猪大肠杆菌K88-K99 PCR诊断试剂盒研究

根据已成功扩增的大肠杆菌K88及K99菌毛蛋白结构基因PCR反应 ,进行PCR反应体系的优化。将 2种菌毛蛋白结构基因的扩增引物混合进行PCR ,同时检测K88及K99菌毛蛋白结构基因。经优化试验 ,筛选出 5 0 μLPCR反应体系中各成分的最适用量为 :Mg2 + 浓度 2mmol L ,Taq酶 5U ,dNTPs 2 0 0mmol L ,每条引物 5 0pmol,模板量 1 0 0CFU ,并研制成功用于临床检测的PCR诊断试剂盒。     

贵州仔猪大肠杆菌分离物K88菌毛的鉴定

从贵州省７个种猪场发生腹泻的仔猪分离致病性细菌、对１６株病原细菌分离物进行了生化鉴定，１５株细菌符合然氏大肠杆菌的生化特征，其中１０株是普通大肠杆菌；５株是类大肠杆菌。两株细菌能在血琼脂平板上产生溶血素、两株细菌经抗Ｄ－甘露糖血凝试验表明能产生Ｋ８８菌毛；阳性率达１２．５％。本文还对Ｋ８８菌毛，肠毒素溶血素与仔猪大肠杆菌病的流行病学关系进行了讨论。     

黏附性菌毛K88的研究新进展

综述了近年来国内外黏附性菌毛K88的研究进展.     

仔猪大肠杆菌K88抗原筛选鉴定方法

应用玻片凝集、琼扩试验、抗Ｄ－甘露糖微量血凝试验（ＭＲＭＨ）证实所购３株大肠杆菌只表达Ｋ８８菌毛；该菌毛的特与资料报道的完全一致。通过比较上述３种方法的敏感性，本文还提出了筛选、鉴定Ｋ８８菌株的可行方法。用ＳＤＳ－ＰＡＱＧＥ分析该菌毛的粗提物表明其中含有一种分子量为２４０００Ｄａ的蛋白质，它可能就是Ｋ８８菌毛蛋白。     

大肠杆菌K88菌毛蛋白faeG亚基基因克隆及表达

利用PCR技术,从致仔猪黄痢的大肠杆菌中扩增不含信号肽序列的K88菌毛蛋白faeG亚基基因片段,将其克隆到表达载体pGEX-6P-1中,构建该基因的原核表达载体pGEX-FaeG,通过测序证明序列正确后,导入大肠杆菌BL21,得到工程菌株PGEX-FaeG。IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析结果表明,融合蛋白（约53ku）在大肠杆菌BL21中得到高效表达,表达产物约占菌体蛋白的35％,免疫印记结果表明此融合蛋白与K88单抗反应。     

仔猪黄痢K88-K99-987p-F41多价菌毛混合油乳剂灭活疫苗的制备及小鼠免疫保护试验

根据我国仔猪大肠杆菌性腹泻流行的实际情况，用产菌毛粘附因子的野生分离菌株HN2001(K88ab)、HN2002(K88ac)、HN2003(K88ad)、HN2004(k99)、C83915(987p)及C83621(F41)提取菌毛制成5批多价菌毛混合油乳剂灭活苗，5批多价灭活疫苗对小鼠的平均保护率达95.0％（38/40）。     

K88菌毛及其在仔猪断奶腹泻预防制剂开发中的应用

K88大肠杆菌是引起仔猪断奶后腹泻(PWD)的主要病原.现有商业疫苗通过母猪免疫能有效控制新生仔猪大肠杆菌性腹泻,而对PWD却难以奏效.口服疫苗能诱导肠粘膜产生局部抗体,阻止致病性大肠杆菌的粘附,进而预防PWD.从分子水平认识K88菌毛及其受体的生物学特性,对口服疫苗的研制具有重要意义.文章概述国内外关于K88菌毛基本特性、蛋白亚基及受体的研究,就K88菌毛在PWD预防制剂研发中的应用的进展作了综述,并探讨分析了口服基因工程细菌疫苗和植物疫苗的前景.     

大肠杆菌野生株K99菌毛蛋白结构基因的克隆与序列分析

根据产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,ETEC)K99菌毛蛋白的全基因序列设计产肠毒素大肠杆菌主要菌毛K99的一对引物。PCR扩增K99菌毛蛋白的全基因序列大小为546bp。将PCR扩增的目的片断克隆于pMD18-T载体、pET-32a载体中,分别转化大肠杆菌,经酶切鉴定、PCR鉴定及DNA序列分析,筛选出阳性克隆。经过序列比对,所克隆的外源基因与报道的K99菌毛蛋白结构基因序列同源性达99.3%。成功克隆分离到的产肠毒素大肠杆菌菌毛的K99基因,为当地产肠毒素性大肠杆菌病疫苗的选择及基因疫苗的研制提供了坚实的理论基础,为产肠毒素性大肠杆菌病检测、预防及基因工程疫苗的研制开辟新的途径。     

共表达ETEC K99、K88菌毛蛋白重组干酪乳杆菌的构建

将PCR扩增的K99和K88-LTB基因片段串联插入到干酪乳杆菌细胞表面表达载体pLA中,构建了重组表达载体pLA-K99-K88-LTB,将其电转化干酪乳杆菌CICC 6 105,获得了表达融合蛋白pLA-K99-K88-LTB的重组干酪乳杆菌表达系统.重组干酪乳杆菌在MRS培养基中表达后,经SDS-PAGE检测,约...     

养猪微生物发酵床垫料中大肠杆菌K88(Escherichia coli K88)生长动态分析

为明确自然条件下养猪发酵床垫料对大肠杆菌生长的影响,探究大肠杆菌(Escherichia coli)在垫料中的生长状况,采用人工接种方法,将绿色荧光蛋白(GFP)标记的大肠杆菌K88接种到养猪微生物发酵床垫料中;采用平板分离培养方法,观察大肠杆菌K88-GFP(Escherichia coli K88-GFP)在垫料中...     

K_(88).K_(99)工程菌不同佐剂苗对鸡免疫效果的比较

采用白油佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂，分别同抗原（Ｋ８８Ｋ９９工程菌）混合、乳化，制成不同的佐剂苗。以ＰＢＳ（ｐＨ７．２、０．０１ｍｏｌ／ｌ）悬浮的细菌培养物为对照，分别对产蛋鸡进行免疫，用琼扩及ＥＬＩＳＡ检测卵黄抗体。结果表明，白油苗能够诱导产生高效价（１∶１２８）卵黄抗体，而且稳定时间在３０天内。     

K88-K99-987P和K88-K99-F41佐剂苗对鸡免疫效果的比较

将猪致病性大肠杆菌K88-K999-87P和K88-K99-F412种混合菌液分别与不同的佐剂(弗氏佐剂、白油佐剂、氢氧化铝和磷酸缓冲盐溶液)混合制成8种灭活疫苗免疫产蛋鸡4次,经水稀释、絮凝澄清、盐析及亲和层析制备特异性卵黄免疫球蛋白(IgY),用SDS-PAGE检测抗体纯度和分子量、酶联免疫吸附实验(ELISA)测定抗体滴度。结果表明,与氢氧化铝乳胶苗和水苗相比,弗氏佐剂苗和白油苗均能诱导并产生稳定、高活性卵黄抗体,免疫蛋鸡所制得抗体的滴度比未免疫蛋鸡分别提高32和16倍。IgY在温度低于60℃和pH值4~8时比较稳定,胃蛋白酶在不同pH下对IgY的活性影响显著。抑菌实验表明IgY能有效抑制大肠杆菌的生长。     

ETEC K99、K88菌毛蛋白抗原表位多肽的设计合成及免疫反应

目的:通过生物信息学及蛋白分析软件等,寻找ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位。方法:通过生物信息学技术、DNAStar Protean蛋白分析软件及网络共享软件对ETEC K88、K99菌毛蛋白抗原性相关的参数进行预测分析,从而设计ETEC K88、K99菌毛蛋白的抗原表位多肽;采用腹腔注射的方式将合成的抗原表位多肽免疫小鼠,用ELISA法检测血清中产生的抗体,并对免疫小鼠进行了攻毒试验。结果:多肽免疫小鼠后均能诱导抗体产生,攻毒试验表明合成肽对小鼠具有保护作用。结论:成功预测了抗原表位,合成的表位多肽具有较好的抗原性。     

新生猪腹泻大肠杆菌K#-（88）K#-（99）双价基因工程疫苗穴位接种免疫试验

 根据中兽医理论和经络学说，对疫苗接种新途径——后海穴作了实验探索。结果证明：免疫猪用K#-（88）、K#-（99）单价强毒菌株攻击时，免疫保护指数比常规途径（皮下）接种提高10%-20%，用K#-（88）K#-（99）双价强毒菌株攻击时，免疫保护指数比皮下接种提高9.75%（5亿个菌免疫剂量）和19.15%（10亿个菌免疫剂量）。表明后海穴接种疫苗有增进免疫应答、提高免疫保护率的作用。     

K88ac-STⅡ融合基因的克隆与测序

利用重叠延伸PCR技术将K88ac STⅡ融合基因克隆于T载体上,将重组基因质粒转化到受体菌DH10B中,蓝白斑筛选阳性菌落,通过PCR、NcoI/XcoI酶切后测序,与genbank报道的K88ac结构基因序列进行比对,证明所克隆的目的片段为K88ac STII融合基因。