抗真菌鲎素基因在大肠杆菌中的表达

人工设计并合成了抗真菌多肽鲎素基因,将合成的鲎素基因首先克隆到了ｐＵＣ１８载体上,利用通用引物测序,获得了与预期碱基序列完全一致的目的基因。再将鲎素基因克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ－５Ｘ－１上,诱导表达融合蛋白。经ＩＰＴＧ诱导,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ进行检测,在２９ｋＤ处出现了ＧＳＴ－鲎素融合蛋白条带,与预期分子量大小相     

油菜菠里马雄性不育胞质特异性orf224基因在大肠杆菌中表达…

本研究利用表达油菜波里马胞质雄性不育相关线粒体基因ｏｒｆ２２４ ３＇端（Ｂ）片段的大肠杆菌，通过分级分离纯化得到了ＧＳＴ－Ｂ蛋白，并和亲和层析纯化的ＧＳＴ蛋白一起分别制备了抗血清。利用纯化的抗血清对在ｐＢＶ２２０和ｐＧＥＸ－５Ｘ－１系统表达的ｏｒｆ２２４各基因片段产物进行了分析，结果表明纯化的ＧＳＴ－Ｂ抗体具有ＯＲＦ２２４蛋白专一性，同时也证实了ｏｒｆ２２４全基因及其３＇端片段的表达。研究结果为进     

脑钠肽与谷胱甘肽巯基转移酶融合蛋白的表达与分离纯化

用ＰＣＲ技术扩增获得脑钠肽－９５ｃＤＮＡ,再由它获得脑钠肽－３８ｃＤＮＡ（ＢＮＰ－３８ｃＤＮＡ）选用融合蛋白表达质粒ｐＧＥＸ－３Ｘ作载体,构建成谷胱甘肽巯基转移酶（ＧＳＴ）和ＢＮＰ－３８的融合基因,该基因在大肠杆菌ＪＭ１０９中表达的最佳体系是：以１：１０扩大培养４ｈ加入终浓度为０．５ｍｍｏｌ／Ｌ的诱导剂ＩＰＴＧ诱导培养４ｈ,诱导表达的融合蛋白量可达５６μｇ／ｍＬ,培养液,是国外文献的３．７３倍,用     

甘薯羽状斑驳病毒外壳蛋白基因在大肠杆菌中的表达及特异抗血清的制备

根据已报道的甘薯羽状斑驳病毒（ＳＰＦＭＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因的核苷酸序列合成引物,利用ＲＴ－ＰＣＲ的方法获得ＣＰ基因后,再将其克隆到原核表达载体ｐＥＴ３０ａ（＋）中。ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析表明,经ＩＰＴＧ诱导,ＣＰ基因在大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ｐＬｙｓＳ中获得了高效表达。以含表达产物的凝胶为抗原,免疫家兔,制备了ＳＰＦＭＶ外壳蛋白的特异性抗血清。Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ和点免疫（Ｄｏｔｂｏ     

新城疫北京强毒株融合糖蛋白（F）基因的克隆及序列分析

ＮＤＶ北京强毒株Ｆ４８Ｅ９经ＳＰＦ鸡胚增殖,超速离心纯化,异硫氰酸胍法提取病毒ＮＡ后,用ＲＴ－ＰＣＲ扩增,得到其融合糖白基因。将扩增产物与ｐＧＥＭ＾Ｒ－Ｔ载体相连接转化,经过ＡｍｐＩＰＴＧ－Ｘｇａｌ（ＡＩＸ）平板筛选,ＨｉｎｄⅢ酶切及ＰＣＲ鉴定,初步获得了含Ｆ基因的阳性克隆。用渐近法对克隆片段进行全序列分析,证明得到了作长１７４４个核苷酸的ＮＤＶ Ｆ蛋白基因。     

MBP-狂犬病毒NP融合蛋白在大肠杆菌中的表达及NP的纯化

将狂犬病毒核蛋白结构基因重组到原核表达质粒ｐＭＡＬ－Ｃ２Ｘ中,经ＩＰＴＧ诱导表达出的ＭＢＰ－ＮＰ融合蛋白分子量约９８ｋＤ;用支链淀粉琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到电泳均一的融合蛋白,融合蛋白用因子Ｘａ裂解后,经Ｑ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ离子交换层析可将ＭＢＰ与ＮＰ分开,得到了电泳均一、分子量约５６ｋＤ的ＮＰ蛋白,经Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析证实抗原性正确,为进一步利用ＮＰ蛋白制备抗体或单克隆抗体打下了基     

油菜波里马胞质雄性不育相关线粒体基因orf224在大肠杆菌中…

本研究设计合成引物，从油菜波里马胞质雄性不育系线粒体ＤＮＡ上扩增出可能与育性有关的ｏｒｆ２２４基因５＇端（Ａ片段）和３＇端（Ｂ片段）以及全长基因（Ｃ片段）片段，并分段克隆到ｐＢＶ２２０和ｐＧＥＸ－５Ｘ－１载体上，经序列分析证实，获得了编码２２４个氨基酸基因的各序列片段。各重组菌株诱导表达产物比较分析表明，只有ｏｒｆ２２４ ３＇端即Ｂ片段融合蛋白ＧＳＴ－Ｂ得到了高效表达，其它菌株在聚丙烯酰胺凝胶电泳     

指导的基因在动物乳腺特异性表达载体的构建

为了实现外源蛋白质在动物乳腺中特异性表达,采用ＰＣＲ法扩增了ＢＬＧ ３’端含第６,７外显子及ｐｏｌｙ（Ａ）加尾信号下游约２００ｂｐ的０．８７ｋｂ片断。以山羊ＢＬＧ ５’的３．２ｋｂ（含第１,２外显子）启动子,山羊ＢＬＧ ３’０．８７ｋｂ序列,鸡α－珠蛋白基因簇π基因上游的－２．４￣－５．３ｋｂ ＨｉｎｄⅢ序列,绿色荧光蛋白ＧＦＰ及原核载体ｐＧＥＭ－７ｚｆ构建了ｐＧＥＭ－７ｚｆ－ＧＦＰ－ＭＡＲ－５’     

新城疫病毒F48E8株核衣壳蛋白基因在鸡痘病毒中的表达及其？…

通过反转录－聚合酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）扩增了新城疫病毒（ＮＤＶ）Ｆ４８Ｅ８株核衣壳蛋白（ＮＰ）基因,并克隆到ｐＵＣＮＰ。应用分子克隆技术,将ＮＰ基因导入鸡痘病毒（ＦＰＶ）转移载体ｐＦＧ１１７５－１中Ｐ７．５启动子的下游,得到含ＮＤＶ ＮＰ基因的质粒ｐＦＧＮＰ１１７５－１。利用脂质体转染技术,将该质粒转染ＦＰＶ疫苗株２８２Ｅ４感染３－４ｈ的鸡胚成纤维细胞,采用蓝斑筛选方法纯化多次,得到稳定的重组Ｆ     

马铃薯Y病毒普通株系外壳蛋白基因的克隆与原核表达载体的构建

本研究报道马铃薯Ｙ病毒普通株系外壳蛋白基因ｃＤＮＡ克隆,全序列分析及其原核表达载体构建的结果。从感染ＰＶＹ的烟草叶片中提取病毒粒体,ＳＤＳ－酚法提取病毒核酸。以所提核酸为模板,用一对ＰＶＰＣＰ基因引物进行ＲＴ－ＰＣＲ,扩增了０．８０ｋｂ的特异性核苷酸片段。该片段大小五国外报道的ＰＶＹ ＣＰ基因一致,将ＰＤＲ产物插入到克隆载体ｐＧＥＭ７Ｚｆ（＋）中转化大肠杆菌ＤＨ５α。     

花生防御素基因的克隆及原核表达

植物防御素是植物免疫系统的一员,具有防御病原菌侵染植物的功能。本文采用RACE法成功地克隆花生防御素基因,并对其原核表达蛋白进行研究。研究结果表明,采用RACE方法克隆花生防御素基因（AhORRP）,得到的cDNA全长为585bp,含一个225bp的开放阅读框（open reading frame,ORF）,编码75个氨基酸;经同源分析,花生防御素蛋白与其它物种具有33％～70％的同源性。原核表达获得大小约28kD AhDRRP融合蛋白。该基因的克隆及其原核表达融合蛋白的获取为花生防御素功能鉴定打下一定基础。     

利用菊花B病毒外壳蛋白特异片段进行多克隆抗体的制备与分析

菊花B病毒(CVB)是乙型线状病毒科(Betaflexiviridae)麝香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)成员,在浙江杭白菊基地普遍存在。为了能够特异、快速、简便检测CVB,利用SWISS-MODEL分析CVB外壳蛋白(CP)的三维结构,选择暴露在CVB CP三维空间结构外部的片段,片段之间使用连接肽串联以提高柔性,重复4个片段,根据大肠杆菌密码子的偏爱性将其相应的DNA序列进行优化,将合成的特异DNA序列连接表达载体pET-28a(+),转化至Escherichia coli BL21(DE3)菌株,经IPTG诱导和Ni-NTA重力柱层析获得了纯化后大小约为14 kDa的融合蛋白;将其作为抗原免疫家兔制备抗血清,纯化获得相应抗体;对获得的抗血清和抗体进行酶联免疫吸附测定(ELISA)和蛋白免疫印迹(WB)检测。间接ELISA检测结果表明,512 000倍稀释的抗血清可检测到1 μg抗原。纯化后最终得到浓度为15 mg·mL^-1 的抗体,WB检测结果,1∶1 000稀释后的抗体可检测500 pg抗原,且能够特异性结合CVB CP蛋白。本研究制备的多克隆抗体为检测CVB提供了便利,也为后续CVB检测试纸条的开发提供了技术支撑。     

Fusion Expression and Purification of Marek’s disease virus Tegument Protein VP16 and Its Antibody Preparation

马立克氏病病毒(Marek’s disease virus ,MDV)UL48基因编码的蛋白与单纯疱疹病毒1型(Herpes simplex virus ,HSV)衣壳蛋白VP16为同源物，将其克隆入pET-32a载体中，获得pET-VP16, 转化Escherichia coli BL21感受态细胞，经IPTG诱导表达，SDS-PAGE电泳显示:融合蛋白获得可溶性表达，表达蛋白的相对分子量约为67 kD；将表达的融合蛋白过His·Bind柱，获得纯化的蛋白，将该蛋白免疫家兔，制备多克隆抗体。通过间接ELISA和Western blot鉴定制备的多克隆抗体的效价和特异性，结果表明，该抗体具有较高的特异性，间接ELISA效价大于2×10－5。     

猪甲状腺激素应答基因SPOT14(THRSP)的原核表达及其融合蛋白的亲和纯化

甲状腺激素应答基因（thyroidhormone responsive SPOT14,THRSP）是受甲状腺激素诱导表达的核内基因,参与脂肪合成代谢途径限速酶的转录调控,对动物脂肪生成具有重要的调控作用。为进一步研究猪SPOT14基因所编码蛋白质的生物学功能,本实验将猪SPOT14（GenBank登录号:JF₉51726）的ORF片段与表达载体pET-28α（+）进行重组,获得的重组子pET-28α（+）-S14,转化大肠杆菌（Escherichia coli）BL2l（DE3）感受态细胞,重组菌经IPTG诱导,通过SDS-PAGE分析显示,目的蛋白分子量约为20.91kD,且主要以包涵体形式存在,最佳诱导条件是37℃1mmol/LIPTG诱导5h。将获得的包涵体用6xHisNi-NTA纯化柱纯化后,采用Western blot进一步检测到了21kD目的蛋白的表达。重组质粒pET-28α（+）-S14在大肠杆菌BL21（DE3）中成功地得到了表达,不仅为SPOT14基因生物学功能的研究,而且为进一步研究S14蛋白功能,了解脂肪代谢调控机制提供了基础资料。     

牛分枝杆菌CFP-10基因的表达和重组蛋白的纯化

根据GenBank中牛分枝杆菌的基因序列,设计合成一对扩增CFP-10基因完整ORF的特异性引物,以pET32a（＋）为载体构建重组表达载体CFP-10／pET32a（＋）。重组表达载体转化大肠杆菌BL21（DE3）,经0．9mmol／LIPTG37。C诱导3h后表达,收集菌体并裂解,裂解后上清和沉淀经SDS—PAGE分析,结果表明融合蛋白分子量分别为30kD,表达产物以可溶性存在于上清中,后经Ni．NTA吸附柱方法对目的蛋白进行纯化,经薄层凝胶扫描分析,纯化后的His融合蛋白纯度达95％,该CFP-10表达蛋白可作为体外诊断抗原,为进一步建立检测牛分枝杆菌的方法奠定基础。     

杆状病毒J 结构域蛋白基因的克隆、表达和抗体的制备

摘要：斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒（Spodoptera litura multicapsid nucleopolyhedrovirus，SpltMNPV）bjdp (baculovirus J domain protein) 基因是杆状病毒基因组中唯一编码J 结构域蛋白的基因。利用PCR方法扩增得到此全长基因，将其克隆到5'端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上并转化E. coli M15[pREP4]， 在IPTG诱导下表达了一个分子量为36 kD的融合蛋白。以纯化过的6×His-BJDP融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔，得到该蛋白的抗血清。免疫印迹分析表明，该抗血清能与感染斜纹夜蛾多粒包埋型核型多角体病毒的细胞蛋白样品发生特异性反应。     

杆状病毒SpltMNPV gp41基因的克隆、表达及抗体制备

摘要：GP41是杆状病毒包埋型病毒粒子（Occlusion-derived virus，ODV）特有的糖蛋白，它介导芽殖型病毒粒子（Budded virus，BV）的核衣壳通过胞核。用PCR方法扩增得到斜纹夜蛾核多角体病毒（Spodoptera litura nucleopolyhedro virus，SpltMNPV）gp41基因, 并将其克隆至5′端有6×His编码序列的原核表达载体pQE30上，转化大肠杆菌(Escherichia coli )M15[pREP4]，在1 mmol/L异丙基-D-硫代半乳糖（IPTG）诱导下超量表达了与理论预测值相符的1个37.9 kD融合蛋白。以纯化的融合蛋白为抗原，免疫新西兰大白兔制备了特异的抗GP41抗体。Western印迹分析表明，该抗体适合进一步分析SpltMNPV GP41蛋白。     

豇豆胰蛋白酶抑制剂和硫氧还蛋白的融合表达和活性测定

采用融合蛋白表达技术，通过1个人工设计合成的柔性接头，将豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)基因与表达载体上的硫氧还蛋白(thioredoxin )基因连接，构建了融合表达载体。将表达载体转入大肠杆菌(Escherichia coli )GI724，通过色氨酸诱导获得高效表达，产物以可溶状态存在。活性测定显示，融合蛋白具有抑制胰蛋白酶的生物学活性。以大豆胰蛋白酶抑制剂为参照，将融合蛋白热处理后进行活性测定，发现它具有较好的热稳定性。将肠激酶(enterokinase)与融合蛋白在37 ℃作用16 h，可获得切掉thioredoxin的CpTI蛋白。活性测定显示，切除thioredoxin后CpTI的胰蛋白酶抑制活性比同样处理条件下的thioredoxin-CpTI明显下降，比活力仅为原来的80%，说明融合蛋白具有更高的稳定性。研究结果为thioredoxin-CpTI作为一种生物农药的应用奠定了基础。     

鸭瘟病毒gB蛋白N端抗原域的高效表达及其免疫特性初步研究

在分析鸭瘟病毒gB蛋白抗原性的基础上,设计一对引物克隆gB蛋白N端抗原性较好的抗原域编码基因, 克隆至表达载体pET32a中, 构建了原核表达质粒pET-gB1。将pET-gB1转化至感受态E. coli BL21(DE3) 中, 经IPTG诱导和SDS-PAGE 分析, 可见约42.4kDa 的目的蛋白以包涵体形式表达。Western blotting 分析发现, 表达产物与抗鸭瘟的鼠阳性血清发生特异性反应。将包涵体溶解于8mol/L的尿素中, 利用His•Bind试剂盒获得纯化的蛋白, 将纯化的蛋白皮下注射免疫小鼠, 间接ELISA法测得抗体的效价, MTT 法检测免疫小鼠的T 淋巴细胞增殖反应能力。结果说明该融合蛋白能够诱导机体产生较强的体液免疫和细胞免疫。     

基于ISSR分析28份香蕉种质的基因组DNA多样性

利用ISSR标记技术分析了28份香蕉种质的遗传多态性。从100个ISSR引物中筛选出8个多态性引物,共扩增出55条DNA带,其中46条为多态性带,占83.6%,平均每个引物扩增的DNA带数为6.88条。依相似系数0.73的水平,将香蕉28个品种划分为6大类。其中云南BB（BB）和东莞高把大蕉（ABB）在相似系数为0.94时,二者的亲缘关系较近。Pisang Ceylan（AAB）和FHIA-18（AAAB）相似系数水平接近为1,表明二者亲缘关系最近。本研究为香蕉遗传关系的建立及品种鉴定提供理论基础。