葡萄VvSUC12基因启动子的克隆及上游调控因子鉴定

枝干病害葡萄溃疡病近年来严重限制了葡萄产业发展。研究表明葡萄蔗糖转运蛋白参与寄主植物和病原菌的互作过程。为解析蔗糖转运蛋白VvSUC12在葡萄免疫反应过程中的功能,本研究克隆了VvSUC12基因翻译起始位点上游1 500 bp的启动子区,通过生物信息学分析发现该区域包含4个Dof转录因子结合序列(A/TAAAG)及多种激素调节与防御相关的顺式元件。实时荧光定量分析显示,接种可可毛色二孢菌显著诱导VvSUC12和VvDof19基因的表达。通过酵母单杂交实验筛选得到与VvSUC12启动子互作的转录因子VvDof19。酵母双杂交实验证实VvDof19具有自激活活性;进一步通过烟草瞬时表达发现Dof19-GFP的相对GUS活性约为对照GFP的9倍,表明转录因子VvDof19能够激活VvSUC12基因的表达。研究结果为深入研究蔗糖转运蛋白在葡萄免疫反应中的功能奠定基础。     

2016年北京地区玉蜀黍黑粉菌遗传多样性分析

 2016年从北京市10个区采集317份玉米瘤黑粉病样品,选择核糖体RNA内转录间隔区的ITS rDNA和28S rDNA基因作为持家基因,通过单核苷酸多态性技术(Single Nucleotide Polymorphism,SNP)分析北京市10个区玉蜀黍黑粉菌的遗传多样性。ITS rDNA基因分析表明,有3个菌株的序列存在1个颠换突变位点,产生两种单倍型,采用邻接法构建的系统发育树将317个菌株分为2个群体;28S rDNA基因分析表明,有54个菌株的序列存在1个颠换突变位点,产生两种单倍型,采用邻接法构建的系统发育树将317个菌株分为2个群体。中性检测表明北京市10个区的玉蜀黍黑粉菌符合中性进化模型。试验结果表明北京市10个区的玉蜀黍黑粉菌遗传多样性不高,遗传分化不明显。     

大豆胶孢炭疽菌对苯醚甲环唑的抗性机制及其抗性突变体的适合度

为明确大豆胶孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides对苯醚甲环唑的抗性风险及其抗性机制,采用药剂驯化法诱导获得其抗性突变体,并测定抗性突变体的适合度和交互抗性,同时分析抗性突变体和敏感菌株cyp51A和cyp51B基因的cDNA序列、启动区序列及相对表达量。结果表明:从大豆胶孢炭疽菌2株敏感菌株中筛选获得7株低抗苯醚甲环唑的突变体,突变频率为1.75×10^-4,其抗药性可以稳定遗传。抗性突变体与亲本敏感菌株在对温度的敏感性、菌丝生长速率、产孢量和致病力方面均存在一定差异。苯醚甲环唑与丙环唑之间存在中等交互抗性(相关系数为0.80,P<0.05),苯醚甲环唑与咪鲜胺锰盐、多菌灵、氟啶胺和吡唑醚菌酯之间无交互抗性。抗性突变体cyp51A和cyp51B基因的cDNA序列未发生核苷酸突变,cyp51A和cyp51B基因的启动区无插入片段。经苯醚甲环唑处理后,4株抗性突变体lq27-7-1、lq27-7-2、lq30-2-1和lq30-2-2的cyp51A基因相对表达量被诱导上调倍数显著高于亲本敏感菌株;3株抗性突变体lq27-7-2、lq...     

玉米MYB转录因子靶基因的全基因组预测及验证

MYB转录因子参与调控植物的生长发育及逆境应答过程。为预测MYB靶基因,本研究将Hex DIFF算法与支持向量机结合,根据已验证的MYB识别位点的核心序列及其侧翼序列构建分类模型,在玉米全基因组范围内预测MYB靶基因及其启动子。结果表明,共预测到435个MYB结合位点,其下游的424个基因判定为MYB靶基因,涉及众多生长发育过程。为验证预测结果,经凝胶迁移实验检测玉米MYB-IF25蛋白与30个预测位点的体外结合,结果有27个预测位点可以与MYB-IF25蛋白互作。GUS瞬时表达实验表明,渗透胁迫下,预测的MYB逆境相关靶基因启动子能够启动GUS基因表达,说明其具有启动活性。以上结果证明,此预测方法可靠性高,可为预测转录因子靶基因提供借鉴。     

菜蛾盘绒茧蜂畸形细胞TATA结合蛋白基因的克隆与序列分析

TATA结合蛋白(TATA-binding protein,TBP)及其相关因子是转录起始复合物TFIID的重要组分,能识别TATA元件并与之特异性结合,进而指导RNA聚合酶和其它转录因子有序装配,形成稳定的转录起始复合物。本文采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了菜蛾盘绒茧蜂Cotesia vestalis畸形细胞TATA结合蛋白(CvT-TBP)基因的cDNA序列(GenBank No.JX984954),序列全长6105 bp,开放阅读框5784 bp,编码1927个氨基酸,预测分子量213.8 kDa,理论等电点6.82。氨基酸序列分析表明,CvT-TBP与其他膜翅目昆虫的TBP有很高的同源性,其中与切叶蜂Megachile rotundata、小蜜蜂Apis florea和佛罗里达弓背蚁Camponotus floridanus的相似性均为72%。本研究克隆得到的畸形细胞TATA box结合蛋白cDNA序列,为进一步研究该基因功能以及畸形细胞的作用机理提供了基础数据。     

玉米黑粉菌CYP51基因的克隆与表达

细胞色素P450甾醇14-a-脱甲基酶(P45014DM或CYP51)是真菌细胞膜麦角甾醇生物合成过程中的一个关键酶,它的缺乏将导致膜结构的破坏和功能消失,最终导致真菌死亡。从玉米黑粉菌中克隆得到一缺失102个核苷酸的玉米黑粉菌CYP51基因,并构建重组表达载体pE30YH1-14DM。玉米黑粉菌CYP51的克隆为研究CYP51结构和功能提供了实验基础,同时也为研究其它植物病原真菌CYP51进而为设计开发新型的具有更强结合作用和更高选择性14 a-脱甲基化酶抑制剂类杀菌剂提供了实验依据。     

小麦查尔酮合成酶基因及其启动子序列的克隆与分析

查尔酮合成酶(chalcone synthase,CHS)是植物抗病抗逆过程中的一个关键酶。根据小麦抑制消减杂交中分离得到的小麦查尔酮合成酶基因片段,结合TAIL-PCR技术从小麦(Triticum aestivum L.)叶片中克隆得到查尔酮合成酶基因,命名为Ta CHS,其序列全长为2 543 bp,包含1 264 bp的启动子区、1 185 bp编码区和一个94 bp的内含子。分析显示该基因编码的氨基酸具有CHS家族的所有保守功能位点。同源性分析表明,Ta CHS与已报道的其他禾本科植物CHS基因编码的氨基酸序列同源性高达88%以上。启动子序列分析显示Ta CHS启动子区域具有光反应元件、植物激素响应元件、真菌诱导元件、M YB结合位点、TATA-Box和CAAT-Box等多种顺式作用元件。Ta CHS基因在全蚀菌侵染小麦后的表达开始上调,侵染后4 d达到最大值,之后开始下调。以上结果表明Ta CHS基因可能与小麦防御全蚀菌侵染有关。     

小麦矮腥黑粉菌及其近缘种的RPB2基因片段序列分析

以小麦矮腥黑粉菌（Tilletia controversa Kühn）及其近缘种小麦网腥黑粉菌［T. caries （DC.）Tul.］、小麦光腥黑粉菌(T. laevis Kühn)和其他6种黑粉菌的DNA为模板,用RNA聚合酶II的第2亚基RPB2基因的通用引物RPB2-740F/RPB2-1365R进行PCR扩增。结果表明,3种小麦腥黑粉菌均能扩增出617 bp大小的DNA片段,供试的其他6种黑粉菌没有任何扩增产物。利用DNAMAN软件进行序列分析结果表明,3种小麦腥黑粉菌的RPB2蛋白基因序列的相似性为99.08%,存在17个碱基的差异。利用RPB2基因的通用引物作为小麦腥黑粉菌的内置对照引物,与小麦矮腥黑粉菌的特异引物CQUTCK2/CQUTCK3相结合可提高小麦矮腥黑粉菌检测的准确性。     

腥黑粉菌属3种检疫性真菌rDNA-IGS区的扩增及其序列分析

 为了发掘腥黑粉菌属检疫性真菌的特异性分子标记,本研究对来自不同地区的3种检疫性腥黑粉菌:小麦矮腥黑穗病菌(Tilletia controversa)、小麦网腥黑穗病菌(T. caries)和小麦光腥黑穗病菌(T. foetida)的IGS区进行了PCR扩增和序列测定,其IGS1和IGS2区的长度分别为1 511~1 513bp和1 196~1 199bp,G+C含量分别为52.6%和49.0%。用DNA-MAN软件进行比对分析发现,这3种真菌在IGS1区存在不同程度的多态性,而IGS2区的保守性很强,没有特异性的碱基位点存在。依据它们在IGS1区序列的差异,设计了一对特异性引物,可用于T. foetida的分子检测,这是首次利用分子生物学技术对该菌进行鉴定。     

麦长管蚜信号传导G蛋白β亚基基因克隆与组织分布

根据所有已知G蛋白亚基的保守区设计简并性寡核苷酸引物,通过3'-和5'-RACE方法结合RT-PCR技术,从麦长管蚜中分离全长cDNA序列,并用半定量RT-PCR的方法研究基因在不同组织的转录水平.克隆的β亚基序全长1336bp,编码340个aa,推测的分子量为37.27kDa,等电点为5.56.GenBank BLAST结果表明,β亚基与冈比亚蚊Anopheles gambiae的氨基酸序列同源性最高,为93%,与果蝇Drosophila melanogaster β的同源性为90%,与线虫Caenorhabditis elegans 的同源性为85%,与哺浮动物β2的同源性为可以参与多种信号传寻途径的调控.该基因首次从麦蚜中克隆到,命名为SavGβ,在Gen Bank中的登录号为AY205294.     

芽胞杆菌CQBS03抑菌蛋白TasA基因的克隆及原核表达

为了探讨柑桔溃疡病生防菌芽胞杆菌Bacillus CQBS03菌株TasA基因的功能,采用PCR方法从CQBS03基因组DNA中扩增出编码TasA基因的全长DNA序列,并构建pEASY-E1/TasA原核表达载体,经大肠杆菌Escherichia coli表达获得TasA基因的融合表达蛋白,纸碟法检验融合蛋白对柑桔溃疡病菌Xanthomonas citri citri的抑制作用。结果显示,CQBS03菌株的TasA基因包含1个786 bp的完整开放阅读框（GenBank登录号为JQ309841）,编码261个氨基酸残基;该序列与来源于解淀粉芽胞杆菌B.amyloliquefaciens的1个已知同源TasA基因序列FJ713580的相似性达99.75%。原核表达产物经SDS-PAGE分析,检测到约31 kD的融合蛋白;纯化后的融合蛋白对柑桔溃疡病菌有明显的抑制作用,72 h后抑菌圈直径达11.5 mm。研究表明TasA基因是生防菌芽胞杆菌CQBS03抑制柑桔溃疡病菌的功能基因之一,并且该基因对原核表达宿主没有抑制作用,具有较好的开发利用前景。     

生防菌Alternaria amaranthi-3对反枝苋的防治效果

反枝苋Amaranthus retroflexus是一种世界性恶性杂草。为了确定微生物除草剂候选菌Alternaria amaranthi-3防除反枝苋的潜力,通过盆栽试验研究了接种浓度、露期和水乳剂型对A.ama-ranthi-3菌株致病力的影响。结果显示,接种浓度显著影响菌株的致病力,在48h露期条件下,接种孢子浓度为105个/mL时,菌株水剂对反枝苋幼苗生长抑制率为35.55%;浓度为107个/mL时,生长抑制率达到75.25%。露期对该菌株的致病力也有较大影响,在不保湿条件下,菌株水剂对反枝苋的生长抑制率为26.43%,而保湿48h处理的生长抑制率达到77.96%。Span80∶Tween80=1∶3的复配乳化剂和大豆油制备的水乳剂可显著降低露期对菌株防效的影响和提高菌株的致病力,无露期时,菌株水乳剂对反枝苋的生长抑制率达到88.35%,显著高于水剂;48h露期条件下,菌株水乳剂处理的生长抑制率为90.59%,而菌株水剂处理为77.96%。表明通过剂型的改进菌株Alternaria amaranthi-3能有效防除反枝苋。     

两株棒束孢菌的鉴定及其对茶卷叶蛾和茶小卷叶蛾的致病力

为明确分离自茶卷叶蛾和中华大刀螳僵虫的2株虫生真菌的归属及生防潜力,采用形态学特征和rDNA-ITS序列分析其分类地位,测定了其对茶卷叶蛾和茶小卷叶蛾幼虫的致病力,并初步筛选了其最适培养条件.结果表明:2株真菌均为环链棒束孢Isaria cateniannulata,分别命名为ICBS918和ICTL911.在1.0×10⁸孢子/mL浓度下,ICBS918和ICTL911对茶卷叶蛾幼虫的累计校正死亡率均达100%,LT₅₀分别为3.13 d和3.15 d;对茶小卷叶蛾幼虫的累计校正死亡率分别为100%和95%,LT₅₀分别为3.25 d和3.31 d.接菌后8 d,2菌株对茶卷叶蛾幼虫的LC₅₀分别为0.47×10⁵孢子/mL和1.01×10⁵孢子/mL;对茶小卷叶蛾幼虫的LC₅₀分别为2.20×10⁵孢子/mL和1.34×10⁵孢子/mL.2菌株23 ℃下最适生长培养基均为综合马铃薯培养基,最适产孢培养基均为蛋白胨马铃薯葡萄糖琼脂培养基;在萨氏培养基上,菌株ICBS918和ICTL911分别在24~30 ℃及24 ℃时生长速度最快,在27 ℃和21 ℃时产孢量最大.表明2株环链棒束孢对茶卷叶蛾和茶小卷叶蛾幼虫均具有较好的生防潜力,可作为生防菌进行开发和应用.     

Biological and biochemical responses of Biomphalaria alexandrina to some extracts of the plants Solanum siniacum and Artemisia judaica L.

The molluscicidal activity of cold water, boiled water, methanol, ethanol, acetone and chloroform extracts of Solanum siniacum and Artemisia judaica L. plants against Biomphalaria alexandrina snails was carried out. The tests revealed plant’s ethanol extract was more toxic to the snails than the other tested extracts. Therefore, it was tested against snails’ fecundity (M_x), reproduction rate (R₀) and their infection with Schistosoma mansoni miracidia. In addition, biochemical parameters and the activities of some enzymes in tissues of snails treated with the two tested plants were determined. As well, glucose concentration in snails’ hemolymph was evaluated. Exposure of B. alexandrina snails to plant’s ethanol extract led to a significant reduction in their survival and snails’ fecundity, reproduction rate. In addition, it caused a considerable reduction in the infectivity of S. mansoni miracidia to the snails. Also, it caused a reduction in number of cercariae per snail during the patent period and in the period of cercarial shedding. The results revealed that the glucose concentration in hemolymph and Lactate level in soft tissues of treated snails were increased (P < 0.001) while glycogen, total protein, the lipid content and the pyruvate level in snail’s tissues decreased (P < 0.001). The activities of lactic dehydrogenase (LDH), pyruvatekinase (PK) and cytochrome oxidase (CY) enzymes in homogenate of snail’s tissues were reduced (P < 0.001) in response to treatment with the two tested plants while protease (PR) activity increased (P < 0.001). It is concluded that the application of LC₂₅ of ethanol extract of S. siniacum and A. judaica L. may be helpful in snail control as it interferes with the snails’ biology and physiology.     

加州新小绥螨对土耳其斯坦叶螨的捕食作用

为明确加州新小绥螨Neoseiulus californicus （McGregor）对土耳其斯坦叶螨Tetranychus turkestani （Ugarov et Nikolski）的捕食潜力,采用捕食功能反应方法,研究了加州新小绥螨对土耳其斯坦叶螨各螨态的捕食作用。加州新小绥螨对雌成螨、若螨、卵的选择性捕食系数分别为0.44、1.25和1.35。在不同温度条件下,加州新小绥螨对土耳其斯坦叶螨的功能反应均属于Holling-Ⅱ型;28 ℃时捕食能力最强,对土耳其斯坦叶螨雌成螨、若螨和卵的攻击系数分别是0.6279、0.7203和0.7554,最大日捕食量分别为10.81头、28.49头和 40.82粒。在相同温度下,加州新小绥螨雌成螨寻找效应随着猎物密度的增加而降低;在相同密度下,寻找效应随温度的升高先增加后减小,在28 ℃时寻找效应最高,为0.535。加州新小绥螨的捕食作用存在较强的种内干扰作用（m=0.520）,随着捕食者密度的增大,平均捕食量逐渐减少,捕食作用率也相应降低。研究表明加州新小绥螨对土耳其斯坦叶螨具有很好的控制潜力。     

四种熏蒸剂对辣椒疫霉和南方根结线虫的毒力

为明确不同熏蒸剂对土传病原菌辣椒疫霉Phytophthora capsici和南方根结线虫Meloidogyne incognita的毒力,采用密闭熏蒸法测定了4种土壤熏蒸剂氯化苦、棉隆、威百亩、1,3-二氯丙烯的毒力及1,3-二氯丙烯和氯化苦复配的联合毒力。结果表明:氯化苦、棉隆、威百亩、1,3-二氯丙烯对辣椒疫霉的EC₅₀分别为0.12、2.44、8.30、8.45 mg/L; 对南方根结线虫的EC₅₀ 分别为1.23、0.22、0.30、0.18 mg/L。1,3-二氯丙烯和氯化苦以2:1、1:1、1:2比例复配时对辣椒疫霉的EC₅₀ 分别为1.13、0.24、0.14 mg/L;对南方根结线虫的EC₅₀分别为0.19、0.32、0.61 mg/L。结合经济效益和多种病害兼治的原则,推荐使用1,3-二氯丙烯与氯化苦1:1配比,可兼治辣椒疫病和根结线虫病。     

渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum产几丁质酶的活性及对南方根结线虫卵孵化的抑制作用

为探究卵寄生真菌产生的几丁质酶对南方根结线虫卵孵化的抑制作用,采用分离自黑龙江大豆孢囊线虫孢囊上的菌株CGMCC5328,利用NAG和pNP法测定其几丁质降解酶系和外切酶的活性,分析几丁质酶粗酶液对南方根结线虫卵的孵化抑制效果.结果表明,菌株CGMCC5328经形态学和ITS序列分析鉴定为渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum;在几丁质酶诱导培养基中培养第4天时其分泌的几丁质降解酶系达酶活高峰,为16.90 U/mL;第6天外切酶达酶活高峰,为0.59 U/mL,之后酶活趋于稳定持续至第14天;几丁质酶分子量分别为79.6、65.6、54.1、42.1和32.9 kDa;其中培养第7天的几丁质酶粗酶原液对南方根结线虫卵孵化的抑制率为83.17%;第6天菌株CGMCC5328对卵的寄生率为85.10%.表明高效产几丁质酶的卵寄生真菌渐狭蜡蚧菌菌株CGMCC5328对南方根结线虫卵孵化具有明显的抑制效果.     

小菜蛾感染玫烟色棒束孢后的病征及组织病理变化

为了明确玫烟色棒束孢对小菜蛾的致病作用,分别以1×10⁵孢子/mL和1×10⁸孢子/mL浓度的玫烟色棒束孢菌株EBCL03011孢子悬浮液感染小菜蛾幼虫,观察了感病幼虫体表和体内器官组织的病变情况。结果显示,感病虫体颜色由局部浅褐色逐渐变为大面积深褐色,病虫出现缩短、强直等外部形态的变化。组织切片观察显示,接种后4 h,附着于体壁的分生孢子开始萌发入侵;16 h后,小菜蛾内表皮被分解,菌丝段进入血腔。与此同时,被幼虫取食进入消化道的分生孢子也增殖产生菌丝段,以菌丝段突破肠壁细胞,向附近的脂肪体入侵;随着玫烟色棒束孢继续在虫体内增殖,24 h后各组织器官遭到不同程度破坏;48 h后,感病幼虫死亡,虫尸体内的菌丝突破体表,在虫体外形成菌丝层。表明玫烟色棒束孢入侵小菜蛾有两条途径,第1条为体表途径,第2条为消化道途径。     

甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测

为了探索甘蔗宿根矮化病快速检测技术,以细菌16S-23S rDNA内转录间隔区(ITS)通用引物ITS1/ITS2为第1轮引物,以甘蔗宿根矮化病菌特异引物Lxx1/Lxx2为第2轮引物,建立甘蔗宿根矮化病菌巢式PCR检测技术。巢式PCR能扩增出438 bp的目的条带,其核苷酸序列与巴西、澳大利亚及美国甘蔗宿根矮化病菌分离物核苷酸序列同源率为100%或99.8%;其检测灵敏度为10fg甘蔗宿根矮化病菌基因组DNA,较常规PCR提高100倍;样品检测结果也表明巢式PCR检测灵敏度明显优于常规PCR,可用于+1片嫩叶和心叶等微量病菌样品的检测。     

Mosquito larvicidal activity of alkaloids from Zanthoxylum lemairei against the malaria vector Anopheles gambiae

Four alkaloids, 10-O-demethyl-17-O-methylisoarnottianamide 1, 6-acetonyl-N-methyl-dihydrodecarine 2, nitidine 3, and chelerythrine 4 were isolated from the plant Zanthoxylum lemairei (Rutaceae) and evaluated for mosquito larvicidal activity against the malaria vector Anopheles gambiae. The mortalities of the larvae were determined after 24 h. The results of the larvicidal tests demonstrated that compounds 1 and 2 were the most potent with mortality rates of 96.7% and 98.3% at a concentration of 250 mg/L, respectively. Compound 3 was less potent with a mortality of 28.3% at the same concentration. The percent mortality of 100% was observed at a concentration of 500 mg/L. The least potent of the four alkaloids was compound 4, which achieved 100% mortality at 1000 mg/L. These findings could be useful in the research for newer more selective, biodegradable and natural larvicidal compounds or can be used as lead compounds for the development of larvicides.