牛消化道I型肽载体克隆测序及编码蛋白结构分析

从牛瓣胃上皮提取RNA,根据已知的人、鼠、兔、羊PepT1序列设计引物,PCR扩增目的片段cDNA,扩增产物经纯化、克隆后测序。克隆测序片段为1 566 bp（DQ309694）,与其它动物已知PepT1序列比对,发现该片段位于第3~10跨膜结构域之间。牛测定序列与人、鼠、兔、羊、狗、鸡和猪PepT1相应片段核苷酸序列同源性分别为82.89%、80.14%、78.93%、96.04%、83.08%、63.90%和85.66%,相应片段氨基酸序列同源性分别为81.45%、79.62%、76.25%、94.06%、81.49%、61.41%和83.56%。对8种动物（牛、人、鼠、兔、羊、狗、鸡、猪）测序片段内氨基酸序列同源性分析表明,PepT1是高度保守的蛋白,其中跨膜结构域的氨基酸序列保守性高于膜外环。8种动物PepT1测序片段内各跨膜结构域的氨基酸序列同源性均在90%以上,第3、4、5、6、7、8、9和10跨膜结构域的氨基酸序列同源性分别为90.97%、91.07%、97.62%、93.45%、94.05%、91.67%、91.45%和95.83%。8种动物测序片段内膜外环的氨基酸序列同源性在70%~99%之间,以第4-5跨膜结构域之间膜外环的同源性最高,9-10跨膜结构域之间膜外环的同源性最低,3-4、4-5、5-6、6-7、7-8、8-9、9-10跨膜结构域之间膜外环的氨基酸序列同源性分别为77.63%、98.86%、86.72%、90.13%、91.25%、88.33%和71.74%。9-10结构域之间是1个位于细胞外的大膜外环,可能对底物的识别有重要作用,牛在此区域与鸡相同区域的氨基酸序列同源性仅为29.3%,与大鼠、狗、人、兔、猪和羊相应序列的同源性依次为65.17%、71.64%、67.16%、60.20%、73.13%和88.56%。对测序BPepT1片段编码蛋白的糖基化和磷酸化位点分析表明,测序片段编码蛋白共有6个N-糖基化位点和3个蛋白激酶C依赖性（PKC）磷酸化位点。     

牛消化道各段Ⅰ型肽载体(bPepTI)mRNA表达量的比较研究

旨在比较研究牛消化道各段牛Ⅰ型肽载体(bPepTI)mRNA的表达。本研究分别用比较Ct和标准曲线2种相对定量方法和1种绝对定量方法比较牛各段消化道上皮黏膜I型肽载体mRNA的表达量,以了解小肽在牛消化道的主要吸收部位。比较Ct法测定牛各段消化道表达量无显著统计差异(P>0.05),数值上由大到小的顺序为:空肠、回肠、盲肠、十二指肠、瘤胃、结肠、皱胃、瓣胃、网胃;标准曲线法结果表明,牛消化道各段bPepTI mRNA表达量差异显著(P<0.05),其中空肠的表达量最高,显著高于回肠(P<0.05),回肠表达量与消化道其余组织差异显著(P<0.05),其余各组织间表达量差异不显著(P>0.05);绝对定量检测到牛消化道各部位bPepTI mRNA表达量总体差异显著(P<0.05),mRNA拷贝数由高到低依次为空肠、瓣胃、网胃、瘤胃、盲肠、十二指肠、回肠、皱胃、结肠,空肠的表达量显著高于瓣胃(P<0.05),盲肠、十二指肠、回肠、皱胃之间表达量差异不显著(P>0.05)。综合本研究结果,标准曲线法和绝对定量测定牛消化道I型肽载体mRNA表达量更为准确,在牛整段消化道中I型肽载体mRNA在空肠、回肠、瓣胃、瘤胃都有高表达,应是小肽吸收的主要部位。     

应用RT-PCR方法检测牛消化道各段Ⅰ型肽载体mRNA差异表达的研究

已有的研究表明,消化道可以小肽的形式吸收氨基酸,但尚未很好地确定小肽的主要吸收部位。我们在另一项研究中对牛Ⅰ型肽载体(BPepTⅠ)第3~10结构域1566bp片段序列进行了测定(Genebank登录号:DQ309694),与绵羊相同区域片段序列同源性高达96.04%。本研究以BPepⅠ测序结果为基础,并参考绵羊的部分序列设计了跨内含子引物,荧光实时定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法测定了牛离体各段消化道黏膜或上皮组织BPepTⅠ的相对表达水平,以评估小肽在牛消化道的主要吸收部位。以持家基因β-actin为参比基因,结肠样品为校正样品(其相对表达量2-△△CT值为1),研究结果表明:在整段消化道中,BPepTⅠ的相对表达量(2-△△CT值)由高到低依次为回肠(30.62)、空肠(26.12)、瓣胃(22.61)、瘤胃(16.17)、十二指肠(11.97)、网胃(5.18)、皱胃(3.22)、盲肠(1.13)和结肠(1.00)。各段消化道BPepTⅠ相对表达量差异显著(P<0.05),其中回肠相对表达量与空肠和瓣胃差异不显著(P>0.05),与瘤胃、十二指肠、网胃、皱胃、盲肠、结肠差异显著(P<0.05);空肠相对表达量与瓣胃、瘤胃、十二指肠差异不显著(P>0.05),与网胃、皱胃、盲肠、结肠差异显著(P<0.05);网胃、皱胃、盲肠、结肠的2-△△CT值均在5.2以下,相互之间相对表达量的差异不显著(P>0.05)。由BPepTⅠ基因相对表达活性可以将牛的各段消化道分为3组,回肠、空肠、瓣胃的活性最高,其次为瘤胃和十二指肠,网胃、皱胃、盲肠、结肠则;。     

家兔Ⅰ型肽载体(PepTⅠ)基因的克隆与原核表达

用real-time PCR方法扩增家兔PepTⅠmRNA序列,通过原核表达体外获得家兔PepTⅠ蛋白,旨在制备多克隆抗体。试验通过RT-PCR方法成功扩增出2 001bp的家兔PepTI基因片段,设计特异性引物成功扩增出抗原表位相对集中的1 071bp大小的片段,构建重组表达质粒,获得融合蛋白。结果显示:家兔PepTⅠ基因片段成功的连接到pMD18-T载体上,重组克隆载体双酶切后回收目的片段分别连接到原核表达载体pET-32a、pET-28a,经转化提取质粒测序验证后表明,成功构建原核表达载体pET-32a-P、pET-28a-P,将重组质粒转化至感受态细胞BL21(DE3)后IPTG诱导,成功表达出PepTⅠ融合蛋白,目的蛋白相对分子质量大小约为44 000,与预期试验结果相符。结果表明:本试验成功扩增出家兔PepTⅠmRNA序列,并且通过原核表达获得家兔PepTI融合蛋白。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB、gE基因的克隆及其杆状病毒表达载体的构建

本试验用PCR方法扩增了牛疱疹病毒Ⅰ型(bovine herpesvirus-1,BHV-1)Bartha Nu/67株gB、gE基因片段,将其克隆到pGEM-T-easy载体。经转化、筛选、鉴定后将重组质粒经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切后,与经相同方法处理的杆状病毒转移载体pFastBacHTb连接,得到了重组质粒pFBHgB、pFBHgE。经酶切和测序鉴定后,将其转化入含穿梭载体Bacmid的感受态细胞DH10Bac,经抗性、蓝白斑筛选和PCR鉴定,得到了含gB、gE基因的重组穿梭载体。     

I型小肽载体的结构及活性调控研究进展

本文综述了I型小肽载体的结构特征及影响其活性的调控因素。     

牛疱疹病毒Ⅰ型gB基因的原核表达及产物的抗原性分析

采用PCR方法，以牛疱疹病毒Ⅰ型基因组DNA为模板扩增gB基因，克隆至pGEM—T载体。将以克隆质粒pGEM-T-gB为模板扩增的gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段分别连接至原核表达载体pET32a。获得的重组质粒分别转化感受态细胞BL21（DE3），在IPTG诱导下表达。经SDS-PAGE鉴定，gBⅠ、gBⅡ和gBⅢ基因片段在大肠埃希氏菌BL21（DE3）中以融合蛋白形式获得了表达。以磁化组氨酸蛋白纯化系统对融合蛋白纯化后，Western-blotting和ELISA分析结果表明，这些融合蛋白均与BHV-1标准阳性血清反应，可作为抗原用于牛传染性鼻气管炎ELISA检测方法的建立。     

牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法的建立

根据牛口蹄疫O型3个拓扑型VP1序列设计3条合成肽,以此为包被抗原建立牛口蹄疫O型合成肽VP1结构蛋白ELISA抗体检测方法,并对该方法敏感性、特异性和重复性进行验证。结果显示,该方法敏感性为96.7%,特异性为99.1%,批内和批间变异系数分别为2.1%~9.8%和3.5%~10.7%。与2种商品化试剂盒比较,符合率分别为93.5%和85.9%。结果表明,该方法敏感性好、特异性强、稳定性高,可用于牛口蹄疫O型抗体水平检测。     

甲状腺素、胰高血糖素和表皮生长因子对肉鸡小肠Ⅰ型肽转运载体mRNA表达量的影响

本试旨在研究甲状腺素、胰高血糖素(PG)和表皮生长因子(EGF)对肉鸡小肠Ⅰ型肽转运载体(PepTl)mRNA表达量的影响.选择体重无差异的25日龄雄性肉仔鸡30只,分为5组,每组6只鸡,分别接受不同激素处理,每天1次,连续5 d.对照组、EGF组、PG组分别皮下注射蒸馏水0.20 mL/kg、EGF 0.03 mg/...     

表达牛呼吸道合胞体病毒G蛋白基因的重组Ⅰ型牛疱疹病毒的构建与鉴定

为构建表达牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)G蛋白基因的牛疱疹病毒Ⅰ型(BHV-1)重组病毒,本研究将人工合成的BRSV全长G蛋白基因编码序列插入到巨细胞病毒(CMV)启动子之下构建TK基因缺失转移载体。利用磷酸钙-DNA沉淀法将该转移载体与亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组DNA共转染牛鼻甲细胞后收获增殖的病毒。通过反向蚀斑筛选,得到重组病毒BHV-1/TK-/G+。PCR检测结果证实G蛋白基因已经插入到了亲本病毒BHV-1/TK-/LacZ+的基因组中,间接免疫荧光试验和western blot证实BHV-1/TK-/G+中的G蛋白基因在感染的细胞中获得了表达。本研究为研制BRSV及其他重要牛传染病的BHV-1病毒活载体疫苗奠定了基础。     

PCV2Rep蛋白N-糖基化位点突变及其真核表达载体的构建

根据GenBank发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列设计并合成引物,通过点突变的方法对其进行单点、两点和3点突变,成功获得含单点、两点和3点的突变体。设计引物扩增突变体的ORF1片段,将目的片段分别经KpnI和XbaI双酶切进而将其连接到真核表达载体pVAX1中,成功构建PCV2-pVAX1-Rep真核表达载体。此重组表达载体的成功构建为进一步研究PCV2 ORF1编码蛋白的生物学活性打下了基础。     

牛口蹄疫O型及亚洲Ⅰ型的血清学调查

口蹄疫是由口蹄疫病毒引起的一种急性、热性高度接触性人兽共患传染病,其临床特征是在口腔黏膜、四肢下端及乳房等处皮肤形成水疱和烂斑。该病传播迅速,流行面广,主要侵犯偶蹄兽,成年动物多取良性经过,幼年动物多因心肌受损而死亡率较高。     

大额牛HSL基因外显子Ⅰ部分片段的序列测定及分析

对大额牛HSL基因外显子Ⅰ部分序列进行PCR扩增、测序及氨基酸预测,并同其它牛种的资料进行了比对分析,构建了分子系统进化树。结果表明:大额牛其核苷酸序列与牦牛、普通牛、瘤牛、水牛间的同源性分别为99.6%、99.4%、99.2%、97.0%。相应的氨基酸序列大额牛与水牛的同源性为97.6%;与普通牛、瘤牛、牦牛的同源性均为99.4%,仅在第33位有1个氨基酸变异,即大额牛为异亮氨酸,而其它3个牛种均为缬氨酸,这是由该基因片段的第97位碱基发生转换(A←→G)造成的。从分子系统进化树看,瘤牛和普通牛先聚为一类,再依次与牦牛、大额牛、水牛相聚,这与传统的牛种分类结果一致。     

牛口蹄疫AsiaⅠ型灭活疫苗研究——疫苗效力、免疫持续期及安全性等检验

用选出的制苗用种素AsiaⅠ L/96的不同代次BHK-21细胞传代毒试制疫苗3批，共13.1L，在室内用健康牛进行了效力试验，保护率均达100%（5/5、5/5、5/5），对照牛全部发病（3/3、3/3、3/3）；免疫持续期测定2批次，免疫后6个月的牛血清中和抗体效价为1：20-1：120，8个月为1：8-1：60，经强毒攻击保护率达65%；保存期效力试验2批次，在2-8℃保存1a，对该疫苗的效力无影响；最小免疫剂量为每头3mL，注射免疫牛2322头，安全性良好，无不良反应。     

牛口蹄疫亚Ⅰ型抗体监测报告

免疫接种是预防传染病发生的主要手段，适宜的免疫程序对于免疫的效果起着至关重要的作用。不同群体依自身素质、环境条件和饲养管理条件等诸多因素的不同，对疫苗免疫应答反应程度有所不同。要科学合理的有效的进行免疫，需要根据群体的抗体效价变化情况进行。为此本中心在进行牛口蹄疫亚Ⅰ型免疫中，采用了牛口蹄疫亚Ⅰ型抗体监测技术，获得良好效果。现将情况报告如下。     

驴小肽转运载体1基因的克隆、序列分析及组织表达研究

小肽转运载体1(PepT1)在动物肠道小舦的摄取过程中发挥重要作用.本试验旨在研究驴(Equus asinus)PepT1(ePepT1)基因的分子克隆、序列分析和组织表达.提取驴肠道组织总RNA,PCR克隆ePepT1基因片段,测序验证并进行序列分析;采用实时荧光定量PCR(real-time qPCR)方法分别测定...     

牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型灭活疫苗效力检验豚鼠替代方法的探索

为了探索口蹄疫效力检验的替代方法,用牛口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型灭活疫苗免疫牛和豚鼠各2组,21d后分别攻击口蹄疫O型、Asia-Ⅰ型强毒,观察记录本动物及替代动物的发病情况,用Reed-muench法计算其PD50值。结果显示,豚鼠的PD50值与牛的PD50值呈一定的正相关。     

AsiaⅠ型口蹄疫双效表达载体在BHK-21细胞中的表达

将构建好的双向反义表达载体PQC-AS-P12A3C经脂质体2000转染Ampho-pack293细胞,收获假病毒,在聚凝胺的介导下将其转染到BHK-21细胞,一定时间后进行检测。通过荧光抗体染色、目的基因的整合鉴定和RT-PCR检测等表明,目的基因P12A在细胞中成功表达,且已经整合到细胞染色体基因组中,病毒抑制试验则表明重组反义质粒对FMDV的产生起到一定的抑制作用。