中国麻鸭血管紧张素转化酶2(ACE2)的基因克隆及基因结构的序列解析

血管紧张素转化酶2（ACE2）被发现以来,其病理生理功能,特别是作为SARS、COVID-19等冠状病毒侵入细胞的功能性受体,显示了巨大的潜能,明确其在不同物种的基因序列及结构可为冠状病毒感染机制研究提供依据。本研究以中国麻鸭为研究对象,利用RT-PCR和Western blot检测ACE2在中国麻鸭各组织中的表达,然后用PCR技术,扩增出中国麻鸭ACE2基因的完整ORF序列,再TA克隆至pMD-19T载体中进行测序,对所得序列进行生物信息学解析。结果证实,ACE2在中国麻鸭心、肝、肺、肾等组织中均有表达。基因克隆结果显示,该中国麻鸭ACE2基因的CDS序列全长为2 435 bp,编码805个氨基酸残基,与人ACE2核苷酸序列和氨基酸序列同源性分别为66.2%和66.4%,且处在不同进化树分支上。通过对与SARS病毒S蛋白结合有关的18个关键氨基酸残基分析发现,中国麻鸭除第330和353位氨基酸外,其余均与人不相同。结构分析发现,中国麻鸭ACE2为Ⅰ型跨膜蛋白,有多处N-糖基化位点。研究首次获得中国麻鸭ACE2基因的完整ORF序列及相关基础资料,所得序列已上传GenBank并被成功收录,研究结果为开展ACE2在鸭上的功能研究提供了理论依据。     

中国家鹅血管紧张素转化酶2(ACE2)基因的克隆、表达及序列解析

通过对中国家鹅血管紧张素转化酶2(angiotensin converting enzyme 2,ACE2)基因进行克隆、表达、序列信息分析以及对中国家鹅SARS-CoV-2易感性进行分析,旨在为鹅ACE2方面的研究提供基础资料。以中国家鹅为研究对象,检测其不同组织的ACE2基因表达,并扩增出肾组织的ACE2全基因编码区序列。将ACE2目的基因与pMD-19T重组后导入DH5α感受态细胞,随机挑取单菌落进行菌液PCR和酶切验证,并对验证为阳性的单菌落进行测序。对测序所得序列进行生物信息学分析,同时对鹅与人及其他动物ACE2结合SARS-CoV-2的氨基酸序列进行了差异性比较。结果显示,鹅体内有ACE2表达,并在肾脏中有较高的表达水平;扩增出该鹅的ACE2基因ORF序列长度为2 473 bp,编码808个氨基酸,氨基酸序列与中国麻鸭的同源性最高,且处在同一进化分支中;进一步对ACE2编码蛋白质分析显示,该中国家鹅ACE2蛋白有较高亲水性,为Ⅰ型跨膜蛋白,信号肽位于第1～17氨基酸之间;此外,对鹅与人及其他动物ACE2的SARS-CoV-2结合关键氨基酸序列的比较显示,鹅与人等对SARS-...     

白羽肉鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)全基因克隆及序列信息分析

血管紧张素转换酶2(Angiotensin converting enzyme 2,ACE2)作为血管紧张素系统(Renin-Angiotensin System,RAS)的重要一员,对鸡ACE2的研究尚没有开展。本研究以白羽肉鸡为研究对象,从白羽肉鸡空肠组织中扩增出ACE2基因编码区的特异性片段,TA克隆到pMD-19T载体并转到大肠杆菌DH5α感受态细胞,对生长出的单菌落进行蓝白斑筛选、菌液PCR、酶切验证后测序,对所得序列进行了生物信息学分析。结果:本研究明确了ACE2在白羽肉鸡体内有存在,分布表达有组织特异性,在消化系统及肾脏有较高表达。并且首次成功克隆了白羽肉鸡ACE2全基因序列,共包括2,444个核苷酸,编码808个氨基酸残基,同源性及遗传进化结果一致。该基因编码ACE2蛋白属不稳定、亲水性蛋白,蛋白信号肽序列位于第1-17aa之间,蛋白跨膜螺旋预测为I型跨膜蛋白。研究所得序列已上传GenBank(基因序列号为MK560199),为ACE2在肉鸡及禽类方面的研究提供了基础资料。     

血管紧张素转化酶2(ACE2)在保育猪肠道增生性炎症中的作用

选取49日龄慢性腹泻保育猪为试验对象,测定其血液中葡萄糖(GLU)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLB)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(ALP)、乳酸脱氢酶(LDH)、甘油三酯(TG)等生化指标;制作病理组织切片,观察胃、十二指肠、空肠、回肠、结肠等组织病理变化;检测保育猪十二指肠、回肠组织中ACE2、Mas受体mRNA的表达及AngⅡ、Ang1-7的含量;比较分析十二指肠、回肠组织中炎症相关因子TNF-α、IL-1β、IL-10 mRNA的表达变化。结果显示,腹泻猪血液中GLB、AST含量显著上调(P0.05),GLU、TG和ALP显著下调(P0.05);病理学观察发现,腹泻猪胃组织上皮损伤脱落;十二指肠肠粘膜脱落、肠腺细胞大量增生、肠隐窝增厚;空肠肠绒毛坏死,黏膜上皮细胞坏死脱落,肠腺上皮细胞增生;回肠、结肠肠腺细胞均明显增生;腹泻组与对照组猪相比,十二指肠中RAS系统相关成员ACE2、Mas受体mRNA表达显著下调(P0.05),Ang1-7含量显著下降(P0.05),但AngⅡ的含量显著升高(P0.05),并且其炎症相关因子TNF-α、IL-1βmRNA表达也显著上调(P0.05,P0.01),IL-10无显著变化。结果表明,腹泻猪表现明显增生性炎症,在此情况下,高水平的AngⅡ的促炎作用处于优势,ACE2及其介导的ACE2-Ang1-7-MAS受体轴的抗炎作用处于劣势。     

雪山草鸡血管紧张素转换酶2(ACE2)基因克隆、结构特性分析及其表达特征研究

旨在克隆血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2,ACE2）基因,分析其结构特性和表达特征。本试验以45和90日龄的健康雪山草鸡为研究对象,利用PCR技术扩增ACE2基因的编码区序列;运用生物信息学方法对其结构特征进行分析;通过TA克隆构建黄羽肉鸡ACE2编码区序列质粒标准品,使用绝对定量方法测定ACE2基因在45和90日龄雪山草鸡公母鸡各组织中的表达特性。结果,克隆得到2 427 bp的编码区序列,共编码808个氨基酸,与白羽肉鸡一致,但是在黄羽肉鸡序列中存在大量突变位点造成编码氨基酸发生变化。同源性比较发现,其与红色原鸡的同源性为99%,其次为绿头鸭88%,与其它动物的同源性为73%~76%。生物信息学分析发现,ACE2属于I型跨膜蛋白,即分泌型蛋白,信号肽位于1~17 aa,含有46个蛋白质磷酸化位点。定量结果发现,小肠中ACE2表达量显著高于其它组织。法氏囊、气管、胆囊和脾中ACE2表达量较低,脾中表达量最低。母鸡空肠、盲肠、脾和肺中ACE2基因表达量显著高于公鸡。公鸡肾和心中ACE2基因表达量显著高于母鸡。90日龄雪山草鸡的十二指肠、空肠、肺、脾和回肠组织ACE2基因表达量均显著低于45日龄雪山草鸡,在法氏囊和肾组织中结果呈相反趋势。通过克隆获得了雪山草鸡ACE2基因编码区序列,生物信息学分析发现,雪山草鸡ACE2基因在家禽中较为保守;ACE2基因表达规律呈现出在雪山草鸡肠道组织中高于其他组织,母鸡中高于公鸡,随着时间表达水平呈下降趋势。研究结果为开展ACE2基因在黄羽肉鸡肠道中的功能研究奠定了理论基础。     

血管紧张素转化酶2在冠状病毒感染及肺损伤中的作用研究进展

血管紧张素转换酶2(ACE2)作为肾素-血管紧张素系统(RAS)的关键酶,与肺损伤疾病的发生发展密切相关,其可通过催化Ang Ⅱ为Ang1-7,而Ang1-7则通过Mas受体发挥舒血管、抗炎、抗纤维化等抗Ang Ⅱ的作用,抑制肺损伤.另一方面,近年来,COVID-19在全球各地传播,造成极大的社会危害,ACE2作为SA...     

血管紧张素转化酶2激动剂对动脉粥样硬化肝脏作用的研究

为了研究血管紧张素转化酶2(ACE2)在动脉粥样硬化模型的小鼠中发挥的作用,试验采用8~10周龄APOE基因敲除小鼠,分为普通饮食对照组、高脂饮食模型组、阳性药物对照组(卡托普利给药组)及ACE2激动剂组[血管紧张素转化酶2(ACE2)激动剂重氮氨苯脒乙酰甘氨酸盐(DIZE)给药组],皮下注射给药12周后处死,观察小鼠的肝脏病理学特征,并检测相应血清指标。结果表明:高脂饮食模型组三酰甘油(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白(LDL)比普通饮食对照组显著升高,高密度脂蛋白(HDL)降低,且肝组织脂肪变;而给予卡托普利和DIZE的药物组后都相应降低了TG、TC、LDL含量,提高了HDL含量,并且能够很大程度地减轻肝组织的脂肪病变程度。说明动脉粥样硬化发生的进程中,血脂升高,肝脏也发生了相应病变。而ACE2激动剂DIZE和血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利一样,可以降低血脂,改善局部的肝脏病变。     

血管紧张素转化酶性质及胶原蛋白对其活性抑制效果的研究

血管紧张素转化酶(Angiotensin Converting Enzyme,ACE)与人和动物血压调节密切相关,为高血压疾病的药物靶标,筛选ACE抑制剂可为研制新型高血压疾病预防药物提供可靠的先导化合物。试验从猪肺中提取ACE,首先对其酶学性质进行了试验分析,继而考察了三个不同商品化的胶原蛋白肽对ACE抑制活性的影响。采用分光光度法,以马尿酰-组氨酸-亮氨酸(Hip-His-Leu,HHL)为底物测定血管紧张素转化酶的活力。结果表明:血管紧张素转化酶的最适pH为8.0;最适温度为40℃;350mmol/L氯离子存在的情况下,能够明显提高ACE的活性;金属离子对酶活的影响表现出促进或抑制的作用。通过比较,在低温条件下提取的自制胶原蛋白肽的ACE抑制活性要高于另外两种商品化胶原蛋白肽产品。     

贵州白山羊脂联素基因(ADIPOQ)序列和表达分析

为了探讨贵州白山羊脂联素基因序列变异和在不同组织中的表达分析,本研究采用PCR直接测序技术检测ADIPOQ基因部分序列的遗传多态性,通过RT-qPCR技术检测ADIPOQ基因编码mRNA在不同组织中的表达情况,同时基于遗传距离NJ法进行系统聚类分析,明确了贵州白山羊与不同物种间的遗传进化关系,结果表明,贵州白山羊与绵羊ADIPOQ基因序列间存在8个核苷酸变异,聚类结果表明贵州白山羊与其它物种间的遗传距离符合生物学进化,实时荧光定量PCR检测表明,ADIPOQ基因在所检测的贵州白山羊各组织中均有表达,其中在肺的表达量最高,其次是脾、心和肝,而在肾中的表达量较低。本研究通过ADIPOQ基因的序列和表达分析,进一步增进了对贵州白山羊的遗传多样性和发育情况的了解,对贵州白山羊的合理利用提供了参考数据。     

血管紧张素转化酶2对Ang Ⅱ诱导的牛乳腺上皮细胞炎症损伤的缓解作用

以不同浓度血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导牛乳腺上皮细胞(MAC-T)炎症损伤,探讨血管紧张素转化酶2(ACE 2)的变化及与AngⅡ的相互作用。研究包括:ELISA检测细胞上清中细胞炎性因子的分泌或释放;Western blot检测细胞ACE 2和ACE的蛋白表达变化,并进行相关性分析;添加ACE 2活性蛋白对AngⅡ诱导损伤的保护作用。结果显示:1)AngⅡ处理MAC-T,细胞上清中促炎因子TNF-α、IL-6、IL-8含量显著(P0.05)或极显著(P0.01)增加,抗炎因子IL-10含量显著降低(P0.05);2)不同浓度AngⅡ处理细胞后,ACE 2蛋白表达均有降低,10~(-6) mol·L~(-1) AngⅡ处理后显著降低(P0.05);ACE蛋白表达结果相反;ACE 2与AngⅡ浓度之间存在显著负相关;3)添加外源性ACE 2活性蛋白,细胞上清中TNF-α、IL-6和IL-8浓度均有一定程度的下降,IL-10浓度升高。本研究表明ACE 2/ACE轴的失衡是AngⅡ诱导细胞炎性损伤的主要原因。高水平AngⅡ可激活炎症因子促进炎症反应,是促进炎症反应的主要介质,ACE 2可以通过降解AngⅡ,抑制其对炎症反应的上调效应。     

猪链球菌2型溶血素基因的检测及其序列分析

根据猪链球菌2型的溶血素基因合成了一对可扩增长度为1496bP目的片段的引物，建立了检测溶血素基因的PCR方法。该方法对猪链球菌2型参考株SS2—N株的检测结果为阳性，对马链球菌善疫亚种(C群)参考株ATCC35246、分离株SESZ—Y、SESZ—T、SESZ—C和猪葡萄球菌、大肠埃希氏茵的检到结果均为阴性；用EcoR I内切酶进行酶切．获得了与预期结果一致的863bP和633bP的2个片段。经对SS2—1株的PCR产物进行测序及序列分析，表明其与1933株、P1／7株的核苷酸同源性分别为99．7％和100％。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因检测及序列分析

根据猪链球菌2型（Streptococcus suis type 2）溶血素基因（sly）设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物，对HA9801等6株猪链球菌2型江苏分离株，1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC35246的核酸进行PCR扩增，结果显示HA9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性．ATCC35246呈阴性。HA9801株PCR产物纯化后测序．序列分析表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99％。     

猪链球菌2型江苏分离株溶血素基因的检测及序列分析

根据猪链球菌2型(strep tococcus su is type 2)溶血素基因(sly)设计和合成了一对可扩增其完整阅读框的引物,对HA 9801等6株猪链球菌2型江苏分离株、1株德国分离株SS2-D及猪链球菌C群参考株ATCC 35246的核酸进行PCR扩增,结果显示HA 9801等6株江苏分离株及德国株SS2呈阳性,ATCC 35246呈阴性。HA 9801株PCR产物纯化后测序,序列分析结果表明该DNA片段与猪链球菌2型1933株的sly基因同源性为99%。     

野桑蚕肌球蛋白轻链2基因(MLC2)的克隆和序列分析

利用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)和cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆了野桑蚕间接飞行肌(in-direct flight muscle,IFM)的肌球蛋白轻链2(myosin light chain2,MLC2)基因(GenBank登录号:EU332913),其cDNA序列全长979 bp,包括63 bp的5′端非翻译区序列(5′-UTR)、603 bp的开放读码框(ORF)、终止密码子TAA和310bp的3′端非翻译区序列(3′-UTR)。克隆该基因的内含子序列并分析基因结构表明,该基因包括3个外显子和2个内含子,编码201个氨基酸,预测蛋白质分子质量约22.0 kD,等电点4.67。用在线软件SMART分析显示,野桑蚕MLC2蛋白有2个Ca2+结合基序(EFh)结构域,可以结合Ca2+,属于肌钙蛋白C超家族成员,并且含有保守的可以磷酸化的氨基酸残基,有可能具有磷酸化过程,参与肌动球蛋白ATPase活性的调节。     

断奶仔猪ACE2基因的克隆及遗传进化分析

采用RT-PCR扩增和基因克隆技术鉴定断奶仔猪血管紧张素转化酶2(ACE2)基因序列,并与公布的猪以及其他物种的ACE2基因进行同源性比对.结果,成功克隆出了仔猪ACE2部分序列,该核苷酸序列与GenBank上公布的野猪ACE2核苷酸序列同源性达到98％,与欧洲牛的同源性为87.8％,与人的同源性为78.8％,与禽类(鸡)的同源性较低.遗传进化分析发现该扩增片段与牛的遗传距离最近,与鸡则处在完全不同的2个分枝上.氨基酸进化与基因遗传进化结果一致.本研究为仔猪ACE2的有效表达、生物学活性及其在苏姜猪中作用的研究奠定基础.     

流感病毒(H9N2)地方株NA基因的克隆及序列分析

禽流感 (Avian Influenza,AI)是由 A型流感病毒引起各种家禽及野生禽类感染或发生疫病综合征的传染性疾病 [1] 。该病自 1878年首次报道以来已有10 0多年的历史 ,目前已流行于世界上许多国家和地区 ,给养禽业造成了巨大的经济损失 [2～ 3 ]。禽流感病毒 (AIV)囊膜镶嵌的两种纤突—血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA) ,与病毒的毒力、传播关系密切 [4] 。 NA是 AIV表面仅次于 HA的一种重要抗原 ,具有唾液酸酶的活性 ,可以在病毒感染靶细胞时 ,识别细胞表面流感病毒受体末端的唾液酸残基 ,使病毒能够进入细胞 ;NA的另一个功能是为要出芽的…     

猪瘟病毒国内分离株(HL-LY)E2基因的克隆及序列分析

用猪肾细胞（pK-15)繁殖猪瘟病毒（CSFV）分离株HL－LY，根据基因库已发表的CSFV E2基因序列，设计并合成一对引物，以CSFV总RNA为模板，通过RT－PCR技术扩增出约1.1kb的片段，即E2基因。将RT－PCR产物克隆到pMD18-T载体上，构建了重组质粒T－E2，经酶切、PCR鉴定和序列测定，表明均已成功获得了CSFV E2基因的重组体T－E2。将该测序结果与国内几个毒株SHIMEN，C，C－V－LZ,GS-LT,GS-LX德育了列同源性比较，核苷酸同源性分别为96.59%,96.005,88.495,78.24%,77.82%；氨基酸同源性分别为99.46%,98.39%,93.54%,90.70%,90.44%。表明该毒株与国内标准毒株SHIMEN株和C株具有较高的同源性。     

家蚕淀粉酶基因(Bmamy2)的分子克隆及表达特征和序列分析

淀粉酶在生物体内的碳水化合物代谢中起重要作用。根据预测的基因序列设计引物,克隆了一个家蚕淀粉酶基因(Bmamy2),获得完整的编码区序列(全长1 752 bp,编码583个aa)。用推导的氨基酸序列与其它物种的淀粉酶基因作相似性比较和系统发育分析,发现所克隆的Bmamy2基因是一个起源很早的拷贝,在细菌、果蝇、非洲蟾蜍、人和鸡等多种生物中存在与之同源的基因。该基因编码蛋白的功能结构域预测有2个起催化作用的关键氨基酸发生突变,推测该基因可能失去了催化水解碳水化合物的功能。RT-PCR和基因芯片检测结果表明,该基因在家蚕5龄第3天幼虫的中肠和脂肪体中表达,且在中肠中的表达丰度较高。     

二脒那秦内源性激活血管紧张素转化酶2对细胞脂质沉积的抑制效应及其机制

旨在通过诱导3T3-L1前脂肪细胞转分化为3T3-L1脂肪细胞,探讨二脒那秦（DIZE）内源性激活血管紧张素转化酶2（ACE 2）对细胞脂质沉积的抑制效应及机制。对3T3-L1前脂肪细胞转分化,将分化成功的3T3-L1脂肪细胞分为对照组、DIZE组（12.5、25 μmol·L^-1处理）,siACE2组和siACE2+DIZE组（siACE2干扰后+25 μmol·L^-1 DIZE）,作用48 h,取上清和细胞进行试验：1）测定细胞上清中三酰甘油和葡萄糖含量;2）油红O染色细胞,并进行定量分析;3） Western blot检测细胞内ACE2和脂肪酸合成关键酶或因子FAS、ACC和SREBP-1c及葡萄糖转运蛋白GLUT4与氧化分解关键酶CS的蛋白表达水平。结果显示：1）成功诱导得到了3T3-L1脂肪细胞,前脂肪细胞诱导至第14天,有95%以上细胞内出现脂滴;2）确定了DIZE作用浓度为12.5和25 μmol·L^-1,处理时间为48 h,并用该药物浓度及时间处理3T3-L1脂肪细胞,细胞上清中三酰甘油含量显著降低（P<0.05）,葡萄糖含量显著升高（P<0.05）;25 μmol·L^-1 DIZE处理组细胞脂滴减少,siACE2组无显著变化,siACE2+DIZE组脂滴蓄积介于对照组和DIZE组之间; 25 μmol·L^-1 DIZE组ACE2蛋白水平显著高于对照组（P<0.05）;siACE2组显著下调（P<0.05）,siACE2+DIZE组较siACE2组无明显变化;3）与对照组相比25 μmol·L^-1 DIZE组细胞中FAS、ACC和SREBP-1c蛋白表达下调,siACE2组和siACE2+DIZE组则表达均上调;4）与对照组相比,25 μmol·L^-1 DIZE组GLUT4和CS蛋白表达水平显著上调（P<0.05）,siACE2组和siACE2+DIZE组则均显著下调（P<0.05）。综上所述,DIZE处理通过介导脂肪细胞ACE2的内源性激活改善了脂肪细胞的脂肪沉积。其机理：一方面抑制脂质合成;另一方面促进葡萄糖摄取和氧化代谢,两方面协同减少了脂肪沉积。结果提示,ACE2或DIZE可作为防控脂肪沉积发生和发展的潜在靶点或药物。     

猪链球菌血清2型JX02株溶血素基因的克隆及序列分析

采用特异性引物对猪链球菌2型(Streptococus suis type 2)JX02菌株进行PCR扩增，将扩增到的溶血素基因克隆到pMDl8-T质粒栽体中，经鉴定后测序。结果显示，扩增的JX02株溶血素基因长度为1494bp，与P1／7株和US-1933株等进行序列比较，核苷酸同源性为100％和99．7％，氨基酸序列同源性为100％和99．8％。