干旱胁迫下白花柽柳抑制性消减文库的构建分析

本试验构建了PEG6000渗透胁迫下白花柽柳的抑制性消减杂交(suppression subtractive hybridization, SSH)文库。文库克隆的重组率为95 % ，插入片段大部分集中在100～1000 bp之间。通过对文库阳性克隆的随机测序，并对表达序列标签（expressed sequence tag, EST）分析得到了100个与干旱胁迫相关的EST片断，它们涉及了植物的渗透调节、信号传递、转录调控、活性氧清除、蛋白代谢、跨膜转运和离子平衡及光合作用等方面。此结果对今后进一步研究这些基因的功能奠定了基础。     

甜瓜属野生种铝胁迫诱导基因ChAI的克隆及序列分析

应用同源序列克隆策略从铝盐胁迫处理的甜瓜属野生种(Cucumis hystrix Chakr.) 叶片中获得了612bp的片段,通过在EST数据库进行同源检索,发现一条甜瓜EST序列（GenBank登录号：AM724963.2）与之高度同源,据此设计引物并经RT-PCR扩增和序列拼接,最后获得了铝诱导基因cDNA序列全长,命名为ChAI (GenBank登录号：FJ968438 )。序列分析表明该基因全长967bp,其中开放读码框(ORF)长711bp编码236个氨基酸组成的多肽,5′ 和3′ 端非编码区长度各为15bp和241bp。DNAMAN同源性分析表明该基因与葡萄、棉花、羊乳（轮叶党参）、白骨壤（真红树植物）、拟南芥等植物的铝诱导蛋白的氨基酸序列具有78.6%以上的同源性。运用半定量RT-PCR技术对ChAI 基因的转录水平进行分析,根据该基因在铝胁迫下大量表达推测ChAI 与耐铝盐胁迫响应相关,但具体耐铝胁迫机制还有待深入研究。     

鸭早期胚胎发育相关基因消减文库的构建与分析

动物胚胎发育受到多个基因的表达调控,为探索鸭早期胚胎发育的分子机制,本实验构建了鸭早期胚胎发育相关基因的消减文库,筛选与鸭早期胚胎发育相关的候选基因.采集两个不同时段的鸭(Anas platyrhynchos)胚(6和20 h)分别作为驱动组(driver)和实验组(tester),通过由双链特异性核酸酶(designatedduplexspecific nuclease,DSN)介导的消减杂交方法,构建鸭早期胚胎发育相关基因的消减文库,并进行生物信息学分析.结果表明,在构建好的文库中随机挑选216个阳性克隆进行测序,最终共得到54条有效序列,平均长度为1 084 bp.将这些序列在GenBank中进行BLAST比对,其中44条有同源基因,基因注释(geneontology,GO)显示,这些基因与代谢、建立细胞定位、生物调节等各种生物途径相关,它们在鸭早期胚胎发育过程中的不同方面(如神经系统发育、免疫调节、转录调节等)都发挥着非常重要的作用.这些差异表达基因的分离与鉴定,有助于家禽早期胚胎发育的相关研究.     

花生AhMKK4基因的克隆、表达分析和亚细胞定位研究

为挖掘花生抗逆相关基因,本研究以花生品种花育20号为试验材料,根据cDNA文库中已知的促丝裂原活化蛋白激酶激酶(MKK)基因EST序列设计引物,通过RACE-PCR克隆得到AhMKK4基因。结果表明,AhMKK4基因序列全长1 434 bp,含有3'非编码区151 bp,5'非编码区317 bp,开放阅读框全长966 bp,编码一条含有322个氨基酸的蛋白序列。预测其分子量为36.74 kDa,属于MAPKK基因家族D组成员。亚细胞定位显示AhMKK4基因定位于细胞质和细胞核中。RT-qPCR分析发现,AhMKK4基因在根中表达量高于其他组织,说明该基因具有组织表达特异性;AhMKK4基因受JA和IAA诱导时表达量上调,受SA和ABA诱导时表达量下调,说明该基因可能参与到JA和IAA介导的信号转导途径;AhMKK4在盐胁迫下表达量上调,说明该基因可能参与花生对盐胁迫的适应性调控。本研究结果为花生抗逆育种研究提供了新的基因资源。     

泸定百合过氧化氢酶(Ls-Cat1)基因的克隆及表达分析

过氧化氢酶(CAT)参与植物的多种胁迫反应。为探究百合中的CAT基因与百合抗镰刀菌病害的关系,根据百合尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)诱导的泸定百合(Lilium sargentiae Wilson)SSH文库中筛选到的CAT基因中间序列片段,通过RACE结合RT-PCR技术从泸定百合中克隆到1个CAT基因全长c DNA序列,该基因全长1 743 bp,包含1个1 479 bp的开放阅读框,编码492个氨基酸,命名为LsCat1(Gen Bank登录号:KU355272)。序列比对分析表明,Ls-Cat1编码的氨基酸序列中包含已确定的CAT保守基序。系统进化树分析显示,Ls-Cat1与其它物种CAT基因编码的氨基酸序列具有较高的相似性。qPCR结果显示,Ls-Cat1经百合镰刀菌诱导后明显上调表达,推测该基因可能与百合抗镰刀菌病害相关。本研究结果为揭示百合对镰刀菌枯萎病的抗病分子机制提供了一定的理论依据。     

茶树生长素抑制蛋白基因CsARP1的克隆与表达分析

从茶树休眠芽抑制消减杂交文库中分离得到生长素抑制蛋白基因的3＇-片段,以休眠芽为材料,利用RACE技术克隆了其cDNA全长,并利用荧光定量PCR研究了该基因在不同休眠阶段芽的相对表达量。结果从茶树休眠芽中获得一个全长为711bp的生长素抑制蛋白基因CsARP1（GenBank登录号为HQ225758）。该基因开放阅读框...     

朝鲜碱茅抗坏血酸过氧化物酶的基因克隆和表达

本研究从朝鲜碱茅叶cDNA文库分离得到序列长1125bp,开放读码框ORF区876bp,编码291个氨基酸的抗坏血酸过氧化物酶基因（PutAPx）全长cDNA。推测的编码蛋白质的相对分子质量和等电点分别为32kD和7．71。同源性比较发现,PutAPx基因与禾本科5个物种（水稻、大麦、小麦、黑麦草和玉米）在氨基酸水平上具有高度（89．7％,94．3％,94．2％,50．7％和79．6％）的同源性。系统发育树显示朝鲜碱茅与大麦、小麦遗传距离最近,跨膜结构与亚细胞定位表明为过氧化物体APX。将该基因构建到酵母表达载体pYES2-PutAPx,并导入酵母IVSCI菌株后在半乳糖的诱导下分析具有抗氧化性。本研究成功克隆了抗坏血酸过氧化物酶基因（PutAPx）编码区,并做了初步分析,为进一步研究逆境诱导的氧化胁迫的作用机理研究奠定了基础。     

小麦品种小偃22干旱诱导基因及其表达分析

利用抑制消减杂交(SSH)技术构建了小麦(Triticum aestivum)品种小偃22干旱胁迫诱导基因表达的SSH-cDNA文库,从文库中随机挑选插入片段大于400 bp的阳性克隆60个进行测序,去除冗余序列和嵌合序列后,获得了31条高质量表达序列标签(EST)序列(GenBank登录号:ES466737～ES466766,ES466799).进一步采用RT-PCR对其中的胚胎形成晚期富集蛋白基因(LEA)和△1-吡咯啉-5-羧基合成酶基因(P5CS)的表达模式进行了分析.结果表明,获得的EST序列中的26条EST序列具有功能已知的同源基因,这些基因多数不仅与植物的非生物胁迫相关,也与植物的生物胁迫反应相关,表明植物在胁迫反应中有明显的交叉适应性,其中与小麦表达序列高度同源的EST占58%.24条EST序列与功能已知蛋白的同源性较高,主要涉及植物的信号传导、能量代谢、转录调控及防卫反应等.表达模式分析表明,LEA家族蛋白D9在土壤绝对含水量达到4.8%时上调表达,在萎蔫后复水2 h时表达量最高,随着复水时间延长表达量降低并趋于稳定;PSCS基因D16在渍水条件下、严重干旱胁迫下均上调表达,而在可维持生长的水分条件下和严重干旱后复水4 h后表达量急剧下降.序列分析表明,LEA蛋白基因D9与PSCS基因D16均是部分同源基因,暂命名为TaLEA-D9和TaP5CS-D16.     

环境胁迫诱导的花生全长cDNA文库的构建及序列分析

以花生新品种闽花6号为材料,用生物和非生物因素胁迫处理植株,采用SMART技术构建了花生受低温、干旱、各种激素、缺钙及黄曲霉等胁迫诱导的混合全长cDNA文库,原始文库滴度为8.86×106 cfu,重组率达97.6％,插入片段多在1～2kb之间,平均大小为1 300bp.该cDNA文库的构建可用于花生抗逆基因的发掘,为揭示花生抗逆分子机理及花生品种改良奠定基础.     

鸡生长激素受体基因的克隆与部分序列分析

利用高盐法从鸡血中提取高分子量ＤＮＡ，以λＥＭＢＬ３为载体构建了鸡染色体文库，用鸡生长激素受体ｃＤＮＡ基因的部分序列作探针，从文库中筛选得到３个阳性克隆。通过对阳性克隆Ｉ插入片段的酶切和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交分析，表明它含有全长的鸡生长激素受体基因，建立了该基因的限制性酶切图谱。将插入片段亚克隆到ｐＧＥＭ－７Ｚｆ（＋）质粒上，对含有基因５’端序列的２．５ｋｂＥｃｏＲＩ酶切片段进行了序列分析。     

低温胁迫下高羊茅抑制消减文库的构建与分析

采用抑制消减杂交(SSH)技术构建了高羊茅"猎狗5号"低温下的正向差减cDNA文库,并从基因表达水平研究了低温诱导对高羊茅抗寒性的影响.通过Reversenorthern杂交法筛选,挑选出36个低温处理下差异表达基因,并对这些基因进行测序.将测序结果在基因组数据库(NCBI)中进行检索比对,最后获得34个差异表达的基因,其中33个基因功能已知,主要与植物信号转导、光合作用、糖代谢、物质运输以及抗逆性相关.     

甘薯茎线虫诱导抑制差减杂交cDNA文库的构建及表达序列标签分析

以甘薯(Ipomoea batatas(L.)Lam.)抗茎线虫病品种鲁薯3号为材料,利用抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)技术,构建了甘薯茎线虫诱导的甘薯块根cDNA文库.从中筛选出1379个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到185个unique EST.Blast2Go比对ESTs,并进行GO功能分类,结果发现151条非重复序列与已知基因同源性很高,占全部非重复序列的81.6%.已知功能的EST涉及植物的能量代谢、信号转导、抗病防卫、蛋白质合成等多方面.通过对已知功能的基因进行分析,推测促分裂原活化蛋白激酶、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶、过氧化氢酶、几丁质酶、葡聚糖酶等可能参与甘薯接种茎线虫后相关的抗性反应.实时荧光定量PCR分析结果表明,与抗茎线虫病相关的4个基因在甘薯接种线虫后不同时间点具有不同的表达模式.     

小麦成株抗条锈性抑制差减杂交文库构建及表达序列标签分析

以成株期抗条锈小麦(Triticum aestivum)品种兴资9104为材料,依照CLONTECH公司PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit方法构建了小麦成株期条锈菌(Puccinia striiformis)诱导的抑制差减杂交(suppression subtractive hybridization,SSH)cDNA文库。建库质量分析表明,接头连接效率高,插入片段平均300bp,文库质量较好。对文库中随机挑取的96个阳性克隆进行测序,用CAP3软件聚类拼接,得到unigenes41个。与GenBank已知序列进行Blastx分析表明,所得基因主要涉及植物的信号传导、转录调控、能量与代谢、蛋白质合成与代谢、膜转运、细胞生长分化等。利用RT-PCR对3条基因进行分析,明确其在抗病过程中的表达模式。     

华东葡萄白河-35-1株系抗霜霉病基因cDNA文库构建及EST分析

以中国原产抗霜霉病葡萄野生种华东葡萄（Vitis pseudoreticulata）白河-35-1为材料,用SMARTTM技术构建葡萄霜霉菌（Plasmopara viticola）诱导的葡萄叶片cDNA文库。经检测,原始文库滴度0.92×106 pfu/mL,重组率97%,插入片段500～2 200 bp,扩增文库滴度为5×109 pfu/mL。随机挑取克隆5'端测序,获得254条有效EST序列（GenBank登录号：FG269201~FG269449和FG396006~FG396010）。经BlastX分析,有56.3% ESTs与GenBank中功能已知基因有较高同源性,14.6%ESTs与功能尚未确定的假设蛋白或未知蛋白同源性很高,20.9%ESTs在GenBank中无匹配的同源产物。     

花生果种皮发育相关特异基因的克隆和表达分析

本实验从花生果皮种仁抑制消减文库中筛选出了一个255bp的EST序列并进行了研究。构建了花生果种皮全长cDNA库并从中筛选出该基因的全长,命名为AhPSG8。此基因全长1118bp,开放阅读框第33～833个碱基,编码266个氨基酸残基组成的多肽。由生物信息学分析表明该基因编码多个活性位点蛋白,可能与细胞内DNA的转录有关;结构分析揭示出AhPSG8具有一个跨膜区,N端是一个由20个氨基酸组成的信号肽;该基因与已发表的基因序列没有明显的同源性,为一新基因;RT—PCR研究该基因在花生中的表达,结果显示该基因在果种皮中特异表达,10～40d果皮中丰富表达,推测为与花生果种皮发育相关基因。     

花生油体蛋白家族基因的克隆和表达分析

油体蛋白是一类覆盖在油体表面的碱性小分子蛋白.油体蛋白的存在对于维护油体的稳定性非常重要,油体蛋白也是种子作为生物反应器表达重组外源蛋白的重要载体.本研究通过构建花生(A rac his hypogaea L.)未成熟种子的全长cDNA文库,测序得到284条编码油体蛋白的EST.根据编码蛋白分子量的大小可将花生油体蛋白基因分为6个亚族:AhOLE O- 16.9、AhOLEO- 17.7、AhOLEO- 18.6、AhOLEO-22、AhOLEO- 18.4和AhOLEO- 14.3 (GenBank登录号分别为:EG372527、EG373122、EG373716、EG372719、EE125019和EE124234),其中AhOLEO- 16.9,AhOLEO- 17.7和AhOLEO- 14.3分别有2个成员,其它家族的各只有1个成员.本研究首次从花生中克隆了分子较大的AhOLEO-22.cDNA芯片和半定量PCR结果表明6个亚族的油体蛋白基因在花生的不同器官和在种子不同发育时期表达模式相似,在根、茎、叶、花中几乎检测不到油体蛋白基因的表达,在种子中表达量高,在果针入土15d内几乎检测不到油体蛋白基因的表达,随着种子发育成熟油体蛋白基因的表达量逐步提高.本研究为研究花生油体蛋白基因的家族构成和利用花生油体蛋白基因提高花生含油量、生产外源蛋白等提供了有用的信息.     

Isolation and Analysis of Genes Induced by Rehydration after SeriousDrought in Broomcorn Millet (Panicum miliaceum) by Using SSH

利用抑制消减杂交(suppression subtraction hybridization，SSH)技术构建了糜子(Panicum miliaceum)干旱后复水条件与正常浇水条件下基因差异表达的SSH-cDNA文库。对其中的60个阳性克隆进行了测序，在去除冗余的cDNA后，利用NCBI的BLAST软件在GenBank 中进行核酸和蛋白质同源性的比较和功能分析。核酸比对结果表明,有32个cDNA片段与已知cDNA片段具有较高的同源性，且多数与植物受到生物或非生物胁迫时的反应机制相关，同时有11条序列与小鼠肝被手术切除后再生时产生的EST有一定同源性。蛋白分析结果显示，有28个序列与已知功能蛋白序列同源性较高，这些功能蛋白涉及植物体内的信号转导、转录调控及蛋白加工等。实验结果表明糜子在干旱复水条件下可诱导一系列特异基因的表达。