猪白细胞介素-2基因的克隆与表达

根据GenBank上发表的猪白细胞介素-2（Interleukin．2,IL-2）基因序列,设计1对引物。采用RT-PCR技术,以ConA刺激的猪外周血淋巴细胞为材料,从总RNA中扩增出484bp的特异性片段,将其克隆入pGEM-Teasy载体。序列测定表明;扩增片段为猪IL-2基因,该基因与GenBank上发表的猪IL-2基因的核苷酸序列同源性达99．8％。将其定向克隆至原核表达载体pET32a,构建了表达重组猪IL-2的基因工程菌株,经IPTG诱导表达和层析纯化,获得了纯化的重组猪IL-2蛋白。     

尿激酶原基因在小鼠体内的表达

将构建的２种重组表达质粒ｐＳＶ２－ｕＰＡ和ｐｃＤＮＡ３－ｕｐＡ分别直接注入小鼠骨骼肌,观察了Ｓｃｕ－ＰＡ ｃＤＮＡ在小鼠体内的表达情况。体外凝血试验显示注射质粒ＤＮＡ后,第５ｄ凝血时间有所延长,第１５ｄ凝血时间延长幅度最大,较对照组平均延长６ｍｉｎ左右;第２０ｄ体内诱导产生ＤＩＣ,体外凝血时间试验组较对照组延长一倍,抗凝效果明显,２种表达质粒在体内的表达水平无明显差异。     

小鼠Klf4基因的原核表达研究

[目的]对小鼠Klf4基因重组蛋白进行原核表达分析。[方法]利用双酶切从重组质粒p MXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段,克隆入p ET-41a(+)载体后转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达,探讨诱导表达最佳浓度和时间,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。[结果]重组质粒Klf4-p ET-41a(+)在IPTG诱导下可表达与预期相符的约为51 ku的KLF4蛋白;经IPTG刺激后重组蛋白表达增多,以0.8 mmol/L IPTG诱导6 h为佳;重组蛋白以包涵体形式存在于大肠杆菌BL21中。[结论]小鼠Klf4基因可在原核细胞中表达。     

兔出血症病毒在小鼠体内分布及免疫试验

应用纯化兔出血症病毒(RHDV)接种小鼠3d后剖杀,分离组织,通过电镜观察、血凝试验(HA)、RT-PCR,进行体内分布检测;同时将小鼠接种3次后10 d,分离脾淋巴细胞进行IFN-γ、IL-2、IL-4、WST检测.电镜观察未见到病毒粒子;HA检测结果为肝脏的HA价最高,肺脏最低;RT-PCR未检测到目的基因;WST检测结果表明,免疫组刺激指数高于对照组;免疫组的IFN-γ和IL-2检测指数高对照组;IL-4检测结果低于对照组.RHDV接种小鼠分离的肝脏具有血凝性,能产生良好的细胞免疫反应.     

猪RBP-4基因原核表达载体的构建及表达

为构建猪RBP-4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达蛋白。取成年母猪正常卵巢组织提取总RNA,RT-PCR后回收扩增产物,构建表达载体pEASY-E1-RBP4,转化BL21(DE3)pLysS,IPTG诱导表达。测序结果显示,RT-PCR获得的cDNA全长序列与GenBank中的序列基本一致。原核表达产物经SDS-PAGE电泳鉴定,其以包涵体形式表达。试验成功构建了猪RBP4基因原核表达载体,并在大肠杆菌中表达,为后续蛋白纯化及抗体的制备奠定基础。     

猪用生长激素脂质体对小鼠的促生长作用

[目的]研究猪用生长激素（porcine somatotropin,PST）脂质体对小鼠的促生长作用与缓释效果。[方法]将试验小鼠随机分组,试验组小鼠分别腹腔注射PST纯品和PST脂质体,对照组腹腔注射生理盐水。分别于7、14和28 d后称重,计算小鼠增重率。[结果]试验组小鼠增重与对照组差异显著（P〈0.05）,表明PST和PST脂质体对小鼠有促生长作用,且PST脂质体具有明显的缓释效果。[结论]PST脂质体缓释期长达7 d以上,具有显著的促生长效果。     

猪白介素18基因在BHK细胞中的表达

将猪白介素18(Porcine interleukin18,PIL-18)基因亚克隆到真核表达载体pEGFP-N1中,构建了重组表达质粒pEGFP-PIL-18,利用脂质体法转染BHK细胞,采用荧光显微镜实时观察和RT-PCR检测技术确定目的蛋白的表达情况.结果在转染重组质粒24 h4、8 h后的BHK细胞中均观察到绿色荧光,转染的BHK细胞经G418筛选14 d后,用RT-PCR法检测目的基因,并扩增到长576 bpd的目的cDNA片段。表明在BHK细胞中成功地表达了PIL-18与EGFP的融合蛋白,这为下一步建立稳定表达PIL-18的细胞系奠定了基础.     

5-羟色胺4受体mRNA在仔猪不同组织的表达

5-羟色胺4受体（5-HT4R）属于G-蛋白偶联受体超家族,广泛分布于中枢神经系统和外周组织中,调节多种神经递质的生理学效应.实验采用半定量RT-PCR的方法,检测和分析了猪5-HHTR的b亚型（5-HT4bR）基因mRNA在11种组织中的表达规律.结果发现,猪5-HT4bR在除肝脏以外的10种组织中都有表达,且不同组织内的表达量存在差异,其中脑组织和肠组织表达量较高.这一结果与5-HT4R基因在人和鼠上不同组织表达规律一致.     

白介素2基因与猪圆环病毒2型ORF_2基因真核双表达质粒的构建

应用基因重组技术,构建猪圆环病毒2型ORF2基因与白介素2基因(IL-2) 的真核双表达载体并将其转染CHO细胞,通过RT-PCR、间接ELISA、Western-blot、间接免疫荧光检测(IFA) 等方法验证基因的表达情况.结果表明:成功构建了猪圆环病毒2型ORF2基因和IL-2基凶的真核双表达质粒pIRES-ORF2-IL-2,该质粒可在体外同时表达ORF2和IL-2.     

宁乡猪生长激素基因的克隆及其原核表达载体的构建

[目的]研究了宁乡猪生长激素基因(nxGH)的克隆及其原核表达载体的构建。[方法]根据已报道的猪生长激素基因序列设计了1对特异性引物,应用RT"PCR技术从宁乡猪脑垂体中克隆了nxGH编码区序列。[结果]扩增片段全长651 bp,共编码216个氨基酸。该序列与已报道的三元和五指山猪生长激素cDNA基因核苷酸序列同源性为99.85%。将nxGH cDNA序列定向插入pET"32a原核表达载体中,成功构建重组原核表达质粒pET"GH。[结论]为下一步制备宁乡猪生长激素抗体奠定了基础。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1 821～+61 bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1 882 bp的片段,并构建了9个pGL3-mGH promoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110 bp以内,启动子区-218～-110 bp和-429～-218 bp间存在正向调控元件。     

猪生长激素启动子的克隆及功能分析(英文)

[目的]克隆猪生长激素启动子,确定其启动子核心序列和主要的顺式作用元件。[方法]根据NCBI上公布的序列设计引物,PCR扩增了猪生长激素5’端-1821~+61bp的序列,并通过移步缺失的方法,获得9段长短不一的启动子序列,将其分别构建到双荧光素酶表达载体pGL3-basic上。通过重组质粒瞬时转染大鼠垂体瘤细胞(GH3)、猪髋动脉血管内皮细胞(PIEC)和猪肾细胞(PK15)和转染后细胞荧光素酶活性的测定,检测这些5’末端缺失质粒在垂体及非垂体细胞中的相对转录活性。[结果]成功扩增了猪GH基因5’上游启动区1882bp的片段并构建了9个pGL3-mGHpromoter报告基因载体;双荧光素酶报告基因检测系统证实插入报告基因载体中的启动子具有非常强的细胞特异性。[结论]猪生长激素特异性在垂体细胞中表达,其最小启动子位于-110bp以内,启动子区-218~-110bp和-429~-218bp间存在正向调控元件。     

影响猪生长激素基因工程菌表达效率的因素研究

在摇瓶条件下研究了影响猪生长激素(pGH)基因工程菌表达效率的某些因素。实验结果表明:工程菌 pJW301/JA221在不同光密度时开始诱导,诱导不同时间及不同通气量对pGH 的表达效率影响较大;过夜培养物存放时间的长短及不同氨苄青霉素(Amp)浓度对表达效率稍有影响。表达载体 pJW301转化不同受体菌,其表达效率有较大差异。     

猪胎儿成纤维细胞APOE基因的差异表达研究

[目的]研究APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中的差异表达。[方法]收集正常传代生长的1、10、15、20、25、50代猪胎儿成纤维细胞,分别提取细胞总RNA。采用RT-PCR技术,检测不同代数猪胎儿成纤维细胞中APOE基因的表达。[结果]猪APOE基因在第1代猪胎儿成纤维细胞中表达水平最高,随着细胞代数的增加,表达量逐渐下降,到第50代表达量为最低。[结论]APOE基因在不同代数的猪胎儿成纤维细胞中有选择性表达的趋势。     

黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达

[目的]研究黄河鲤生长激素基因cDNA的克隆和原核高效表达。[方法] 从黄河鲤脑垂体中提取总RNA,用RT-PCR方法扩增并克隆黄河鲤的生长激素（GH）基因cDNA,分析其核苷酸序列和推测的氨基酸序列。[结果] 经克隆得到的黄河鲤生长激素基因的开放阅读框包括633个核苷酸,编码210个氨基酸,其中包括22个氨基酸的信号肽和188个氨基酸的成熟肽。将GH成熟肽的cDNA扩增并克隆入表达载体pET-28a,在大肠杆菌BL21（DE3）表达N 端含6个组氨酸的融合多肽。SDS-PAGE结果表明,0.1 mmol/L IPTG 诱导表达的蛋白约为23.5 kD,其表达量超过蛋白总量的50%,主要为不溶性的包涵体。包涵体经尿素溶解和亲和层析,获得了单一蛋白条带。[结论]该研究克隆到黄河鲤的生长激素基因,构建其原核表达质粒,得到了高效表达的基因工程菌。     

Effect of N-methyl-aspartate and Betaine on Growth Performance and Correlation Between Growth Hormone, Growth Performance and Carcass Composition in Finishing Pigs

［1］Etherton T D. Anabolic effects of porcine somatotropin on pig growth in: Designing foods: Animal product options in the marketplace. National Academy Press, Washington, DC. 1988:194 - 202. ［2］XU Z R, et al. Effect of betaine on carcass characteristics and approach to mechanism of the effect in finishing swine. Acta Veterinaria et Zootechnica Sinica, 1998, 29(5) :397 - 405. (in Chinese) ［3］Knight C D, et al. The performance and carcass composition responses of finishing swine to a range of porcine somatotropin doses in a l-week delivery system. J. Anim. Sci. 1991, 69:4678 - 4689. ［4］Zhou S W, et al. Effect of the recombinant porcine somatotropin on weight gain and carcass composition in swine. Journal of Beijing Agricultural University, 1993, 19: 93 97. (in Chinese) ［5］Danghaday W H. Double effect of growth hormone. Nature,1972..235 - 237. ［6］Estienne M J, et al. N-methyl-D, L-aspartate induced growth bermine secretion in barrows: possible mechanisms of action. J.Anim. Sci. 1996, 74:597- 602. ［7］Barb C R, et al. Aspartate and glutamate modulation of growth bormone secretion in the pig: Possible site of action. Domest.Anim. Endocrinols. 1996, 13:81 - 90. ［8］Lindstrom P, et al. Effect of N-methyl-D, L-aspartate on isotated rat somatotrophs. Endocrinology, 1992, 131: 1903 -1907.     

猪GH基因全序列PCR-RFLPs研究

实验利用PCR-RFLPs技术分析了大约克猪和长白猪GH基因的BstⅪ和HhaⅠ两种内切酶酶切位点多态性。结果表明,在所检约克夏猪和长白猪两个品种中,pGH基因全序列内仅有1个BstⅪ酶切位点,未发现BstⅪ酶切位点多态性;pGH基因全序列中存在丰富的HhaⅠ酶切位点多态性,约克夏猪中有10种带型,长白猪中检出了8种带型,其中B带型频率最高,长白猪中为41 67%,约克夏猪中占31 11%,二者差异极显著(P<0 01)。其他各带型频率分布在两品种间差异不显著。     

pGRF基因质粒对猪生长性能及血液指标的影响

研究猪生长激素释放因子(pGRF)基因质粒对猪生长性能和血液指标的影响,选用24头大白×长白二元杂交去势公猪(平均体质量17.25±0.62 kg),随机分为4个处理,每处理6个重复,分别经臀部注射0、4、6和8 mg的pGRF基因质粒.结果表明:pGRF基因质粒对猪不同生长阶段的影响不同,注射pGRF基因质粒后1～8周效果好于9～15周且促生长效果与剂量有关.整个试验期以6 mg效果最佳,日增体质量(ADG)和耗料增重比(F/G)较对照组分别提高8.02%(P<0.05)和降低7.64%(P<0.05).注射4和6 mg pGRF基因质粒能显著提高猪血液中生长激素的浓度(P<0.05).在注射pGRF基因质粒105 d后,血液中血糖、血清尿素氮和甘油三酯与对照组无显著差异.     

绵羊生长激素基因的克隆、序列分析及真核表达

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)方法,从新疆阿勒泰×中国美利奴杂交F1代绵羊脑垂体总RNA扩增出编码绵羊生长激素(oGH)基因序列,T-A克隆入载体质粒pT-Adv.测序结果表明所克隆的oGH cDNA在重组质粒的阅读框架是正确的,共含有654个碱基,其核苷酸序列与已知的3条绵羊序列相比共有7个碱基的差异,除第472位和529位的碱基差异能够引起氨基酸序列的变化外,其余均为无义突变,说明从新疆阿勒泰×中国美利奴杂交绵羊中获得的羊生长激素存在有不同品系间的基因多态性变化.将重组质粒pT-Adv/oGH cDNA定向克隆入真核表达载体质粒pcDNA3.1/myc-HisA,构建成重组oGH基因的真核表达载体pcDNA3.1A/oGH.利用脂质体转染法,将重组质粒导入到小鼠骨髓瘤(SP2/0)细胞中,经间接ELISA检测,证明在转染细胞的上清中存在有目的基因产物的外泌表达.