异表达分析

本实验旨在丰富牦牛 SIRT3基因的基础研究,通过对西藏类乌齐牦牛 SIRT3基因克隆、生物信息学分析及差异表达分析,进一步探讨 SIRT3基因的生理功能及分子机制。结果表明:类乌齐牦牛 SIRT3基因CDS区长 1 002 bp,编码 333个氨基酸,与普通牛 SIRT3基因 CDS区比对存在碱基突变,编码氨基酸发生错义和同义突变,同义突变发生在碱基第 49、279、342、384 位,错义突变发生在碱基第 149 和 620 位,其编码蛋白属亲水性蛋白,有多个跨膜区域和磷酸化位点,无信号肽片段,主要位于线粒体,二级结构以无规卷曲和α-螺旋为主;SIRT3基因编码蛋白在催化活性、核苷酸结合及辅因子结合等过程发挥主要功能,主要参与生物体代谢过程;类乌齐牦牛 SIRT3基因序列与普通牛一致性较高,亲缘关系最近;QPCR分析显示,SIRT3基因在牦牛肝脏中的表达水平极显著高于其他组织(P<0.01)。