线虫扫描电镜 5.三种毛首线虫

本文对采自上海绵羊和猪的球毛首线虫和猪毛首线虫,以及扬州尸检的人毛首线虫进行扫描电镜观察。对口孔、角质矛、横纹、生殖孔、肛孔、交合刺鞘和刺、以及交合剌等超微结构作了描述。讨论了口孔、角质矛、吸盘样构造和交合刺鞘刺等结构。     

毛刺线虫（Nematoda：Trichodoridae）的调查鉴定

在江苏、安徽和湖南的(22份)毛刺线虫(T_(1-22))土样中,T_(14)样本的雌虫以及T_6、T_7中的少数雌虫鉴定为 Paratrichodorus porosus。T_(21)的毛刺线虫采自江苏南京桃根周围,定为 Trichodorus nanjingensis n.sp.。T.nanjingensis n.sp.与 T.complexus、T.borneoensis 最相似,它们都有2枚前于排泄孔的腹颈乳突、3枚生殖乳突和细纹化的交合刺,但新种的交合刺形态和仅1枚生殖乳突在交合刺区分别与后二者不同。新种阴道骨化结构的形态和没有明显分化的受精囊,也都有别于 T.complexus 和 T.borneoensis。     

伞滑刃属线虫智能识别方法研究

利用计算机图像处理技术对植物伞滑刃属线虫的交合刺进行识别.通过计算交合刺图像之间的距离来判断线虫的种类,程序运行快速,识别结果准确度高,基本实现了植物线虫识别的智能化.     

马来西亚贝壳杉中一种伞滑刃线虫的鉴定

    宁波出入境检验检疫局植检实验室在对1批出境的船舶铺垫材料检测时,截获一种伞滑刃属线虫,进行了形态学观察、测量,以及分子鉴定.该线虫属松材线虫组,交合刺较大,长约35～43 μm,明显大于松材线虫B. xylophilus、拟松材线虫B. mucronatus、锥尾伞滑刃线虫B. conicaudatus、伪伞滑刃线虫B. fraudulentus和B. luxuriosae等近似种的交合刺, 与豆伞滑刃线虫B. doui交合刺34～43 μm接近,但该线虫雌虫腹面末端有缺刻,而豆伞滑刃线虫的雌虫靠腹面末端有2～4 μm的尾尖突.该线虫ITS-RFLP图谱与新加坡伞滑刃线虫一致,但交合刺比新加坡伞滑刃线虫交合刺41～48 μm略小,且其雌虫和雄虫的尾均略长,雌虫尾末端多数有缺刻,而新加坡伞滑刃线虫尾末端钝圆,有短尾尖突.该批铺垫材料来自马来西亚,这是马来西亚除莱奴尔夫伞滑刃线虫外发现的第二种伞滑刃线虫.     

斯氏付柔线虫在光镜和扫描电镜下的形态特征

本文对斯氏付柔线虫(Parabronema skrjabini)在光学显微镜和扫描电子显微镜下的形态特征进行了较为详细的描述和比较,並给出了其中某些构造的扫描电镜照片。观察结果表明:斯氏付柔线虫头端是由二对不同的结构物所围成的,其后面各连接着六个小片形附属物。在二个侧唇上各有一呈藕状断面的侧器。雄虫尾部所有的乳突皆未有伸出体表的所谓“柄”。粗交合刺上有浅沟,细交合刺顺此沟伸出。交合刺由外缘部和核心部所构成。在文章中,作者对某些观察结果进行了分析、探讨。     

昆虫线虫一新种——如皋似双胃线虫的鉴定

[目的]从江苏如皋水稻田土样中分离到昆虫线虫一新株系N3(简称虫株N3),通过形态学和分子生物学特征对其进行了鉴定。[方法]利用光学显微镜和扫描电镜观察线虫的形态特征,对其形态特征进行测计并构建基于18S r DNA序列的系统发育树等,对虫株N3进行了系统分类鉴定。[结果]虫株N3主要形态特征是:食道基球退化;交合刺整体弧形弯曲,基部愈合弯曲;引带近腹部端,附着于交合刺基部;生殖乳突P3近泄殖腔,P2、P4远泄殖腔;双子宫。18S r DNA分子系统树表明:虫株N3与Diplogasteroides nasuensis最为相近,具有93.2%的同源性。虫株N3可以根据食道基球与交合刺基部的形态和引带附着位置加以区分。[结论]结合形态学和分子生物学特征鉴定,虫株N3为新种,命名为如皋似双胃线虫(Diplogasteroides rugaoensis n.sp.)。     

首尾线虫属一新种记述(线虫纲:异尖线虫亚科)

本文记述了来于西藏高寒山区田鼠大肠内首尾寄生线虫属一新种,定名为西藏首尾线虫。本新种在同属中异于原有种的特征在于:a.泄殖孔前缺纵行肛前栉;b.泄殖孔前缘仅2对乳突,呈上下重叠、左右对称的排序;c.交合刺长于有记载虫种的1倍以上(0.19～0.21:0.005:0.089);d.雌虫体长(14.26～14.35)长于C.andrejevi雌虫体长(8.22～9.55)。     

绵羊毛首线虫(Trichocephalus)一新种

本文描述了一种从阿拉善右旗绵羊体内采取得的毛首线虫。因其形态构造与已有各种毛首线虫显著不同,因将该虫命名为武威毛首线虫、新种(Trichocephalus wu-weiensis nov.sp.)。这种线虫的主要诊断特征是雄虫交合刺鞘分有刺和无刺两部分,长度几乎相等或无刺部分略长于有刺部分;雌虫阴门突出,上具细刺、阴道后面无明显的膨大部。文内对本种与相近似种进行了讨论。     

甘肃省黄牛古巴线虫的研究包括一新种的描述

本文描述了从甘肃临夏囘族自治州临夏市,康乐县及和政县的17头黄牛小肠内所采集的四种古巴线虫Cooperia,其中一种是新种,一种尚未定名。计: 1.Cooperia oncophora(Railliet,897) 2.Cooperia spatulata(Linstow,1906) 3.甘肃古巴线虫(新种)Cooperia kansuensis nov.sp. 4.Cooperia sp. 甘肃古巴线虫与Cooperia zurnabada线虫有些相似,下列主要特点可将它们区别开来:(1)Cooperia zurnabada与本种间雄虫交合刺方面有明显的区别:1)前者交合刺外分枝远端斜切,形成鞋状膨大物,其上复盖角质层,后者交合刺外分枝远端尖细,其周围并具有透明膜;2)前者交合刺内分枝宽短,长为0.0260毫米,后者交合刺内分枝细长,长为0.0590毫米;3)前者内分枝与外分枝明显分开,并有一定的距离,后者内分枝与外分枝不分开,往往只能看到一裂縫。(2)C.zurnabada外背肋从背肋主干近端若干距离处发出,而本种外背肋从背肋基部独立发出。(3)C.zurnabada背肋侧小分枝远端不弯向腹面,较短,而本种背肋側小分枝远端明显弯向腹面,卷曲呈一圆球状,较长,其长度相当于背肋分枝长度的1/2。(4)两者雄虫生殖圆锥显然不同,各有其独特的形状。甘肃古巴线虫又与C.mcmasteri亦有些相似,而C.mcmasteri与本种线虫有下列区别:(1)前者交合刺外分枝远端以小的圆锥形膨大而结束,后者交合刺远端尖细,其周围并具有透明膜,前者内分枝较后者内分枝短。(2)C.mcmasteri背肋基干较短,背肋侧小分枝很短,远端不明显弯向腹面,而本种背肋基干较长,背肋侧小分枝很长,相当于背肋分枝长度的1/2,并且卷曲呈一圓球状,有时仅侧小分枝远端卷曲呈棍棒状。(3)两者雄虫生殖圆锥显然不同,各有其独特的形状。     

杉木半穿刺线虫病的研究 〔Ⅰ〕病原线虫鉴定

杉木(Cunninghamia lanceolata)根部,首次发现半穿刺线虫寄生,经柯赫法则(Koch's postulates)验证,病原线虫是(Tylenchluus semipenetrans Cobb)。雄成虫线形,长度为367.2(303—390)um,吻针和食道极度退化,单精巢,交合刺长15um,具引带,无交合繖,排泄孔位于虫体中部或稍后(PE=60％),雄成虫少见。雌成虫单个或成群寄生根上,虫体前端约占体长(40—50％)伸入根部周皮层内,露出根外的虫体逐渐膨大成囊状或袋状,虫体长390.3(334—449)um,排泄孔位于阴门稍前(PE=80—90％)。孔口能分泌出小液滴,阴门位于虫体90％处,无肛门,尾端短且直伸向腹面,单卵巢,折叠卷曲,雌成虫行孤雌生殖。     

捻转血矛线虫DNA疫苗的构建及山羊免疫保护性试验

 【目的】构建捻转血矛线虫DNA疫苗，并研究该疫苗对山羊的免疫保护效果。【方法】将捻转血矛线虫重要保护性抗原H11的编码基因分H11-1、H11-2和H11-3三部分，分别亚克隆到基因疫苗载体pcDNA4/His Max C中，用酶切反应、序列测定等方法鉴定重组疫苗。将纯化的DNA疫苗肌肉注射山羊后，用RT-PCR、Western blotting和ELISA方法检测疫苗在山羊体内的转录、翻译和诱导IgG的产生。第2次免疫后2W用10 000条捻转血矛线虫第3期幼虫攻击实验动物，检测山羊虫卵排出、虫卵孵化率、成虫数量等免疫保护性指标。【结果】获得了捻转血矛线虫H11 DNA疫苗，疫苗第1次免疫7d后在山羊肌肉组织中进行了转录，第2次免疫7 d后，DNA疫苗获得了翻译，并诱导机体产生了相应的抗体。与对照组比较，试验组山羊排出虫卵减少58.8%、虫卵孵化率减少75.3%、成虫减少68.2%。【结论】构建了捻转血矛线虫H11 DNA疫苗，该DNA疫苗对山羊具有较好的免疫保护效果。     

多重PCR检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性等位基因

 利用GenBank发表的捻转血矛线虫β微管蛋白基因组DNA序列设计2对引物,建立检测捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的多重PCR方法,利用该方法检测我国不同地区捻转血矛线虫对苯并咪唑类药物的抗性,并用生物学检测验证。结果表明,建立的多重PCR方法在抗性检测上具有很强的特异性,澳大利亚抗性虫株只有F1和F3条带,上海敏感虫株只有F2和F3片段;序列分析证实抗性虫株编码β微管蛋白第200位氨基酸的密码子为TAC,敏感虫株为TTC。并且该法具有很高的灵敏性,检测基因组DNA的最低量为50 ng。生物学检测,澳大利亚抗性虫株丙硫苯咪唑LD50达0.54 ?g·ml-1,上海敏感虫株的LD50为0.0023 μg·ml-1,与多重PCR结果相符,说明多重PCR可以用于捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性的检测。利用该技术检测源于新疆石河子、伊宁,安徽五河,江苏南京、徐州等地的虫株发现,这些地理株均表现为敏感型,丙硫苯咪唑LD50在0.0023～0.0032 ?g·ml-1之间,提示我国捻转血矛线虫苯并咪唑类药物抗性尚不严重。     

Multiplex PCR Detection of Alleles Responsible for Benzimidazole-Susceptibility or-Resistance in Natural Populations of Haemonchus contortus

A multiplex PCR was developed to detect benzimidazole-resistance (BZ-R) or -susceptibility (BZ-S) in Haemonchus contortus by amplification with 4 primers of a sequence of the GRU-1 gene of β-tubulin of H. contortus making use of sequence information available in Genbank. The method was based on two allele-non-specific primers and two allelespecific primers. Fl (264 bp) and F3 (799 bp) should be produced in BZ-R, F2 (585 bp) and F3 in BZ-S. With this method,we demonstrated that H. contortus BZ-R strain from Australia showed Fl and F3, and the worm BZ-S strain from Shanghai did F2 and F3. Sequence analysis of the isotype 1 gene of β-tubulin of BZ-R from Australia and BZ-S from Shanghai showed the code in residue 200 of the gene was respectively TAC and TTC. The LD50 of albendazole of the Australian BZR strain was 0.54 μg mL-1, the Shanghai BZ-S strain was only 0.0023 μg mL-1 by EHA (egg hatch assay). The multiplex PCR could determinate the genotype of single adult worm or several third stage larvae and was performed on at least 50 ng of genomic DNA. BZ-R H. contortus were not detected in Shihezi and Yining of the Xinjiang, Wuhe of the Anhui Province,Nanjing and Xuzhou of the Jiangsu Province. The LD50 of the H. contortus from these locations to albendazole as determined by EHA varied between 0.0023-0.0032 μg mL-1. The result indicated that the multiplex PCR could be used to differentiate BZ-R and BZ-S of H. contortus and that the BZ-R situation of H. contortus was not serious in China.     

捻转血矛线虫HLJ株H11基因克隆及部分胞外域表达

根据GenBank上发表的捻转血矛线虫核苷酸序列设计引物,采用RT-PCR方法克隆捻转血矛线虫HLJ株H11基因。结果表明,H11ORF核苷酸长为2 919 bp,编码972个氨基酸残基。经分析,捻转血矛线虫HLJ株H11与X94187、AY247714、AY819650同源性分别为99.14%、98.49%和99.59%;H11基因含有4个糖基化位点和1个Zn结合功能域;4个糖基化位点分别位于99~102 aa、227~230 aa、549~552 aa和858~861 aa处;Zn结合功能域位于376~385 aa处。参照捻转血矛线虫HLJ株H11序列设计引物,扩增H11ORF 451~2 919 bp一段胞外域序列,构建包含3个糖基化位点和1个Zn结合功能域pGEX-6P-1-H11原核表达质粒,在大肠杆菌表达菌Rosetta(DE3)中进行表达。SDS-PAGE结果表示,融合蛋白分子质量约为118 ku,以包涵体形式存在。免疫印迹实验未出现目的条带,说明H11确是一种隐蔽抗原。     

金沙江干热河谷扭黄茅花粉微形态及活力研究

[目的]为丰富抗旱耐热的育种材料来源提供依据。[方法]对来自金沙江干热河谷不同地区的扭黄茅花粉形态进行了电镜扫描观察,并采用碘-碘化钾(I-KI)染色法进行活力测定。[结果]扭黄茅花粉粒为中等大小花粉粒,花粉形态为近球型,花粉壁纹饰为粗糙型,萌发孔为单一萌发孔,萌发孔有孔环,表明扭黄茅具有进化性状,但是进化程度较低,仍属于原始状态,与扭黄茅为野生状态相一致。金沙江沿岸永胜、攀枝花、元谋扭黄茅的花粉活力为80.00%～87.10%,差异不显著(P0.05)。永胜地区扭黄茅花粉活力为82.19%～87.00%,不同扭黄茅材料间的花粉活力差异也不显著(P0.05)。[结论]金沙江沿岸各地区的扭黄茅花粉形态与结构基本一致,表明其是一个自然类群。     

捻转血矛线虫Hc-daf-22基因的原核表达及重组蛋白酶活性测定

【目的】捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)是反刍动物主要的胃肠道线虫之一,该病在中国呈全国性流行。为研究捻转血矛线虫(Haemonchus contortus)脂肪酸代谢相关蛋白DAF-22的生化特性,对其基因进行了克隆、原核表达,并对重组蛋白进行了体外酶活性测定。以期了解捻转血矛线虫Hc-DAF-22蛋白在过氧化物酶体脂肪酸β氧化中的作用。【方法】根据NCBI公布的H.contortus ZJ株daf-22 cDNA序列(Gen Bank:HQ738470.1)设计特异性引物,克隆Hc-daf-22基因并构建重组质粒pET-22b-Hc-daf-22,经测序鉴定正确后将其转化E.coli BL21,经终浓度为0.1 m mol·L~(-1) IPTG(isopropyl-β-d-thiogalactoside)诱导表达4h,离心菌液,50 mmol·L~(-1)浓度的PBS溶液重悬菌体溶液,冰浴超声破碎后上清沉淀分别进行SDS-PAGE分析。超声破碎后产物以镍柱亲和色谱法分离纯化重组蛋白Hc-DAF-22,并用SDS-PAGE检测蛋白纯化情况及以抗His血清作为一抗Western Blot鉴定。纯化后蛋白用超滤管浓缩除去盐分,并按照蛋白浓度测定试剂盒进行蛋白浓度测定。利用天然状态下的乙酰乙酰CoA(AcAc-CoA)分子会发生酮-烯醇互变形成烯醇化合物特性,酶活试验以乙酰乙酰辅酶a为底物建立标准曲线。硫解酶体外测活体系为(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1) MgCl_2,60μmol·L~(-1)CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白),通过记录反应过程中由于底物(AcAc-CoA)的减少而引起303 nm波长下的吸收值的变化,从而计算出硫解反应的初始反应速率,最终确定复性后的Hc-DAF-22的硫解酶活性。在相同条件下,取AcAc-CoA底物浓度为10μmol·L~(-1)的反应体系(50 mmol·L~(-1) Tris-Cl pH 8.1,20 mmol·L~(-1)MgCl_2,60μmol·L~(-1) CoA,10μmol·L~(-1) AcAc-CoA,加入约0.1μg蛋白于室温起始反应),分别调节反应体系的温度及pH梯度,确定Hc-DAF-22最佳酶活反应温度及pH条件。【结果】成功克隆Hc-daf-22基因,测序结果与NCBI已公布的H.contortus ZJ株Hc-daf-22基因序列比对基因相似度为99.9%,并实现重组子pET-22b-Hc-daf-22在E.coli BL21体内进行表达,表达产物经SDS-PAGE和Western Blot检测显示,pET-22b-Hc-daf-22基因在大肠杆菌中成功表达,呈部分可溶性,融合蛋白的分子量约为59 k D,测得蛋白浓度为1.70μg·μL~(-1);针对该表达产物的酶活分析结果表明,原核表达的Hc-DAF-22具有一定的硫解酶活性,其最适反应pH为8.0,最佳反应温度为37℃,酶学常数Km值和Vmax值分别为33.765μmol·L~(-1)和1 784 nmol·L~(-1)·min~(-1)。【结论】捻转血矛线虫DAF-22是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的关键酶之一,本试验通过体外酶活试验成功测定Hc-DAF-22蛋白的酶活性,证明Hc-DAF-22具有一定硫解酶活性,但与秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)同源蛋白相比硫解酶活性较低。     

捻转血矛线虫Hc38重组蛋白的表达纯化及抗原性鉴定

[目的]通过表达和纯化捻转血矛线虫新功能基因He38最大开放阅读框ORF1,确定完整的Hc38蛋白天然表达形式、分子量大小和免疫学活性鉴定,为研究该基因功能和基因工程应用奠定基础.[方法]参照本实验室在GenBank上登录的捻转血矛线虫ZJ株的He38基因序列(AY594263)设计引物,PCR扩增目的基因并克隆到表达载体中,重组表达载体转化大肠杆菌后IPTG诱导表达,SDS-PAGE和薄层扫描检测分析表达产物,通过亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,并用Western bloting和ELISA方法检测其抗原性.[结果]Hc38基因在大肠杆菌中高效表达,表达的融合蛋白相对分子量约为68 KD,表达量占菌体蛋白总量的30;,亲和层析柱纯化出目的蛋白,并能被捻转血矛线虫病绵羊阳性血清和重组表达产物免疫小鼠血清识别,具有反应原性.[结论]实现了Hc38基因的原核表达和纯化,验证了Hc38基因在虫体内的表达形式和抗原性.     

Analysis of fig tree virus type and distribution in China

The common fig(Ficus carica L.)was one of the earliest horticultural crops to be domesticated.A number of different viruses can infect fig trees including Fig mosaic virus(FMV)that has been detected in several commercial fig trees in Xinjiang,China.However,the distribution of FMV and other fig-infecting viruses in China remains unknown.In the present study,a sample from an ancient fig tree growing in Xinjiang was investigated by electron microscopy(EM)followed by PCR/RT-PCR,and FMV,Fig badnavirus 1(FBV-1)and Fig leaf mottle-associated virus 1(FLMaV-1)were detected.Fig leaf samples(252)from commercial orchards across China were subjected to PCR/RT-PCR,and FMV,FBV-1 and Fig fleck-associated virus(FFka V)were relatively abundant(44.4,48.4 and 44%,respectively),while FLMaV-1 and Fig mild mottle-associated virus(FMMa V)were much scarcer(5.6 and 0.4%,respectively),and FLMaV-2,Fig cryptic virus(FCV),and Fig latent virus(FLV)were not detected.The presence of disease-causing viruses in fig trees presents a significant challenge for fig producers in China.This study may help to promote actions aimed at controlling fig viruses,especially FMV.     

云南元谋干热河谷不同生境地表蚂蚁多样性

研究了云南元谋干热河谷明油子-扭黄茅灌草丛(Ⅰ)、牛筋条-黄荆林(Ⅱ)、余甘子-明油子灌木林(Ⅲ)、新银合欢+桉树混交林(Ⅳ)、桉树林(Ⅴ)、新银合欢林(Ⅵ)、多树种混交林(Ⅶ)、印楝林(Ⅷ)、云南松林(Ⅸ)等9种不同生境地表蚂蚁群落的多样性。采集标本29 730头,隶属于5亚科20属46种。各试验地地表蚂蚁群落个体数量46-12 091,物种丰富度4-29,优势度水平0.191-0.778,Shannon-Wiener多样性指数0.597-2.250,均匀度指数0.181-0.791,Jaccard相似性系数0.033-0.697。9种生境地表蚂蚁群落多样性排序为Ⅰ>Ⅲ>Ⅷ>Ⅶ>Ⅸ>Ⅴ>Ⅱ>Ⅳ>Ⅵ。通过聚类分析,9种生境地表蚂蚁群落可分为干热性群落、喜热性群落、偏湿性群落及湿性群落。自然植被类型的蚂蚁群落均以臭蚁亚科占优势。人工植被中的云南松林大头蚁占优势,生态恢复状况良好;其余人工植被的恢复状况尚无法评价。     

捻转血矛线虫肌动蛋白基因的克隆与表达及其DNA疫苗的构建

根据秀丽新杆线虫等其他几种线虫的肌动蛋白(Actin)开放阅读框(ORF)设计简并引物,以捻转血矛线虫总RNA为模板,合成cDNA,用RT-PCR方法扩增出约为1 100 bp的DNA片段。将该片段克隆到T载体后进行序列测定和分析,结果表明该基因的ORF为1 131 bp,与秀丽新杆线虫、新杆状线虫、肿孔古柏线虫等的同源性高达86%以上,推导出其蛋白质序列含有376个氨基酸,与胎生网尾线虫、秀丽新杆线虫、新杆状线虫、马来丝虫等的肌动蛋白相似性均为98%以上,说明成功克隆了捻转血矛线虫actin基因。将捻转血矛线虫肌动蛋白基因的ORF克隆到pET-28a(+)中,构建了原核表达载体,用IPTG进行诱导表达。SDS-PAGE分析发现,该基因获得了表达,且以包涵体的形式存在,融合蛋白相对分子质量约46×103。以此重组蛋白为抗原,用自然感染捻转血矛线虫山羊血清为第一抗体进行Western blot分析,结果出现1条特异性条带,表明捻转血矛线虫Actin蛋白在自然感染过程中能被宿主的免疫系统识别,可能是一种天然抗原。用纯化重组Actin蛋白免疫小鼠,制备抗血清,以该血清为第一抗体进行Western blot,结果发现该血清能识别捻转血矛线虫成虫蛋白谱中相对分子质量约为42×103的蛋白条带。将捻转血矛线虫actin基因亚克隆到真核表达载体pVAX1中,构建了DNA疫苗pVAX1-ACT,动物免疫试验结果表明该DNA疫苗在机体内获得了表达。