牛IRX3基因启动子转录调控分析

旨在探究牛IRX3基因组织表达规律，并鉴定其启动子区关键转录因子，以期阐明其转录调控机制。本研究采集3头成年公牛心、肝、脾、肺、肾、皮下脂肪、背最长肌、大肠、小肠、网胃、瘤胃、皱胃及睾丸组织，利用荧光定量PCR检测IRX3基因在不同组织中相对表达量。同时克隆牛IRX3基因1.8 kb启动子区序列并构建其启动子6个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体，分别转染3T3-L1和C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子，借助定点突变及siRNA干扰技术在3T3-L1细胞系内初步鉴定关键转录因子对IRX3基因的转录调控作用。结果表明，IRX3基因在牛13个不同组织中均有表达，且在肺、肾、心、皮下脂肪、背最长肌中高表达（P<0.05）。利用双荧光素酶报告载体检测到牛IRX3基因核心区域在-372/-42 bp。结合定点突变及siRNA干扰技术初步鉴定NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1转录因子对IRX3基因的转录活性有重要的调控作用。综上表明，牛IRX3基因在背最长肌和脂肪组织中表达量相对较高，其启动子1.8 kb区有8个CpG岛，核心区关键转录因子NRF1、KLF4、HOXA5和CREB1位于CpG岛内且调控IRX3基因转录活性。本研究结果为探究IRX3基因在牛脂肪沉积过程中的分子调控机制奠定了重要理论基础。     

秦川牛PLAG1基因启动子克隆及转录因子预测

【目的】探究秦川牛多形性腺瘤基因1(pleomorphic adenoma gene 1,PLAG1)的组织表达规律,并克隆其启动子区序列,预测分析其关键转录因子结合位点,为探究其转录调控机制提供理论参考。【方法】采集3头20月龄秦川牛成年公牛心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、皮下脂肪、背最长肌、瘤胃组织,用实时荧光定量PCR方法检测PLAG1基因在不同组织中的相对表达量,同时克隆PLAG1基因上游启动子区序列,利用生物信息学软件预测PLAG1基因转录起始位点及启动子核心区域,分析、筛选核心启动子区域的关键转录因子结合位点。【结果】PLAG1基因在秦川牛各组织中均有表达,且在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P<0.05)。PLAG1基因启动子序列全长1 861 bp,生物信息学预测分析发现PLAG1基因核心启动子区位于-297―+42 bp,存在高度保守的Krüppel样因子5(KLF5)、cAMP反应元件结合蛋白1(CREB1)和早期生长反应因子1(EGR1)转录因子结合位点,且CpG岛位于PLAG1基因核心启动子区域内。【结论】PLAG1基因在肌肉组织中高表达,其核心启动子区...     

牛CART基因核心启动子鉴定及转录调控分析

旨在筛选牛CART基因核心启动子区并鉴定调控CART表达的转录因子,探究其转录调控机制。本研究采集3头健康母牛下丘脑组织,提取基因组DNA,通过PCR扩增、测序获得牛CART启动子序列,EMBOSS、MethPrimer、New PLACE数据库分析启动子结构特征;构建4个包含不同截短长度的CART启动子报告基因载体,双荧光素酶报告基因活性检测鉴定核心启动子区;应用DNA pull down结合质谱分析(n=3),功能聚类及结合位点预测分析筛选核心启动子区候选转录因子;构建转录因子过表达载体,转染至293T细胞,分析转录因子对牛CART核心启动子区的转录调控功能(n=3)。结果表明,牛CART基因-1 200 bp～+22 bp区域存在CpG岛和TATA box、CAAT box等顺式作用元件;构建的4个截短启动子报告基因载体均具有转录起始活性,-292 bp～+22 bp片段转录起始活性最强,为牛CART基因核心启动子区;转录因子RFX5、CREB、RFX1、JUND、TEAD4、TFAP2D、RELA可与牛CART基因核心启动子区特异性结合;进一步研究证实RFX5、RFX1、TEA...     

牦牛FKBP6基因启动子区克隆、鉴定与分析

本研究旨在了解牦牛FKBP6基因5′调控区和启动子区特征,为探讨牦牛和犏牛睾丸组织中FKBP6基因差异表达机制提供依据。利用克隆测序获得牦牛FKBP6基因5′调控区序列,采用生物信息学方法分析其序列特征;采用双荧光素酶报告基因系统鉴定牦牛FKBP6基因核心启动子区,利用生物信息学软件预测与精子发生有关的转录因子结合位点。通过克隆测序和序列拼接获得了1 354bp的牦牛FKBP6基因5′调控区序列,与普通牛的一致性为99.71%;牦牛FKBP6基因5′调控区序列含有潜在的启动子区、典型的CAAT-Box和CpG岛,但未见TATA-Box;荧光素酶活性分析发现,牦牛FKBP6基因的核心启动子区位于5′调控区的-263~-167nt区域,含有CAAT-Box、E-Box、CTCF和CREB等与精子发生相关的转录因子结合位点。牦牛FKBP6基因核心启动子的鉴定和精子发生相关转录因子结合位点的发现为进一步研究牦牛睾丸组织中FKBP6基因的表达调控奠定了基础。     

陆川猪GPR1基因启动子甲基化及其mRNA表达分析

为了探讨G-蛋白偶联受体1(GPR1)基因启动子甲基化对其在陆川猪和杜洛克猪背最长肌组织中差异表达的影响,试验采用实时荧光定量PCR方法检测GPR1基因mRNA在两个品种猪背最长肌中的表达水平,在线预测的方法预测GPR1基因启动子区CpG岛,亚硫酸氢盐测序(BSP)法分析猪GPR1基因启动子区CpG岛的甲基化水平。结果表明:GPR1基因在两品种猪背最长肌组织中的相对表达量差异显著,在陆川猪背最长肌中的相对表达量明显高于杜洛克猪;GPR1基因启动子区存在一个CpG岛,长度为103 bp,位于-1 031~-929 bp处;GPR1基因启动子区CpG岛在两品种猪背最长肌中的整体甲基化水平差异不显著,但在-126,-116,-64,-10位点甲基化水平差异显著。说明GPR1基因启动子甲基化程度与肌内脂肪沉积存在一定关联。     

调控民猪ZBED6基因转录元件的筛选与分析

ZBED6是锌指蛋白家族的一员,在胎盘哺乳动物中极其保守,可通过对IGF2的调控参与骨骼肌生长。为进一步探究ZBED6基因自身的表达调控机制,本研究以民猪基因组DNA为模板,通过常规PCR扩增ZBED6基因启动子区系列截短片段,构建克隆质粒,通过双酶切和连接反应定向连入pGL3-basic载体,利用PK15细胞和双荧光素酶检测系统测定重组质粒的相对荧光素酶活性;利用在线软件预测启动子区的转录因子结合位点,使用重叠PCR定点缺失转录因子结合位点,构建突变载体并在PK15细胞中检测突变载体的相对荧光素酶活性。结果表明:ZBED6基因启动子区-2053^-1777 bp存在多个转录因子结合位点,尤其是-1808^-1777 bp,该片段缺失造成启动子活性下降(P<0.01);利用在线软件在该区间预测到3个转录因子HINFP、Adf-1和CREB3,经实验验证后发现这3个转录因子均可调控ZBED6基因的转录,其中Adf-1效果最为明显。据此推测,民猪ZBED6基因的转录调控机制较为复杂,其启动子区存在HINFP、Adf-1和CREB3等多个调控元件的结合位点。     

Lbx1与Lbx2基因在猪骨骼肌中的甲基化状态简

为了探究猪Lbx1和Lbx2基因的甲基化模式,本研究采用亚硫酸盐测序技术,在猪背最长肌中分析Lbx1和Lbx2基因启动子和外显子1的甲基化状态。结果发现,Lbx1基因的甲基化差异区在外显子1处的CpG岛内;Lbx2基因的甲基化差异区在CpG岛外的启动子区。Lbx1基因CpG岛内的高密度甲基化可能参与下调该基因在背最长肌中的表达量。     

北极狐MITF-M基因启动子活性及转录调控元件的分析

为了探究MITF-M基因对狐狸毛色的遗传调控机制,利用PCR扩增技术对北极狐MITF-M基因启动子区6个缺失片段(2 279,1 738,1 313,1 040,524和236 bp)进行扩增,利用双荧光素酶报告基因检测技术对该基因启动子表达载体转染细胞(A375和293T)的相对活性进行检测,通过在线软件对核心启动子区转录因子结合位点进行预测,利用重叠延伸PCR和双荧光素酶报告系统检测技术对预测出来的转录因子结合位点进行点突变活性分析。结果表明,北极狐MITF-M基因启动子区524 bp(-510 bp/+13 bp)处活性最高,预测发现-510 bp/-222 bp区域存在CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)转录因子结合位点,这3个转录因子结合位点突变后能使北极狐MITF-M基因的启动子活性上升。综上,北极狐MITF-M基因核心启动子区在-510 bp/-222 bp区域,转录因子结合位点CREB(-312 bp/-319 bp)、Sp1(-295 bp/-307 bp)和Sp1(-249 bp/-262 bp)对北极狐MITF-M基因的转录激活起到一定的调控作用。     

牛MyoG基因启动子的克隆及功能的初步分析

本研究旨在比较日本和牛MyoG基因的不同长度片段启动子的活性强弱并初步探讨其中的机制。根据GenBank已公布的牛MyoG基因的启动子序列,设计特异性PCR引物扩增日本和牛MyoG基因的一系列启动子缺失序列,构建重组克隆载体pMD18-T-MyoGpro,对阳性克隆进行限制性酶切鉴定、测序及生物信息学分析,进而构建一系列启动子缺失片段的pGL3-MyoGpro双荧光素酶表达载体,转染牛肌源干细胞(MDSCs)和牛胎儿成纤维细胞,并进行双报告基因活性检测。结果表明,日本和牛MyoG基因的166～2 125bp启动子都能不同程度的启动双荧光素酶报告基因在牛肌源干细胞中的表达,且具有肌肉特异性。通过生物信息学分析得知日本和牛MyoG启动子序列中有1个TATA盒,15个E-box,并可能含有MyoD、MEF2、MEF3、MTBF、TEF1、PRDF、Sp1、多个SRF、ERE、GRE及多个Oct-1等转录因子调控结合位点,本试验通过比较不同长度启动子片段的活性并结合对上述转录因子的分析,认为这些转录因子可能对启动子活性起着重要的调控作用。对牛MyoG基因启动子的克隆与功能和序列分析为进一步研究MyoG基因的表达调控奠定了基础。     

牛MYOZ2基因启动子克隆及活性分析

旨在克隆测定牛肌原调节蛋白2基因(Myozenin2,MYOZ2)启动子的全长序列,进行活性区域分析,为牛MYOZ2基因功能和表达调控机理研究提供理论依据。通过5′RACE方法确定牛MYOZ2基因转录起始位点;采用PCR技术,以牛基因组为模板克隆MYOZ2基因启动子序列。利用在线软件分析启动子区域中可能包含的转录因子结合位点。依据分析结果重新设计引物,构建7个包含不同缺失片段的双荧光素酶报告基因载体,转染C2C12细胞系,利用双荧光素酶系统检测不同片段的启动子活性。结果表明,克隆得到牛MYOZ2基因启动子序列2 065bp,确定MYOZ2基因的转录起始位点;MYOZ2基因片段-84/+125荧光素酶相对活性极显著高于空载体pGL3-Basic(P0.01),MYOZ2基因片段-683/+125荧光素酶相对活性极显著高于基因片段-263/+125(P0.01)。MYOZ2基因启动子核心区域位于-84/+125bp,而且MEF2,SRF,MyoD,YY1等转录因子可能参与MYOZ2基因的转录调控。     

猪StAR基因启动子区克隆及其转录活性研究

旨在通过分析猪StAR基因启动子活性区域,探究猪StAR基因的转录调控机制,从育种学角度为提高猪繁殖力提供新思路。本研究根据Ensembl数据库已公布的猪StAR基因的5′侧翼区序列,利用在线预测软件对该基因启动子区序列信息进行分析,以大白猪基因组DNA为模板,利用特异性引物,进行PCR扩增、测序,进而构建启动子区不同缺失片段的pGL3-StAR双荧光素酶表达载体,转染293T细胞并进行活性检测。结果显示,StAR基因5′侧翼区不含有典型的TATA-box和CpG岛;成功克隆了10个含有不同长度的启动子片段,并构建了各片段与表达载体的重组质粒;转染293T细胞后经双荧光素酶活性检测发现,大白猪StAR基因5′侧翼区存在着核心启动子,其中-196~+127bp这一区域活性值最高,且显著高于其他缺失片段(P0.01),表明在+127~-196bp的区域内存在重要的正调控因素,外显子1对启动子活性起重要的调控作用。-41~-196bp为核心启动子区域,该区域存在着关键的正调控元件,包含GATA2、GATA4、SP1、ZNF263、Hoxa9、KLF16和ZNF740转录因子结合位点。本试验通过对StAR基因进行生物信息学分析,并结合不同长度启动子片段双报告基因活性检测,证实了StAR基因的5′侧翼区序列具有启动子转录活性。初步确定了该基因的启动子区域,找到了启动子的核心区域和主要调控区域,为进一步研究StAR基因转录调控机制提供理论依据。     

牦牛KLF5、KLF6、KLF7基因的克隆表达及其与肌内脂肪含量的相关性分析

本研究旨在克隆牦牛Krüppel样因子(KLF5、KLF6、KLF7)的CDS区序列,鉴定其在牦牛不同组织中的表达水平,并分析其表达水平与牦牛肌内脂肪(IMF)的相关性,从而为研究KLFs在牦牛脂质代谢中的功能提供试验依据。选取4~6周岁的健康麦洼牦牛公牛7头,清晨空腹屠宰后,迅速采集脾、肺、肾、皮下脂肪和背最长肌组织样品,提取组织总RNA,利用RT-PCR法克隆牦牛KLF5、KLF6、KLF7基因序列,进行生物信息学分析,利用实时定量PCR法检测其mRNA的表达水平,并使用皮尔逊相关系数进行KLF5、KLF6、KLF7基因的表达量与IMF含量的相关性分析。结果表明,KLF5、KLF6、KLF7基因CDS全长分别为1 086、855和909bp,分别编码361、284和302个氨基酸残基,且均与牛具有最近的亲缘关系,其次为山羊、绵羊、猪,而与鸡的亲缘关系较远。KLF5、KLF6、KLF7均在肺中具有较高的表达水平,而在背最长肌中的表达量较低,且与牦牛IMF含量均没有显著相关性。但KLF5的表达水平与KLF6、KLF7均具有显著的正相关性。这些结果为研究KLF5、KLF6、KLF7的功能提供了基础数据,也为揭示牦牛脂质代谢的调控机制提供了试验参考。     

鹅MyoG基因启动子活性及转录调控元件分析

旨在分析鹅MyoG基因启动子活性区域和转录因子,探究该基因的转录调控机制。本研究首先通过PCR扩增泰州鹅MyoG基因5'侧翼区序列1 245 bp并对其进行测序和生物信息学分析,其次,构建4个不同缺失片段的双荧光素酶报告载体,转染C2C12细胞系。进一步利用在线软件预测核心启动子区关键转录因子,对转录因子结合位点HNF4（-521～-503 bp）、USF （-379～-370 bp）和E2（-296～-281 bp）进行定点突变并构建突变报告基因载体,在C2C12细胞系内初步鉴定MyoG基因核心转录调控因子。最后,采集70日龄泰州鹅胸肌、腿肌、心、肝、脾、肺、肾和下丘脑组织样,利用荧光定量PCR检测MyoG基因和核心转录调控因子的组织表达谱。结果表明,扩增得到的鹅MyoG基因5'侧翼区序列包含启动子元件;利用双荧光素酶报告载体检测到鹅MyoG基因启动子区-624～-154 bp区域存在关键顺式调控元件;结合定点突变技术初步鉴定USF是鹅MyoG基因核心转录调控元件。组织表达谱研究进一步表明,MyoG和USF基因在鹅8个不同组织中均有表达,且在胸肌、腿肌和心组织中共同高表达（P<0.01）。鹅MyoG基因5'侧翼区具有启动子转录活性,-624～＋37 bp是核心启动子区,USF是MyoG核心转录调控因子。试验结果为探究MyoG基因在鹅肌肉发育过程的调控机制提供理论依据。     

牛ATP5B基因启动子与组织差异性表达研究

本研究旨在检测前期构建的牛ATP5B基因启动子双荧光素酶报告基因重组质粒在3T3L-1细胞系中的表达活性,检测ATP5B基因在不同组织中的差异表达情况。经脂质体法转染3T3L-1细胞系后,检测7个重组质粒的荧光素酶相对活性,结合生物信息学软件进一步确认牛ATP5B基因可能的核心启动子;利用试剂盒从秦川牛的16个不同组织提取RNA,反转录后,先检测cDNA,再设计ATP5B基因定量引物和1对β-actin内参引物,进行实时荧光定量反应,最后,结合软件比对不同物种的ATP5B基因近端启动子和氨基酸序列。结果,通过转染细胞和荧光素酶活性分析,统计学分析证实重组质粒pATP5B-462荧光素酶活性最高,软件分析所对应的启动子区域-547~-230bp存在TATA盒、CAAT盒、GATA盒、v-Myb、deltaE这些重要转录调控元件。牛的ATP5B基因组织表达谱结果分析显示,该基因在后腿肌和背最长肌中相对高水平表达,在睾脂、心、瓣胃、皱胃、大肠、小肠、背脂、肾和肝中相对中度表达,在脾、肺、盲肠、瘤胃和网胃中相对微量表达。氨基酸序列比对结果显示,牛ATP5B基因与山羊、绵羊、小鼠、猪和人的ATP5B基因的相似性较高,牛ATP5B基因编码的氨基酸序列与山羊和绵羊的相似性分别高达99%、98%,与人和小鼠的相似性均为96%,与猪的相似性为91%。本研究初步确认了牛ATP5B基因可能的核心启动子,并得到了牛ATP5B基因在16个组织的表达谱结果,软件比对基因序列的结果进一步表明,ATP5B基因是一个较为保守的基因,这为进一步研究牛ATP5B基因的转录调控机制及功能都奠定了基础。     

蛋鸡胱硫醚β合酶基因启动子鉴定与分析

旨在鉴定胱硫醚β合酶(Cystathionine beta synthase,CBS)基因5′调控区和核心启动子特征,为研究蛋鸡骨骼中该基因的表达调控机制提供依据。采集68周龄罗曼蛋鸡胫骨组织,利用酚-氯仿法提取基因组DNA,以UCSC数据库中CBS基因序列为模板设计5′调控区扩增引物,利用生物信息方法分析5′调控区序列特征并进行转录因子结合位点预测,并构建双荧光素酶报告基因重组载体,通过转染DF-1细胞系后检测双荧光素酶活性,进行CBS基因的核心启动子区鉴定。结果表明,蛋鸡CBS基因5′调控区含有潜在的核心启动子区、典型的CpG岛和多个转录因子Sp1结合位点;不同长度片段均具有启动子活性,但不同片段活性存在显著差异,其中F4片段(-155~+131bp)具有最高的转录活性,确定该片段为核心启动子区。蛋鸡CBS基因5′调控区结构特征与核心启动子的鉴定和转录因子结合位点的发现为研究该基因在骨骼中的表达调控机制奠定了基础。     

鸡脂蛋白酯酶基因启动子的克隆及活性分析

本文旨在研究鸡脂蛋白酯酶基因(lipoprotein lipase,LPL)启动子的结构和启动子活性。采用PCR方法扩增了鸡LPL基因5′侧翼区2kb的DNA片段,对其进行克隆、测序及序列分析后,构建了其全长及系列截断突变的报告基因表达载体,瞬时转染鸡胚成纤维细胞(DF-1),用双荧光素酶报告系统测定了荧光素酶活性。生物信息学分析发现,鸡LPL基因启动子区存在Oct-1、GCbox、CCAAT、GATA、AP1等调控元件,在启动子-575～+137bp区域内存在一个CpG岛。报告基因分析表明,鸡LPL基因的启动子-359～+163bp区域就具有启动子活性,启动子-601～+163bp区域具有最强的启动子活性。结果显示,鸡LPL基因受多种转录因子和上游序列的调控,本研究为深入研究鸡LPL基因的表达调控机制奠定了基础。     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3(uncoupling protein 3,UCP3)基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域(-3 580～+920 bp),利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪(P0.05);在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1(-3 171～-2 928 bp)、CpG island2(-154～-2 bp)和CpG island3(+648～+806 bp),其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平(42.61%)高于巴马猪(24.49%)。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点(SP2、PPARγ和EGR1)。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。     

北极狐TYRP1基因启动子活性及转录调控区域分析

通过分析调控北极狐毛色基因TYRP1启动子核心区域及转录因子,为探究该基因的表达调控机制提供理论依据,并为狐狸毛皮品质分子育种和彩色毛皮新材料的创制提供思路。通过基因组测序技术获得了北极狐TYRP1基因启动子序列,并利用生物信息学方法对北极狐TYRP1基因核心启动子区域和转录因子结合位点进行预测;以北极狐基因组DNA为模板,PCR扩增北极狐TYRP1基因不同长度的启动子缺失片段克隆至pGL3-Basic载体,将重组质粒瞬时转染到A375和293T细胞,利用双荧光素酶基因检测仪进行活性验证。结果表明,成功构建了9个含有不同长度启动子片段的重组质粒,经双荧光素酶活性检测发现北极狐TYRP1基因-699/+35区域为核心启动子区域,-699/-93区域存在着TYRP1基因正调控元件。生物信息学预测分析发现该区域存在4个转录因子结合位点;利用重叠延伸PCR技术成功构建了4个突变载体,经双荧光素酶活性检测发现4个突变载体活性均显著下降(P0.05),表明这4个转录因子是北极狐TYRP1基因转录调控的正调控元件。本研究确定了北极狐TYRP1基因启动子核心区域-699/+35,Sp1(-656/-646)、CREB(-598/-589)、Sp1(-539/-530)和Sp1(-163/-154)为北极狐TYRP1基因转录的正调控元件。     

猪速激肽3基因启动子活性及其表达调控的初步研究

为了确定猪速激肽3基因(tachykinin3,TAC3)核心启动子区域,探索作用于该区域的转录因子对TAC3的调控作用,以猪耳组织DNA为模板,PCR扩增TAC3基因5'端不同长度缺失片段,并构建至p GL3-basic载体,转染猪卵巢颗粒细胞,通过双荧光素酶活性分析确定核心启动子区域,染色质免疫共沉淀技术(Ch IP)验证转录因子与基因启动子区的作用,构建转录因子超表达载体和小干扰RNA(siRNA)转染至猪卵巢颗粒细胞,qRT-PCR检测TAC3基因mRNA表达变化。结果显示:成功构建了TAC3基因5'端不同长度缺失片段,通过双荧光素酶报告系统分析发现,-1 310/-544区域为TAC3基因的核心启动子区,-2 486/-1 633区域可能存在负向调控元件,-1 310/-544区域可能存在正向调控元件。Ch IP检测发现转录因子C/EBPβ和YY1分别结合在TAC3基因的-653/-639和-873/-856区域;超表达C/EBPβ和YY1后,TAC3基因启动子活性显著升高(P0.05)、mRNA表达水平显著上调(P0.01);干扰C/EBPβ后,TAC3基因mRNA表达水平显著下调(P0.01);干扰YY1后,TAC3基因启动子活性显著降低(P0.05)。结果表明:转录因子C/EBPβ、YY1结合在TAC3基因的核心启动子区域,促进TAC3基因的转录活性。     

UCP3基因在巴马猪和藏猪脂肪组织中的表达和甲基化分析

为探究解偶联蛋白3（uncoupling protein 3,UCP3）基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的表达和甲基化水平,试验采用实时荧光定量PCR技术检测UCP3基因在巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中的mRNA表达水平;针对猪UCP3基因启动子区域（-3 580~+920 bp）,利用在线软件MethPrimer对该区域进行CpG岛预测,并采用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite sequencing PCR,BSP）检测其甲基化水平,探究UCP3基因甲基化水平在巴马猪和藏猪中的差异。结果显示,巴马猪皮下脂肪组织UCP3基因表达量显著高于藏猪（P<0.05）;在UCP3基因启动子区预测到3个CpG甲基化岛,分别是CpG island1（-3 171~-2 928 bp）、CpG island2（-154~-2 bp）和CpG island3（+648~+806 bp）,其中CpG island1和CpG island3的甲基化水平在巴马猪和藏猪中差异较小,而藏猪CpG island2的甲基化水平（42.61%）高于巴马猪（24.49%）。本研究绘制了2个猪种CpG island2甲基化水平的黑白点图,其中CpG位点为4、8、9、10、11、12、15,藏猪甲基化频率分别比巴马猪高28.26%、17.39%、26.09%、26.09%、26.09%、23.91%和34.78%。在CpG island2处预测到3个转录因子结合位点（SP2、PPARγ和EGR1）。结果表明,巴马猪和藏猪皮下脂肪组织中UCP3基因mRNA水平的表达差异可能是由于CpG island2的甲基化水平不同所导致,藏猪DNA甲基化水平在一定程度上阻碍了转录因子与启动子调控区域的结合,从而抑制了UCP3基因的表达。