苏云金芽孢杆菌及vip基因在不同自然环境中分布情况的比较

营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal protein,简称VIP)是苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)在营养期表达的一类新型杀虫毒蛋白,该蛋白的发现使得Bt杀虫剂在杀虫活性、杀虫范围方面得到很大突破。首次比较我国不同气候类型(热带:海南省,亚热带:广西壮族自治区,温带:黑龙江省)的Bt菌株和vip基因的分布情况。结果表明,从海南省841份土样中分离出156株Bt菌(18.55%),从广西地区1 420份土样中分离出356株Bt菌(25.07%),从黑龙江省1 010份土样中分离出167株Bt菌(16.53%);从海南省的156株Bt菌中鉴定出22个vip基因(占14.1%),从广西地区的356株Bt菌中鉴定出2个vip基因(占5.62%),然而,从黑龙江省的156株Bt菌中没有鉴定出vip基因(0%)。利用聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,简称PCR)方法成功克隆出1个vip3Aa的全长基因并获得登录号KT792883,将该基因插入到表达载体p ET-21b中,转化菌株Rosetta(DE3),在低温条件下表达88 ku的蛋白,将该蛋白进行生物活性测定,结果显示,该蛋白对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)具有较好的杀虫活性,LC50为5.124 ng/mg,对棉铃虫(Heliothis armigera)活性较低,LC50为870.1 ng/mg。研究结果显示,Bt菌株和vip基因的分布有地域性差异,在温度较高的热带、亚热带地区有比较丰富的Bt菌株和vip基因资源。研究将有利于充分利用土壤中的Bt菌株,分离具有自主知识产权和重要应用价值的新型vip抗虫基因,这将会为研究新型杀虫蛋白、延缓害虫抗性问题提供有益帮助。     

海南岛吊罗山杀棉铃虫Bt菌株的筛选

【目的】从海南岛吊罗山原始热带雨林区筛选分离杀棉铃虫Bt菌株,为研发新的防治棉铃虫的生物农药和抗虫转基因棉花奠定基础。【方法】在吊罗山原始热带雨林区不同海拔高度采集253份土壤样品,采用醋酸钠高温处理方法从中分离各类芽孢杆菌,通过显微镜观察鉴定出产伴胞晶体蛋白的苏云金芽孢杆菌(Bt),对伴胞晶体蛋白进行SDS-PAGE电泳和质谱分析,了解其基本特性。并以棉铃虫二龄幼虫为靶标,测定获得的Bt菌株对棉铃虫的杀虫活性。【结果】从253份土壤样品中分离出芽孢杆菌786株,其中产伴胞晶体蛋白的Bt菌株33株,Bt菌株分离率为4.2%。SDS-PAGE电泳和质谱分析表明,分离Bt菌株含有的伴胞晶体蛋白与已发现的毒素蛋白不同,可能为新型晶体蛋白;利用棉铃虫二龄幼虫进行Bt分离株生物活性测定,结果表明有8株Bt菌株对棉铃虫幼虫的致死率为25%~85%。【结论】从海南岛吊罗山原始热带雨林区筛选分离获得8株杀棉铃虫的Bt菌株,这些菌种可能含有新的杀虫晶体蛋白基因。     

从植物中分离苏云金芽孢杆菌的研究

 苏云金芽孢杆菌是目前研究最深入、应用最广泛的杀虫微生物,广泛分布于世界各地。从热带雨林到北极冻土带,从昆虫尸体、野生动物、动物粪便、贮藏物或尘埃、植物表面、鲜水到土壤中都有Bt存在。以植物叶片作为Bt菌株分离资源的相关研究相对较少,而非维管束植物中分离Bt菌株的报道更是屈指可数。从植物中分离Bt不但能丰富Bt的生态学意义,还能极大地丰富Bt的菌种资源。本文就植物上分离微生物、维管植物分离Bt的研究进展及非维管植物分离Bt的研究前景做简单介绍。     

污水、污泥中苏云金杆菌的分离及其基因型鉴定

从40个样品中分离到112株芽孢菌,其中有2株为Bt,占1.8%;从城市污水和啤酒厂生物处理系统中分别分离到1株Bt:采用cry1-cry11、cyt、vip3A、aiiA和inhA引物对BRC-WLY1和BRC-WLY2进行PCR扩增,发现2株Bt含有cry1(cry1Ag、cry1Ba、cry1Gb、cry1La)、cry2Ac、vip3A、aiiA杀虫基因,其中BRC-WLY1还含有inhA基因.     

食用菌异迟眼蕈蚊苏云金芽孢杆菌筛选及杀虫蛋白基因鉴定

苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis, Bt)杀虫谱广,活性高,可以很好地应用于双翅目眼蕈蚊科的防治。为了筛选出对食用菌异迟眼蕈蚊(Bradysia difformis)有高毒力的苏云金芽孢杆菌菌株,并进行杀虫蛋白基因鉴定,采用醋酸钠-抗生素法,从江苏省南京市紫金山土壤中分离产晶体芽孢杆菌,通过室内毒力测定和对食用菌菌丝影响试验逐步进行筛选,同时进行Bt杀虫蛋白基因型聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(polymerase chain reaction-restricted fragment length polymorphism, PCR-RFLP)扩增鉴定。结果从分离到的17株产晶体芽孢杆菌中筛选出7个对异迟眼蕈蚊杀虫活性的校正死亡率在50%以上且不影响食用菌菌丝生长的菌株。经16S rDNA基因序列同源性分析,这7株菌与公共数据库中苏云金芽孢杆菌菌株的同源性可达99%以上,初步认定为苏云金芽孢杆菌(B. thuringiensis)。Bt杀虫蛋白基因型鉴定发现,这7个菌株含有cry4/10、cry11、cyt1、cyt2等4个不同的毒蛋白基因型。筛选出的这7株Bt菌株对于防治食用菌异迟眼蕈蚊具有较好的开发利用潜力。     

转基因抗虫棉抗虫性与农艺性状的关系

以5个不同来源的转Bt基因抗虫品种及原始受体品种为材料进行半双列杂交并构建6个F2分离群体,对半双列杂交组合、亲本和6个F2分离群体进行田间比较试验和抗虫性鉴定,分析转入Bt基因以后转基因品种抗虫性和产量性状、纤维品质的表现.结果表明:Bt基因为显性遗传,Bt基因的引入对于杂交组合的纤维品质不具有显著的影响,但对于铃数的增加具有显著影响;在不同F2分离群体中,转基因抗虫棉的校正死亡率与烂铃率显著负相关,相关系数为-0.259～-0.495,抗性的提高对烂铃数的减少、成铃数的增加具有显著作用;不同拷贝数的转基因抗虫杂交种抗虫性不存在显著差异,Bt基因不具有明显的剂量效应.     

抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本的Bt基因类型鉴定与染色体定位

为研究抗虫杂交棉苏杂6号抗虫亲本YL02-1的Bt抗虫基因类型,抗虫性状遗传方式以及Bt基因在染色体上的插入位置,首先利用特异引物对抗虫亲本YL02-1的Bt基因来源进行PCR鉴定,结果显示,其扩增条带符合国产Bt抗虫基因引物设计的特征片段长度456 bp。而后以抗虫亲本YL02-1与非抗虫海岛棉种质系海7124杂交配组获得F_1,F_1自交获得F_2分离群体。对F_2分离群体的分析结果显示,Bt抗虫基因符合3∶1理论分离比例。进一步利用F2中含有Bt和不含Bt基因的棉株DNA构建近等基因混合池,以覆盖棉花26对染色体的234对核心引物检测混合池,共获得38对SSR多态性引物。将获得的多态性引物检测F_2分离群体基因型,发现分子标记NAU2579与目的基因连锁。已知分子标记NAU2579位于棉花第20染色体,对该分子标记上、下50 cM之内的其他分子标记进行多态性筛选,共获得17个与Bt基因连锁的分子标记,目的基因位于分子标记Gh564和NAU3813之间,其遗传距离分别为2.8 cM和12.2 cM。由此,将亲本YL02-1中的Bt抗虫基因定位于棉花第20染色体上。     

苏云金杆菌防治贮烟害虫应用研究

对从烟叶中分离到的对贮烟害虫高毒效的苏云金杆菌Bt33、Bt53、BtHB进行了系统的研究。结果表明:(1)经生理生化特性对比鉴定,菌株Bt33属科尔默亚种,血清型是H21;菌株Bt53属幕虫亚种,血清型是H2;菌株BtHB属加拿大亚种,血清型是H5a5c。(2)室内生物毒力测定,9d后Bt33、Bt53发酵原粉稀释300倍对烟草粉螟二龄幼虫防治效果均超过80%,BtHB发酵原粉稀释600倍防治效果超过80%。(3)菌剂Bt33、Bt53、BtHB在烟叶仓库中的实际防治效果,两个试验点烟叶均匀喷雾菌剂处理对烟草粉螟的防治效果好于烟包表面喷雾菌剂的处理;其中,烟叶均匀喷雾Bt53菌剂处理的防治效果最好。(4)施用苏云金杆菌菌剂防治贮烟害虫后对烟叶的化学成分无影响;卷制的单体烟香气质、香气量、烟气浓度、杂气与对照比,评吸分均有提高;刺激性、劲头、余味与对照比差异不显著。     

苏云金芽孢杆菌cry基因PCR-RFLP鉴定体系的建立

根据苏云金芽孢杆菌（Bt）cry2、cry3、cry4/cry10型基因的保守区分别设计了3对通用引物S5un2/S3un2、S5un3/S3un3和S5un4/S3un4。PCR扩增产生约1.2kb、1.4kb和1.5kb的产物,然后分别用HincⅡ/MspⅠ、Bg1Ⅱ/PstⅠ和BstEⅡ/DraⅠ酶切,并经RFLP分析鉴定Bt菌株的cry基因型。利用该方法对含已知cry2、cry3、和cry4/cry10型基因的Bt菌株和遗传工程菌进行基因分析,得到的结果与预测的RFLP相符,证明该方法可行。在此基础上对14株Bt分离株的基因型进行了鉴定,其中有9株分离株含cry2型基因;仅菌株Bt22含cry3型基因;所有被测菌株均不含cry4/cry10型基因。     

河北省不同生态区的苏云金芽孢杆菌cry基因多样性研究

为了明确苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区的分布特点和cry基因的多样性,研究从河北省不同生态地区(阜平天生桥、涞源白石山、安新白洋淀、保定郊区大田和安国中草药田)采集土样806份,采用温度-抗生素法分离获得Bt菌株46株,利用PCR-RFLP技术对46株Bt进行了基因型研究,结果表明从这些菌株中发现7种不同的基因型cry1、cry2、cry3、cry4、cry8、cry30和cry32,11株未鉴定出基因型;通过SDS-PAGE分析发现这些菌株主要表达130-150kDa、70-80kDa、60kDa和30kDa蛋白,实验结果说明了苏云金芽孢杆菌在河北省不同生态区均有分布,并且其cry基因类型是复杂多样的。     

源自动物粪便苏云金芽胞杆菌的cry基因型鉴定

从5种草食性哺乳动物的粪便中筛选获得8株苏云金芽胞杆菌(Bt);并用聚合酶链式反应—限制性酶切片段长度多态性(PCR-RFLP)鉴定体系鉴定各菌株的cry基因型.结果表明:BRC-WCB1、BRC-WCB2、BRC-WCB3、BRC-WCB8同时含有cry1和cry2基因;BRC-WCB6仅含有cry1I基因;BRC-WCB5含有cry3基因,但未出现预知的酶切条带;而BRC-WCB4无任何PCR扩增产物.     

对甜菜夜蛾高毒力Bt新菌株的PCR-RFLP分析及生物活性测定

利用PCR-RFLP对Bt.新菌株cyz-13,T4-3的基因型进行分析。结果表明,cyz-13含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Bc,cry2Ab4种基因型,其中cyz-13菌株的PCR产物的酶切片断类型不同于已知的基因类型;T4-3菌株含有cry1Aa,cry1Ac,cry1Ag,cry2Ac,cry1Ia5种基因型。室内生测结果显示,两菌株对甜菜夜蛾、粘虫、棉铃虫、玉米螟均具有高毒力,好于H D-1标准菌株。两菌株的发酵液均有杀虫活性,二者上清的杀虫因子不同。     

烟草甲虫高毒力苏云金杆菌的分离与筛选

对云南7个优质主产烟区收集的450份烤后烟样,运用4%NaCl培养基选择分离法,分离出苏云金芽孢杆菌475株。其中对含毒蛋白基因cryⅠ及cryⅤ的18个Bt菌株用2龄烟草甲虫进行生物毒力测定,试验9 d后,9个Bt菌株生物毒力测定校正死亡率均超过80%;试验12 d后,5个Bt菌株生物毒力测定校正死亡率均超过95%。同时对分离出的Bt菌进行PCR毒素蛋白基因鉴定,含cryⅠ毒素蛋白基因的Bt菌有7株,出菌率为1.47%;含cryⅤ毒素蛋白基因的Bt菌11株,出菌率为2.32%;没有含cryⅢ毒素蛋白基因的Bt菌。因此,为进一步用苏云金芽孢杆菌防治烟叶仓贮害虫提供了科学依据。     

转Bt cry1Ah/cry1Ie双价基因抗虫玉米的研究

构建了含有人工改造的抗虫基因Bt cry1Ah、cry1Ie和耐除草剂基因2mG2-epsps的植物表达载体pMUHUESGM,利用基因枪法将表达盒片段转化玉米愈伤组织,以2mG2-epsps基因为筛选标记基因,经草甘膦异丙胺盐筛选获得24株T0代再生植株,其中PCR检测阳性植株有20株。T0和T1代植株的分子检测结果证明了外源基因已经整合到玉米基因组中并能够稳定遗传和表达,转基因株系在田间生物活性检测中表现出较好的抗虫性,这为培育抗虫玉米新品种提供了参考,同时本研究中采用了基因枪片段转化法,提高了转基因的生物安全性。     

苏云金杆菌cry Ⅰ A(a)、cry Ⅰ A(b)和cry Ⅰ A(c)基因型的PCR分析鉴定

根据苏云金杆菌（Ｂａｃｉｌｕｓｔｈｕｒｉｎｇｉｅｎｓｉｓ）杀虫晶体蛋白基因的结构特点,合成了ｃｒｙⅠ基因５′端特异引物和３′端共同引物,利用ＰＣＲ扩增,使不同基因引物产生不同长度的扩增产物,通过扩增产物片段的分子量大小来确定菌株所含杀虫基因类型．本研究对福建农业大学生物技术中心分离和保存的２０个菌株进行了ｃｒｙⅠＡ（ａ～ｃ）基因类型的ＰＣＲ鉴定．结果表明：４个菌株含有ｃｒｙⅠＡ（ａ）、ｃｒｙⅠＡ（ｂ）和ｃｒｙⅠＡ（ｃ）基因,２个菌株含有ｃｒｙⅠＡ（ａ）和ｃｒｙⅠＡ（ｃ）基因,其余菌株不含所鉴定的基因类型．     

苏云金杆菌新菌株WB9 cry1基因型的PCR-RFLP分析

利用 PCR- RFLP技术对 Bt新菌株 WB9的 cry1基因型进行分析 ,结果表明该菌株含有 cry1Aa、cry1Ab、cry1Cb、cry1Fa和 cry1Ga 5种 cry1基因型 ,且 cry1Ab的酶切产物不同于正常的 cry1Ab.采用特异引物对 G1/ G2扩增 ,也证明 WB9含有 cry1Ab基因 .在此基础上 ,再利用引物对 G1/ K3un2进行扩增 ,其产物经回收纯化后用 Eco R / Xba 双酶切分析 ,结果也表明 WB9所含的 cry1Ab与众不同 ,无大片段出现且有一条 4 0 0 - 5 0 0 bp的特异片段     

Polyhedrosis Virus in Bacillus thuringiensis

This study was conducted to build a recombinant strain with highly insecticidal activity and a wide host range by using the cry1Ac and p74 gene.Firstly,the p74 gene was amplified from the genosome of Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus.The cry1Ac gene and the terminator gene of cry1Ac,named cry1Act,were amplified from the plasmid of Bt 4.0718 strain.Three T vectors,named pTp74,pT1Ac,and pT1 Act which held the aimed gene p74,cry1Ac,and cry1Act,respectively,and two middle vectors,named pTp74Act and pT1Acp74 which held the aimed fusion gene p74-cry1Act and cry1Ac-p74,respectively,were built by using pMD18-T.Then pT1Acp74 and the shuttle plasmid were digested and linked and an expressing-vector pH1Acp74 was built.Finally,pH1Acp74 was transformed into the acrystalliferous strain XBU001 and the aimed recombinant strain XBU-H1Acp74 was obtained.The expression of Bt transformant XBU-H1Acp74 was analyzed by SDS-PAGE which showed XBU-H1Acp74 could produce 130 kDa Cry1Ac protein and 50 kDa P74 protein.The insecticidal activity of transformant against Spodoptera exigua was evaluated compared with the contrast strains HTX-42(only cry1Ac gene was transformed into XBU001)after autolysis.The LC50 of HTX-42 was higher than that of the XBU-H1Acp74's,which implied that P74 could increase the efficacy and range of Bt Cry toxins in insect control.The fusion gene of cry1Ac and p74 were constructed successfully which will be served as the foundation for constructing the fusion genes of Bt cry gene and other foreign genes.     

苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株基因型的鉴定

利用聚合酶链式反应(PCR)和聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)技术鉴定苏云金芽胞杆菌LSZ9408菌株的杀虫晶体蛋白及其基因组成.PCR结果表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因型.采用5对通用引物-Un1、Un2、Un3、Un4、Un7/8进行PCR扩增,结果显示:Un1和Un2引物扩增的DNA片段大小分别为270 bp和700 bp左右,其他引物无PCR扩增产物.SDS-PAGE结果也表明:苏云金芽胞杆菌LSZ 9408菌株中含有cry1和cry2两种基因,它们编码的杀虫晶体蛋白分子量约为130 kD和65 kD.     

苏云金芽孢杆菌cry1Ea基因的克隆及 生物信息学分析

不同来源的苏云金芽孢杆菌能产生多种多样的晶体(Cry)蛋白.基于这个特性,人们可以通过基因工程的手段向工程菌中转入编码多种Cry毒素的基因来控制虫害.通过DNA重组技术,从BtHZM2菌株中克隆出了cry1Ea基因,对其进行了生物信息学分析,同源比对结果表明.cry1Ea8基因的核苷酸序列与已知cry1Ea的同源性为99.77%～99.91%.对应的氨基酸序列同源性为99.49%～99.74%.对cry1Ea8基因的分析还揭示出了cry1Ea8及其编码蛋白的一些生物和理化性质.结构域预测表明,Cry1Ea8由3个结构域组成,其中N-末端螺旋状结构域与膜插入与孔隙形成有关,而第二和第三个结构域与受体的结合有关.该研究为转基因抗虫植物和微生物杀虫工程菌的构建提供了新的基因来源.