鸡催乳素受体胞外域的分子克隆及原核表达

根据家鸡催乳素受体基因胞外域序列（GenBank号：D13154）设计并合成1对覆盖编码区58～1249位核苷酸的引物，以家鸡垂体总RNA为模板，经反转录-聚合酶链反应（RT-PCR）方法获得了特异性片断，将该片断克隆入pMD18-T载体并转化感受态细菌Ecoli DH5α永久保存．通过设计第2对引物扩增PRLR胞外域cDNA片段，该片段经酶切后克隆到表达载体pRSETA的EcoRⅠ和HindⅢ两酶切位点之间，构建重组质粒pR-PRLR．该质粒在转化感受态细菌E．coli B121（DF．3）后，在IPTG诱导下促使重组菌表达了相对分子质量为53640左右的重组融合蛋白，表达量在0．1mmol／L IPTG诱导5h时达到最高，约占总菌体蛋白的17．6％左右．表达产物可经体积分数为50％的Ni-NTA凝胶纯化，说明重组蛋白中具有正确的His-tag标签及之后的鸡催乳素受体编码区胞外域序列．     

草鱼Pim-1基因克隆、组织表达及多克隆抗体的制备

【目的】旨在进一步研究草鱼（Ctenopharygodon idella）莫洛尼鼠白血病病毒前病毒整合基因1(Proviral integration of moloney murineleukemia virus, Pim-1)的功能。【方法】采用RACE法克隆草鱼Pim-1(CiPim-1)的全长cDNA序列,并对其全长序列进行生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测CiPim-1在健康草鱼肝脏、肾脏、头肾、脾脏、肠、心脏、鳃、皮肤、肌肉及血液中的相对表达量,同时将CiPim-1基因（246～318 aa）片段克隆到原核表达质粒pGEX-4T-1中,转入E. coli Rosetta菌株,经IPTG诱导后成功表达重组蛋白pGEX-4T-1-Pim1,随后采用纯化后的融合蛋白免疫新西兰大白兔获得抗血清,并通过ELISA测定抗血清效价,最后采用免疫印迹（Western Blotting）分析抗体的特异性。【结果】CiPim-1基因序列全长1 082 bp,编码318个氨基酸,分子量为36.14 ku,具有1个蛋白激酶结构域（Protein kinase domain...     

SCMRP基因原核表达及多克隆抗体制备

SCMRP基因是根据大豆密码子偏向性,采用生物信息学方法对玉米胚乳蛋白基因(MRZP)进行改造并合成的新基因,是适合在大豆中高效表达的高含硫氨基酸基因,可用于豆科作物的品质改良。将新合成的SCMRP基因构建到含有6×His标签序列的原核表达载体pET-32b上,转化大肠杆菌BL21(DE3)菌株中,SDS-PAGE和Western blot分析表明:经IPTG诱导,转化的大肠杆菌BL21(DE3)菌株中能正常表达出约20ku的目标蛋白质,IPTG最佳诱导表达时间是6h,融合蛋白质以可溶组分形式存在。菌体总蛋白经金属鳌合层析纯化后免疫新西兰大耳兔,制备兔抗血清,经Western blot和琼脂板双向扩散试验表明,已纯化出SCMRP-6×His融合蛋白质,成功制备出SCMRP兔多克隆抗体,抗血清效价达到1:256。上述结果表明,新合成的SCMRP基因是能够在生物体中正常表达的完整基因,制备的SCMRP兔多克隆抗体可用于转SCMRP基因植物蛋白质表达分析。研究结果将为通过转基因技术改良豆科植物含硫氨基酸品质奠定重要基础。     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

鹅催乳素受体基因克隆与表达

应用RACE-PCR技术,克隆了全长3 159 bp鹅催乳素受体基因(gPRLR)cDNA.序列分析表明, cDNA含443 bp 5′-UTR、2 496 bp编码区(含终止密码子TAA)和220 bp 3′-UTR.比对鸡催乳素受体基因并将前330 bp看作第1外显子,则gPRLR基因可划分为14个外显子.推导的蛋白序列含831个氨基酸,与鸡、鸽及火鸡PRLR的同源性分别为87.7%、85.2%和84.8%,其N末端含24个氨基酸的信号肽,成熟蛋白含807个氨基酸.gPRLR mRNA在成年鹅睾丸、输精管、卵巢、输卵管、肾、大肠、小肠、脾组织中均有表达,其中以肾、睾丸、大肠及小肠中表达最为丰富.     

鹅催乳素受体基因cDNA5′端序列克隆

为寻找鹅就巢性相关基因,从洪泽湖性成熟公鹅睾丸组织分离并合成鹅cDNA第一链;利用RACE克隆了鹅催乳素受体基因(gPRLR)5′端序列。所克隆的499 bp 5′端序列可划分为348 bp的5′-UTR、151 bp的以ATG作为起始密码子的阅读开放框。与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA序列作比对,此499 bp序列可划分为238 bp的第1外显子、69 bp的第2外显子、114 bp的第3外显子及81 bp的部分第4外显子,起始密码子位于第3外显子45 bp处。阅读开放框核苷酸序列与cPRLR cDNA同源部位的阅读开放框同源性达到88%,推导的氨基酸序列同源性达到84%。     

鹅催乳素受体基因cDNA 5'端序列克隆

为寻找鹅就巢性相关基因,从洪泽湖性成熟公鹅睾丸组织分离并合成鹅cDNA第一链;利用RACE克隆了鹅催乳素受体基因(gPRLR)5'端序列.所克隆的499 bp 5'端序列可划分为348 bp 的5'-UTR、151 bp的以ATG作为起始密码子的阅读开放框.与鸡催乳素受体基因(cPRLR)cDNA序列作比对,此499 bp序列可划分为238 bp 的第1外显子、69 bp 的第2外显子、114 bp 的第3外显子及81 bp 的部分第4外显子,起始密码子位于第3外显子45 bp处.阅读开放框核苷酸序列与cPRLR cDNA同源部位的阅读开放框同源性达到88%,推导的氨基酸序列同源性达到84%.     

大肠杆菌NrfA蛋白表达、纯化及多克隆抗体的制备

[目的]克隆大肠杆菌NrfA基因,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体,制备相应的多克隆抗体并对其进行鉴定。[方法]以大肠杆菌基因组DNA为模板,PCR扩增得到NrfA基因编码区,构建pET-28a(+)-NrfA表达载体;经IPTG诱导表达并纯化重组蛋白;再免疫新西兰雄兔,制备多克隆抗体;用ELISA方法检测抗体的效价,Western Blotting检测抗体的特异性。[结果]构建的表达载体pET-28a(+)-NrfA在大肠杆菌中诱导后可高效表达NrfA蛋白;免疫获得的多克隆抗体用ELISA检测,其效价为1∶204 900;经Western Blotting分析,抗体的特异性较好。[结论]成功克隆大肠杆菌的NrfA基因,并构建了其表达载体,制备的NrfA多克隆抗体具有较高的效价和良好的特异性,为研究细菌有关NrfA奠定了基础。     

BLCAP蛋白原核表达及其多克隆抗体制备

目的:利用原核表达系统表达BLCAP融合蛋白并制备其多克隆抗体。方法:构建原核表达重组质粒pET32a( )-BLCAP并转化到宿主菌BL21中,通过IPTG诱导表达并采用亲和层析的方法纯化和SDS-PAGE鉴定后免疫日本大耳白兔,制备BLCAP蛋白多克隆抗体并检测其特异性。结果:经过IPTG诱导,获得分子量大小约为28ku的融合蛋白,用纯化得到的融合蛋白免疫日本大耳白兔后得到抗BLCAP蛋白的多克隆抗体,通过Western blot检测证明该抗体能够与BLCAP融合蛋白发生特异性结合。结论:重组质粒表达的BLCAP融合蛋白具有良好的抗原性,制备的抗BLCAP的多克隆抗体特异性较好,为今后进一步研究BLCAP蛋白性质与功能奠定了基础。     

环丙沙星单克隆抗体的制备

【目的】制备环丙沙星(Crprofloxacin,CPFX)单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb),并对其免疫学特性进行鉴定,为畜产品CPFX残留的快速检测提供技术支持。【方法】采用碳二亚胺法(EDC),将载体蛋白牛血清白蛋白(Bovine serum albumin,BSA)和鸡卵白蛋白(ovalbumin,OVA)分别与CPFX偶联合成免疫抗原CPFX-BSA和包被抗原CPFX-OVA,经紫外(UV)扫描和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)鉴定后免疫BALB/c小鼠,应用细胞融合技术筛选分泌CPFX mAb的杂交瘤细胞株,采用体内诱生腹水法制备CPFX mAb,并对其染色体核型、效价、敏感性和特异性等免疫学特性进行鉴定。【结果】UV和SDS-PAGE鉴定结果表明,人工抗原偶联成功;免疫的5只小鼠血清抗体效价均达到了1∶105左右,其中4号小鼠血清CPFX抑制效价较高且IC50最低(17.21μg/L),融合后筛选出1株敏感特异的杂交瘤细胞,命名为3D2。3D2细胞培养上清效价为1∶(1.28×103),腹水效价为1∶(1.6×105)。CPFX mAb对CPFX的IC50为9.95μg/L,对恩诺沙星的交叉反应率为128.39%,与其他同系的喹诺酮类抗生素的交叉反应率很低。【结论】获得了高效价、敏感、特异的抗CPFX mAb,为CPFX残留的快速检测奠定了技术基础。     

双峰驼TLR5抗体制备及其在淋巴结中的表达

【目的】制备兔抗双峰驼Toll样受体5（TLR5）的多克隆抗体并鉴定其活性。【方法】选择双峰驼TLR5基因序列,经软件分析选择其编码区的膜外区1~499氨基酸位为主要抗原位,再选取对应的核苷酸序列进行基因合成,并与pET-28a（+）载体连接构建重组质粒pET28a-TLR5,对其进行BamH Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切鉴定。将pET28a-TLR5转染大肠杆菌原核表达系统,用IPTG进行诱导表达,对IPTG浓度（0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0 mol/L）和诱导时间（2,3,4,5,6,7,8,9 h）进行优化。将表达的蛋白经亲和层析法纯化后免疫新西兰白兔以制备多克隆抗体,采用ELISA法检测多抗效价,用Western blot检测和免疫组化验证评价多克隆抗体的特异性。【结果】成功构建了重组质粒pET28a-TLR5,经IPTG诱导后获得了重组蛋白（大小约为57 ku）,且以包涵体的形式表达。IPTG最佳诱导表达条件为：IPTG浓度为1 mol/L,诱导时间为6 h。TLR5多抗血清效价为1∶128 000。Western blot鉴定表明,TLR5多抗血清能特异性识别目的蛋白;免疫组化结果表明,TLR5多抗能很好地识别成年双峰驼十二指肠肠系膜淋巴中的TLR5阳性细胞。【结论】成功制备出特异性良好的兔抗双峰驼TLR5多克隆抗体,能够用于TLR5的检测。     

天名精内酯酮多克隆抗体的制备

【目的】合成并鉴定天名精内酯酮人工抗原,制备天名精内酯酮多克隆抗体,为天名精内酯酮作用靶标的免疫化学定位奠定基础。【方法】通过天名精内酯酮4位羰基和盐酸氨基脲氨基的亲核加成反应制备半抗原天名精内酯酮缩氨基脲(CN),使用MS和NMR对其结构进行鉴定;采用戊二醛法将半抗原和载体蛋白牛血清蛋白(BSA)和卵清蛋白(OVA)偶联,合成天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),采用紫外吸收扫描法、红外光谱法对免疫原及包被原进行鉴定;用制备好的免疫原免疫健康BALB/c小鼠获得天名精内酯酮多克隆抗体,通过间接非竞争ELISA法测定其效价。【结果】成功制备了天名精内酯酮免疫原(CN-BSA)和包被原(CN-OVA),获得了效价为128 000的天名精内酯酮多克隆抗体。【结论】成功制备了天名精内酯酮多克隆抗体。     

急性热应激对鹅组织中NLRP3炎性小体基因表达的影响

本试验旨在研究NLRP3炎性小体在鹅热应激损伤中的作用.将27只雏鹅分为A、B和C 3组,对照组A组环境温度设为25 ℃,热应激组B组和C组分别在38 ℃和40 ℃环境下热处理1 h.采集各组雏鹅的脑、肝脏、脾脏、肺脏、空肠等组织,将A组和C组的组织制作切片进行病理学观察,并提取各组所有组织的RNA、反转录后通过荧光定量PCR法对NLRP3信号途径相关基因及下游炎症因子表达水平进行检测,并对A、B、C各组雏鹅静脉采血,用ELISA对血清中IL-1β的含量进行检测.组织切片结果显示,40 ℃热应激组的肝脏、脾脏、肺脏、空肠等组织出现明显的显微结构损伤和炎症细胞聚集增多.荧光定量结果显示热应激促进了HSP70和HSP90基因的表达,38 ℃热应激组NLRP3、ASC、Caspase-1在脾中表达水平显著高于对照组（P<0.05),IL-1β在肺组织中的表达量显著高于对照组(P<0.05),血清中IL-1β的含量也显著升高(P<0.05).试验表明热应激导致雏鹅组织炎症的发生,NLRP3炎性小体可能参与热应激处理导致的脾脏和肺脏的炎症损伤过程.     

牛乳铁蛋白单克隆抗体的制备

以LF(牛乳铁蛋白)为抗原对BALB/C小鼠进行免疫,利用杂交瘤技术进行融合,制备了3株抗牛LF的杂交瘤细胞,并对其浓度、上清效价、腹水效价、抗体亚类、分泌单克隆抗体稳性定、单克隆抗体分子量等进行鉴定。结果表明,抗体分泌稳定,腹水效价达到106,间接ELISA、Western blot结果显示3株单抗均与FL发生特异性结合;Ig亚类鉴定均为IgG,且轻链均为K链。     

鹅细小病毒单克隆抗体的制备及抗原表位区分析

采用杂交瘤细胞融合技术,获得3株能稳定分泌抗GPV特异性抗体的杂交瘤细胞株,免疫印迹结果表明:这3株单抗均能与纯化的GPV病毒子及重组VP3蛋白发生特异性反应,而与鸭肝炎病毒、鸭细小病毒、鹅源新城疫病毒无交叉反应。采用真核表达载体pCAGGS对VP3基因进行分段克隆并转染COS-1细胞表达,用单抗介导的间接免疫荧光(IFA)进行检测,结果表明:3E8株单抗与VP3蛋白135～332氨基酸(aa)和322～535aa肽段均能发生特异反应,因此可以推定3E8株单抗识别的抗原表位在VP3的322～332aa上。     

外源重组蛋白制备鹅免疫球蛋白轻链特异性多克隆抗体

采用RT-PCR方法扩增鹅免疫球蛋白轻链恒定区编码序列(GoIgCL),构建原核表达载体pET30a-IgCL,在RosettaTM(DE3)pLysS宿主菌中表达鹅免疫球蛋白轻链恒定区重组蛋白rGoCL,以纯化后rGoCL作为免疫原制备兔抗GoIgL多克隆抗体,对多抗进行鉴定分析.结果表明,rGoCL在大肠杆菌中获得可溶性表达,可代替天然分离的轻链作为免疫原制备轻链特异性抗体,多抗效价为1 204800.研究为鹅免疫球蛋白的蛋白结构、功能分析以及鹅免疫诊断试剂研发奠定基础.     

狮头鹅与乌鬃鹅Myostatin的序列和表达分析比较

Myostatin（MSTN）是调控肌肉生长发育的重要基因.本研究旨在分析该基因在广东地方鹅种狮头鹅和乌鬃鹅中序列和表达的差异.研究使用rapid-amplification of cDNA ends（RACE）技术克隆了两鹅种MSTN基因的ORF、5′和3′UTR序列,对序列进行生信分析,并对MSTN在两鹅种不同组织,及胚胎15、23 d和1 日龄的表达进行了检测. 结果发现,两鹅种MSTN基因的ORF区和3′UTR区DNA序列差异较小,5′UTR区差异较大,狮头鹅该区域存在35 bp DNA片段缺失. 两鹅种MSTN ORF区DNA和氨基酸序列与浙东白鹅、绿头野鸭和鸡一致性最高,DNA序列一致性在94.77%以上,氨基酸序列一致性在98.40%以上. MSTN在两鹅种1日龄的腿肌中特异高表达,在心、肝、脾、肺、肾和小肠中不表达或微量表达,在胚胎15 d到1日龄的腿肌中表达逐渐升高,自胚胎期23 d起,MSTN在乌鬃鹅中的表达显著高于狮头鹅.研究为进一步探究MSTN在两鹅种胚胎肌肉发育时期可能发挥的不同调控功能奠定了基础.     

一个植物半胱氨酸蛋白酶多克隆抗体的制备及其应用

半胱氨酸蛋白酶 (cysteine proteinase,CysP)是一类重要的蛋白酶家族,广泛参与植物多种生理过程。为了分析植物CysP的特性,本实验首先通过RT-PCR技术从本氏烟中扩增获得了一个编码CysP的基因(NbCysP)序列并连接至pEASYTM-T5 Zero载体,测序验证后亚克隆至原核表达载体pGEX-6P1,命名为pGEX-NbCysP;将其导入大肠埃希菌BL21plysS中诱导表达;重组表达的NbCysP融合蛋白经过亲和层析纯化,免疫兔子制备多克隆抗体,Western印迹分析显示,该抗体能和重组NbCysP蛋白发生强烈的免疫学反应且条带单一,表明所获得的CysP抗体具有良好的特异性。上述结果为进一步鉴定植物CysP的功能特性奠定了基础。