水稻OsRFP1基因的原核表达与蛋白纯化

以推导的氨基酸序列分析,水稻OsRFP1基因编码一分子量为34.24kDa锌指蛋白。将OsRFP1基因编码区cDNA序列插入到pGEX4T-3载体中构建OsRFP1-gst融合基因的表达载体,并将质粒转化宿主菌大肠杆菌BL21DE3。经IPTG诱导,融合蛋白在BL21DE3细胞中获得表达。利用亲和层析的方法对融合蛋白进行了纯化,SDS-PAGE蛋白电泳显示获得一60kDa的唯一蛋白条带,即OsRFP1-GST融合蛋白。     

CRP基因原核表达载体的构建和表达及其免疫原性检测

采用大肠杆菌表达体系来获得C-反应蛋白(CRP)融合蛋白。以pDNR-CRP质粒为模板,用PCR方法扩增获得全长的CRP基因,将其克隆入表达载体pET28 a( )中,再转化到宿主菌BL21(DE3)中,加入IPTG诱导表达,表达产物做SDS-PAGE电泳分析,最后做免疫原性检测。成功地构建了CRP基因原核表达载体pET28 a( )-CRP,经IPTG诱导SDS-PAGE电泳分析表明C-反应蛋白能在大肠杆菌中获得表达,但免疫原性检测初步结果为阴性。结果证明CRP能以融合蛋白的形式在宿主菌BL21(DE3)中得到大量表达,表达产物缺乏免疫原性,其机理还有待进一步试验探讨。     

谷子类受体蛋白激酶基因SiRLK35的克隆及原核表达

本研究以"豫谷1号"c DNA为模板,通过PCR技术获得类受体蛋白激酶基因SiRLK35(NCBI登录号:XM_004956247.2)的全长序列。生物信息学分析显示,该基因编码蛋白由392个氨基酸残基构成,包含一个S_TKc保守结构域以及一个TFS2N结构域,含3个跨膜结构域,N端有信号肽。SiRLK35基因经Bam HⅠ、SalⅠ双酶切后,利用p ET-28a构建原核表达载体,转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),经0.5 mmol/L IPTG于25℃诱导12 h后,在44.6 k D处得到一明显诱导表达蛋白条带,表达产物与预期相符,证明SiRLK35基因可在大肠杆菌中诱导表达。该结果为进一步研究SiRLK35基因功能奠定基础。     

烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白基因全长ORF的克隆与原核表达

采集河南自然发病的烟草.通过摩擦接种至实验室烟草后直接提取总RNA,利用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增获得了烟草马铃薯Y病毒外壳蛋白(PVY-HN CP)基因;经Nde Ⅰ和Sal Ⅰ双酶切处理的PCR产物,连接克隆至大肠杆菌表达栽体pET28a( ),构建了重组质粒pPVYCP,所获得的重组质粒经过酶切、测序鉴定,证实正确插入了PVY-HN CP基因的全长ORF.序列分析表明,PVY-HN CP基因由804个核苷酸组成,编码267个氨基酸残基;重组的pPVYCP表达载体转化大肠杆茵BL21(DE3)pLysS,经IPTG诱导.SDS-PAGE电泳显示分子量为32 kDa的CP蛋白得到了诱导表达.     

小麦黄花叶病毒P2蛋白原核表达、抗血清制备及其在感病小麦细胞中的定位

通过RT PCR获得小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus, WYMV)扬州分离物P2基因,并进行序列分析。P2基因编码区含有2 635个核苷酸,编码一个由875个氨基酸组成的分子量72 kDa 的蛋白。在原核表达体系中,该基因的全长表达较困难,因此将P2基因的5′端和3′端各设计大约1 kb亚克隆到原核表达载体pMAL C2X中构建重组表达载体MBP P2N,MBP P2C,经IPTG诱导在大肠杆菌BL21(DE3)中表达MBP P2N和MBP P2C融合蛋白。MBP P2C融合蛋白经大量诱导、纯化、制备相应抗血清。用制备的抗血清可以有效检测WYMV病叶中的P2蛋白。免疫胶体金标记实验表明在感病WYMV的小麦叶片细胞膜状内含体结构中发现有大量胶体金颗粒特异性分布,表明P2蛋白可能与膜状内含体结构有关。     

胸膜肺炎放线杆菌ApxIA N端基因的克隆与原核表达

[目的]为猪接触传染性胸膜肺炎的诊断和基因工程疫苗的研制提供理论依据。[方法]以胸膜肺炎放线杆菌（APP）血清10型菌株为材料,采用PCR技术对其ApxIA的N端基因进行扩增,将扩增产物转入克隆载体和表达载体中进行克隆和表达,用重组表达质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）,利用免疫印迹分析鉴定ApxIAN端基因表达产物的免疫活性。[结果]ApxIA N端基因PCR扩增产物与标准10型ApxIAgene（D16582）的同源性为99.7%。NcoI和HindⅢ双酶切鉴定结果表明,目的基因已成功转入原核表达载体pET-32a中。含重组质粒的大肠杆菌BL21经IPTG诱导后表达了相对分子量为779 kDa的目的蛋白,该蛋白分子量与标准ApxIA蛋白（Marker）相同。[结论]SDS-PAGE电泳和免疫印迹检测结果表明,ApxIAN端基因在表达载体中得到高效表达,且表达产物具有免疫活性。     

IBDV VP3结构蛋白在大肠杆菌中的表达与鉴定

应用RT-PCR技术从鸡IBDV总RNA中克隆出893bp的VP3基因,并将其进一步克隆于pET-28a载体T7启动子的下游,构建了pETVP3原核表达载体。经IPTG诱导,在其宿主菌BL21(DE3)中成功表达了35.5,33kDa的鸡IBDVVP3蛋白。经SDS-PAGE和Westernblotting分析,VP3表达产物以包涵体形式存在,并与鸡IBDV抗血清特异性反应。     

苦荞过敏原TBa和TBb基因的共表达及其包涵体复性的研究

[研究目的]利用大肠杆菌共表达苦荞过敏蛋白的两个亚基,并对表达产物进行包涵体复性研究和免疫学活性分析;[方法]用已构建的表达质pET-28a-TBa和pET-32m-TBb,共转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态,利用双抗生素筛选法,获得稳定遗传的双质粒转化子,经IPTG诱导,两个基因在同一宿主菌中共表达,在共表达产物复性过程中,两个亚基互为分子伴侣,相互促进了蛋白质的重新正确折叠;[结果]表迭蛋白以包涵体的形式存在,ELISA检测表明:复性后的蛋白免疫学活性得到了提高;[结论]由此获得了有活性的蛋白质,并且建立了不相容双质粒共表达外源基因和包涵体复性的方法.     

β-伴大豆球蛋白α′-亚基的基因克隆及原核表达

为制备N-连接糖基缺失的重组β-伴大豆球蛋白α′-亚基,以‘鲁96150’大豆种子为原料提取总RNA,经RT-PCR一步法获得‘鲁96150’大豆的全长cDNA,采用自行设计的引物F1/F2扩增得到目的基因α′,与pGEM-T easy载体相连构建重组克隆载体pGEM-α′,经XhoⅠ/EcoRⅠ双酶切得到目的基因与载体pET-28a连接构建重组原核表达载体pET-28a-α′,将经菌落PCR、双酶切及测序鉴定正确的表达载体转入感受态细胞E.coli BL21(DE3),经异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达重组蛋白α′-亚基。对重组α′-亚基的诱导表达条件进行筛选,发现在菌液OD600值为0.8、诱导温度30℃、IPTG浓度为0.2mmol/L的诱导条件下诱导9h后α′-亚基的表达量较高,重组α′-亚基的分子质量大小约为70ku;工程菌pET-28a-α′-BL21经超声破碎、离心后发现重组α′-亚基部分存在于上清液中,部分形成包涵体蛋白。重组α′-亚基的克隆及表达为β-伴大豆球蛋白结构及功能特性的研究奠定基础。     

溶菌酶基因合成及其原核表达

根据T4噬菌体溶菌酶的氨基酸序列,选用植物偏爱的密码子设计并人工合成了溶菌酶基因,并在N-端加上23个氨基酸残基的α-淀粉酶信号肽序列和信号肽酶切位点HQP;用苷氨酸残基替代C-端的酰胺;新基因全长为576 bp,共编码190个氨基酸.为了检测该基因生物活性,将其克隆到原核表达载体pET28b( )中,导入宿主细菌E. coli BL21(DE3) pLysS,经IPTG诱导后,宿主细菌在2 h内全部被溶菌酶基因的表达产物裂解,说明该溶菌酶基因对细菌具有很强的抗性.     

The Minimal Active Fragment of the Cry1Ai Toxin is Located Between 36I and 605I

The novel cry1Ai gene that cloned from Bacillus thuringiensis strain SC6H8 encoded a protein exhibiting strong toxicity against Plutella xylostella and Chilo suppressalis in our previous study. Using the available information for the active fragments of other Cry toxins, eight truncated fragments were constructed to identify the minimal active fragment of Cry1Ai. All truncated fragments were expressed in Escherichia coli strain BL21 (DE3), and the insecticidal activity against 2nd- instar P. xylostella larvae was assessed using full-length Cry1Ai as a positive control. The results indicate that the minimal active fragment of the Cry1Ai toxin against P. xylostella is located between amino acid residues 36I and 605I, which is smaller than the regions previously reported for Cry1A. The first two amino acids (34T and 35P) on helix α-1 and whole helix α-2 of domain I and sheet β-32 of domain III are necessary for Cry1Ai toxin to keep its toxicity against P. xylostella.     

小麦黄花叶病毒P1蛋白原核表达、抗血清制备及其检测

用RT-PCR方法从感染小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)扬州分离物的小麦叶片中扩增获得该病毒P1基因的全长cDNA片段,并进行了序列分析。结果表明,P1基因编码区含有765个核苷酸,编码1个由255氨基酸组成分子量为28.2 kDa的蛋白。将P1基因亚克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中构建重组原核表达载体pGEX 6P-1-P1,经IPTG诱导,P1蛋白在大肠杆菌BL21(DE3)中表达GST-P1的融合蛋白,纯化并制备了P1蛋白的兔抗血清。利用此抗血清,可以检测WYMV病叶中的P1蛋白,但与提纯的WYMV粒子没有血清学反应,表明P1没有参与WYMV粒子的包装,是一种非结构蛋白。     

出血性大肠杆菌O157：H7的Tir与stx1／2B融合基因的构建和表达

为了更好防治由出血性大肠杆菌O157：H7引起的疾病,尝试研制基因工程疫苗．其中亚单位疫苗具有很大优势。方法：构建表达tir和stxb的融合基因。将tir基因中间295个氨基酸残基（Tir295）与stxB亚基基因72个氨基酸串联。构建pET28a—stx2b—Tir295-stx1b重组质粒,将其转化于BL21（DE3）,用IPTG进行诱导表达,经SDS--PAGE电沫检测,该融合蛋白获得了高效表达。结果：薄层扫描分析表明,目的蛋白表达量占菌体总蛋白含量的30％左右。结论：由于该融合蛋白由Tir、stx1b和stx2b三部分抗原组成．可刺激机体产生针时转位紧密素受体（Tir）和志贺毒素（stx）的抗体,在EHEC0157亚单位疫苗设计或单克隆抗体抗制备中具有重要价值。     

兔IFN-γ基因的克隆、遗传进化分析及其表达

运用RT-PCR技术对用ConA刺激后的中国白兔外周血淋巴细胞(PBMCr)进行扩增,将纯化后的PCR产物克隆入pMD18-T中进行序列测定,并进行遗传进化分析.结果发现:该基因全长501 bp,编码167个氨基酸,其中前20个氨基酸残基构成信号肽序列.与不同物种IFN-γ基因相比,核苷酸和推导的氨基酸序列有一定的差异.在推导的中国白兔IFN-γ氨基酸序列中,在41~43、108~110和117~119位存在3个潜在的N-联糖基化位点,同时存在3个Cys残基.转化重组质粒pETIFN-γ的大肠杆菌BL21(DE3)经IPTG诱导后,重组菌菌体裂解物经SDS-PAGE电泳可检测到相对分子量为22.6 kDa的重组蛋白.经凝胶薄层扫描,重组蛋白表达量可占菌体蛋白的19.2%.     

大肠杆菌F18菌毛FedE蛋白的表达与鉴定

根据已经发表的F18菌毛E亚单位的基因序列(fedE)设计1对引物,利用PCR技术从重组质粒TFl07E中扩增到一段序列,并按预定的阅读框架插入到表达性质粒载体pGEX-6p-1中的谷胱苷肽转移酶(GST)基因的下游,获得重组质粒pPFedE,并转化大肠杆菌BL21获得重组菌PPFedE。琼脂糖凝胶电泳、序列测定及分析表明：该序列大小为459bp,与GENEBANK中的FedE结构编码序列(Z26520)完全一致。通过对菌体裂解物的SDS—PAGE电泳分析以及Western blotting鉴定,证明重组大肠杆菌PPFedE的可以表达融合蛋白形式的FedE(命名为GST-FedE),即FedE蛋白(16．297ku)与谷胱苷肽转移酶(27．335ku)相连组成分子量为43．632ku的融合蛋白。     

甘蔗S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因Sc-SAMDC的克隆和表达分析

【目的】克隆甘蔗(Saccharum officinarum)S-腺苷蛋氨酸脱羧酶(S-adenosylmethionine decarboxylase,SAMDC)基因,并进行序列特征、原核表达和不同逆境胁迫下表达特性分析。【方法】通过对甘蔗茎全长cDNA文库测序和分析,获得SAMDC基因cDNA全长,命名为Sc-SAMDC,并进行序列分析。随后将编码S-腺苷蛋氨酸脱羧酶的cDNA片段克隆到原核表达载体pET29a(+)中,构建融合表达质粒,转化至Esherichia coli BL21(DE3)中进行表达。最后利用定量PCR技术分析甘蔗幼苗中该基因在不同外源胁迫下的表达特性。【结果】序列分析显示,甘蔗Sc-SAMDC基因(GenBank Accession number:GQ246459)cDNA全长1968bp,存在3个读码框(袖珍读码框tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),mORF长1200bp,编码399个氨基酸的SAMDC酶原,预测分子量为43.6kD,该酶原含有两个高度保守的功能结构域(酶原剪切位点和PEST结构域)。原核表达产物经SDS-PAGE表明,Sc-SAMDC以融合蛋白形式表达,相对分子量约为50kD。定量PCR分析表明,Sc-SAMDC基因在聚乙二醇(PEG)、NaCl、水杨酸(SA)和H2O2外源胁迫下表达特性不同,受PEG和NaCl的诱导,受SA和H2O2的抑制。【结论】本研究成功地克隆了Sc-SAMDC基因并在原核生物中进行了表达研究,分析了该基因的表达特性,为其进一步的生物学功能研究及其应用奠定了基础。     

Cloning of Soybean 24 kDa Oleosin Gene and Its Transient Expression as a Carrier for Foreign Protein

The genomic DNA sequence encoding soybean 24 kDa oleosin and its promoter were cloned and analyzed for investigation of the potentials of the oleosin acted as a carrier for production of recombinant proteins in plant. The -300 box, GA-rich, G-box, SEF-3, SEF-4, RY box, ABA box, CAn and TATA box were found in the upstream region of the soybean oleosin gene, which shows the functional oleosin promoter available. Homology comparison reveals that the soybean 24 kDa oleosin shares the highest identity with the soybean oleosin isoform A (U09118, GenBank), reaching to 98.4% in nucleotide. A soybean oleosinhirudin fusion gene driven by the oleosin promoter was constructed and inserted into plant binary expression vector. The intact tobacco plantlets were transformed by means of vacuum infiltration approach, with the Agrobacterium tumefaciens harboring the above vector. The transient correct expression of oleosin-hirudin fusion gene was identified by SDS/PAGE, western blotting and enterokinase treatment.     

辣椒素生物合成途径基因pal克隆及原核表达分析

以辣椒品种"益都红"胎座RNA反转录的cDNA为模板,根据pal基因保守序列设计引物,PCR扩增得到1条全长2157bp的目的片段。该基因包含有完整的开放阅读框架,编码718个氨基酸,预测的分子质量为73ku。与多种植物PAL的氨基酸序列有一定的同源性,其中与同科同属植物朝天椒的同源性最高。应用分子克隆的方法成功地构建了pET-32a-pal重组表达质粒,优化得到诱导表达的最佳条件为:IPTG0.3mmol·L-1,温度28℃,时间6h,经SDS-PAGE检测6×His-PAL在E.coli中得到了高效表达,重组蛋白分子质量约为93ku。因此,该基因的克隆与原核表达为深入研究辣椒PAL的基因结构、生物活性、表达调控机制以及辣椒素的生物合成机制奠定了重要基础。     

玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。