刚地弓形虫NT株MIC3基因的克隆和原核表达

为构建刚地弓形虫微线体蛋白3(MIC3)原核表达体系,获得高纯度MIC3蛋白用于制备单克隆抗体,评价MIC3蛋白在临床诊断方面的应用价值,根据刚地弓形虫MIC3基因编码的已知序列设计引物,应用PCR技术从刚地弓形虫NT株的基因组DNA中扩增出去除信号肽的MIC3基因,将该基因克隆入pET-32a(+)表达载体,构建pE...     

刚地弓形虫NT株P30基因的克隆与表达

参考Genbank登录的刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)P30全基因序列,设计合成1对引物,通过PCR在刚地弓形虫的基因组DNA中扩增出P30基因片段,然后构建重组表达质粒pET-32a(+)/P30,用IPTG诱导,在表达菌BL21(DE3)表达出分子量为4.83×104的融合蛋白,经Western-blotting鉴定目的蛋白具有良好的免疫学活性,为刚地弓形虫疫苗的制备及猪弓形虫抗体ELISA检测方法的建立奠定了基础.     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因的细胞免疫研究

为了进行弓形虫微线体蛋白MIC3基因的细胞免疫研究。[方法]将弓形虫微线体蛋白MIC3的真核表达质粒pcMIC3以肌肉注射的方式间隔2周3次免疫Balb/c小鼠,同时设空载体pcDNA3.1和PBS对照组。在末次免疫后2周分别以MTT比色法和CTL法测定试验小鼠脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)毒活性。[结果]与pcDNA3.1和PBS对照组相比,pcMIC3组小鼠的脾淋巴细胞的增殖应答和CTL毒活性均极显著增强(P<0.01)。[结论]该研究为弓形虫DNA疫苗的进一步研制奠定了基础。     

弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内的高效表达研究

[目的]探讨弓形虫微线体蛋白MIC3基因在大肠杆菌内高效表达的条件。[方法]通过SDS-PAGE分析,研究不同菌液密度、诱导剂IPTG浓度和诱导时间对MIC3基因在大肠杆菌中表达量的影响。[结果]MIC3基因在大肠杆菌中最适表达条件为:菌液密度OD600为0.4,诱导剂IPTG终浓度为0.4mmol/L和诱导时间3.5h。在该条件下表达的融合蛋白经初步分离提纯后,1 L培养液约含融合蛋白143mg,目的蛋白表达量占菌体总蛋白的49%。[结论]该研究为研究和制备弓形虫病的rMIC3诊断试剂奠定了基础。     

弓形虫GJS株表面抗原1基因的克隆及真核表达质粒的构建

根据GenBank数据库中的RH株弓形虫表面抗原1(SAG1)基因序列设计1对引物,应用PCR技术从弓形虫GJS株速殖子基因组DNA中扩增编码SAG1的基因片段.PCR产物经纯化、酶切后定向插入pcDNA3.1(+)真核表达载体,转化至大肠杆菌DH5α,经酶切及PCR鉴定后测序,并进行序列分析.结果表明:从弓形虫GJS株基因组DNA中扩增出1 008 bp的特异SAG1片段,大小与预测值相符,与已知的SAG1基因核苷酸序列(GenBank登录号:S76248)的ORF和氨基酸序列的同源性均为99%.     

弓形虫MAPK1基因的克隆与原核表达

为获取具有生物学活性的弓形虫MAPK1蛋白,根据Gen Bank中编码MAPK1的已知序列设计并合成1对引物,用NCoⅠ和HindⅢ双酶切后,连接到同样双酶切的原核表达载体PET-28a上,构建重组表达质粒PET-28a-MAPK1并转化至E.coli BL21感受态,用IPTG诱导表达,表达产物用Ni2+螯合柱亲和纯化,纯化后进行SDS-PAGE和Western blotting分析。结果表明:表达质粒在E.coli BL21中得到表达,克隆的MAPK1基因与Gen Bank中收录的基因序列同源性为99.9%。对重组质粒进行酶切鉴定,获得1 599 bp大小的目的基因片段,与预期结果相符,成功地构建了重组质粒PET-28a-MAPK1。Ni2+螯合柱纯化后蛋白浓度为0.26 mg/m L,可用作免疫原,经SDS-PAGE电泳显示PET-28a-MAPK1融合蛋白的分子量约为58 ku。Western blotting显示融合蛋白具有良好的抗原性。     

弓形虫棒状体蛋白15的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

【目的】克隆弓形虫（Toxoplasma gondii）RH虫株速殖子的棒状体蛋白15(ROP15)基因,原核表达、纯化重组蛋白,并制备多克隆抗体。【方法】根据GenBank登录的弓形虫RH株ROP15(DQ096561.1)基因序列设计了1对引物,以提取的弓形虫RH虫株速殖子RNA为模板,通过RT-PCR获得该虫株的ROP15基因,将该基因连接至原核表达载体pGEX-4T-1上,获得重组质粒pGEX-4T-ROP15,测序结果与预期结果一致;转化BL21(DE3)感受态细胞,经IPTG诱导获得重组融合蛋白,运用亲和层析法纯化可溶性ROP15重组蛋白,SDS-PAGE对表达和纯化的目的蛋白进行分析。用纯化的ROP15重组蛋白免疫新西兰大白兔,制备多克隆抗体,运用Western blot分析特异性。【结果】成功克隆了弓形虫RH虫株速殖子ROP15基因,大小为924 bp;菌液PCR和酶切鉴定表明重组质粒pGEX-4T-ROP15构建成功,获得了约59 ku的可溶性融合蛋白表达产物;以纯化的可溶性ROP15重组表达蛋白为抗原制备兔源性抗血清,Western blot显示该多克隆抗体与ROP...     

γ-干扰素对弓形虫MIC3的基因免疫效果研究

将编码弓形虫微线蛋白3(MIC3)的真核表达质粒pcMIC3和编码γ-干扰素(IFN-γ)的真核表达质粒pcIFN-γ各100μg混合肌肉注射,间隔2周、3次免疫Balb/c小鼠,同时设相同剂量的pcMIC3、pcDNA和PBS免疫对照组。分别以酶联免疫吸附试验(ELISA)、四氮甲唑蓝(MTT)比色法和乳酸脱氢酶释放法(LDH)检测试验小鼠血清的特异性抗体、脾淋巴细胞的增殖应答和细胞毒性T细胞(CTL)活性,并观察腹腔接种弓形虫RH株速殖子后质粒的免疫保护效果。结果表明:与其它试验组相比,pcMIC3 pcIFN-γ组试验小鼠在免疫8周后的ELISA抗体水平、脾淋巴细胞的增殖应答和CTL活性显著或极显著提高,免疫小鼠45 d时的生存率为100%,能有效抵抗小剂量弓形虫强毒株的攻击。     

弓形虫RH株表面抗原SAG3去信号肽基因的蛋白原核表达及鉴定

根据GenBank中弓形虫表面抗原SAG3基因序列,以弓形虫总RNA反转录的cDNA为模板,扩增出SAG3去除信号肽基因并进行原核表达.将重组pET-28a(+ )-SAG3阳性表达质粒转入大肠杆菌BL(DE3)中,用IPTG进行诱导表达.通过SDS- PAGE和Western blotting对重组蛋白进行分析和鉴定.结果表明:成功扩增了不合信号肽的SAG3基因,构建的原核表达质粒在大肠杆菌中得到了高效表达,能够与鼠抗弓形虫阳性血清发生特异性反应,去信号肽的SAG蛋白具有反应原性.     

刚地弓形虫RH株SAG3蛋白抗体检测的ELISA方法建立

[目的]利用纯化的刚地弓形虫RH株表面蛋白SAG3的原核重组蛋白为基础,建立抗体间接ELISA检测方法。[方法]采用棋盘滴定法,确定间接ELISA的最佳条件。采用鼠抗新孢子虫阳性血清、鼠抗安氏隐孢子虫阳性血清、鼠抗柔嫩艾美尔球虫阳性血清、鼠抗蓝氏贾第虫阳性血清以及鼠抗微小隐孢子虫阳性血清和健康小鼠阴性血清作对照,检测血清之间是否有交叉反应。[结果]最佳包被条件为:抗原包被浓度0.25μg/孔,被检血清稀释度1∶400,酶标二抗稀释度1∶3 000,封闭剂5%脱脂奶粉的PBST溶液;血清之间没有交叉反应。该方法的灵敏度为1∶1 600。[结论]该方法灵敏度高,特异性较强,可重复性较好,可用于对弓形虫感染的检测及流行病学调查。     

Construction and expression of the eukaryotic expressed plasmid of MIC3 gene from Toxoplasma gondii in IBRS-2 cells

The sequence encoding MIC3 was obtained by amplification from genomic DNA of Toxoplasma gondii RH strain and cloned into the vector pMD18-T. The target gene was subcloned into the eukaryotic vector pcDNA3.1 after the identification of pMD18-T-MIC3 by enzyme digesting, PCR amplification and sequencing. Then the target recombinant plasmids pcMIC3 were transfected into IBRS-2 cells, and the positive cells containing pcMIC3 plasmids were obtained under the selection of G418. The expressed proteins from the positive cells were detected by SDS-PAGE, Western blot and ELISA. The results showed that the DNA sequence identity was 99.9% between amplified MIC3 and that from GenBank. The molecular weight of the recombinant MIC3 protein with good immuno-activity was about 39.2 ku. These available data would lay the foundation for further studies on DNA vaccine against Toxoplasma gondii. __________ Translated from Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 2007, 38(8): 827–831 [译自: 畜牧兽医学报]     

弓形虫MIC3蛋白质的二级结构及B细胞抗原表位预测

目的：预测弓形虫MIC3的二级结构和B细胞抗原表位。方法：采用PCR技术从弓形虫RH株的基因组DNA中扩增编码MIC3的全长基因,经酶切及DNA测序鉴定,推导出相应的氨基酸序列,并与GenBank上已知氨基酸序列（登录号CAB56644）进行比对。然后采用Garnier-Robson方法、Chou-Fas-man方法和Karplus-Schulz方法预测蛋白质的二级结构;按Hopp-Woods方案、Emini方案及Jameson-Wolf方案分别预测蛋白质的亲水性、表面可能性以及抗原性指数,并综合分析预测MIC3的B细胞抗原表位。结果：根据扩增基因推导MIC3的氨基酸序列与GenBank上相应氨基酸序列的同源性达99·7%,预测其结构中含有较多的α-螺旋、少量的β-折叠、非常丰富的β-转角和一定的不规则卷曲区段,在MIC3的N端第83~94、第136~141区段和第240~243区段内或其附近最有可能是B细胞抗原表位的优势区域。结论：预测MIC3的二级结构和B细胞表位,为人工合成优势肽段进行弓形虫病的疫苗研究提供依据。     

重组抗原rMIC3-ELISA检测猪弓形虫抗体的研究

［目的］探讨检测猪弓形虫病的新方法。［方法］应用纯化的重组弓形虫微线体蛋白3（rMIC3）作为包被抗原建立间接ELISA方法,用于猪弓形虫抗体的检测。［结果］该法所用最佳抗原浓度为3.40μg/ml,最适宜的血清稀释倍数为1〖DK〗∶160,与猪瘟病毒等阳性血清不发生交叉反应,与LAT的符合率为92.56%。［结论］该方法快速、特异、重复性好,可用于猪弓形虫病的诊断和流行病学的调查。     

弓形虫自然弱毒株棒状蛋白2基因克隆及序列分析

应用PCR法从弓形虫QHO株速殖子基因组DNA中扩增ROP2的基因片断,连接到pMD18-T载体中,转化大肠杆菌JM109,经酶切及PCR鉴定后进行测序,并进行序列分析.结果表明,自然弱毒株的开放阅读框架(ORF)与ROP2基因已知序列(Z36906)的ORF具有97%的同源性,氨基酸序列具有95%的同源性.