重组蛋白H-NS对胸膜肺炎放线杆菌生物被膜形成的影响

在筛选胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacills pleuropneumoniae,APP)转座突变体库时,发现hns基因缺失突变可显著增强APP血清l型生物被膜的形成,该基因编码一种DNA结合蛋白(组蛋白样类核结构蛋白,H-NS).为了进一步研究H-NS对APP生物被膜形成的影响,实验以APP血清l型4074株基因组DNA为模板,PCR扩增了408 bp的hns基因编码区,并克隆到原核表达载体pET-28c中获得重组质粒pET28c-hns,转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3),经IPTG诱导表达和组氨酸亲和层析柱纯化获得大小约19 kD的重组蛋白rH-NS.将不同浓度的rH-NS添加到hns突变株1-21及其亲本菌株4074的培养基中,用微孔板法测定生物被膜的形成.结果显示,在不添加rH-NS时,4074株不能形成可见的生物被膜,而1-21株形成明显的生物被膜;在添加0.1～0.3μmol/L rH-NS的情况下,1-21株生物被膜的形成昔随着rH-NS浓度的升高而降低.而4074株随着rH-NS浓度的升高而升高;rH-NS添加量超过0.4 μmol/L对两个菌株生物被膜形成未见明显影响.结果表明H-NS蛋白负调控APP生物被膜的形成,并呈现一定的剂量效应.     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxIV-ELISA鉴别诊断试剂盒的研制与应用

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae, APP)是一种严重危害世界养猪业的重要病原菌，至少有15种血清型，根据所有血清型菌株仅在感染猪体内产生外毒素ApxIV的特点，建立了一种能够区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxIV-ELISA。本研究将该诊断方法进一步研制成试剂盒，对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试，与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXIV试剂盒进行了对比研究，并用该试剂盒检测了来自中国、英国、丹麦、美国、加拿大和澳大利亚的临床猪血清1453份。结果表明ApxIV-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性，与CHEKIT-APP-APXIV试剂盒的检测符合率为91.37％；三批试剂盒的批内和批间的重复性良好（变异系数均<15%）；试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好；ApxIV-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与三价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。     

实时荧光定量PCR检测胸膜肺炎放线杆菌方法的建立及应用

研究建立检测胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)的实时荧光定量PCR方法,并运用建立的检测方法对临床病料进行应用检测.根据GenBank报道的胸膜肺炎放线杆菌apxⅣA基因3'端391 bp核苷酸保守序列,设计1对特异引物扩增117 bp核苷酸片段,建立检测APP的实时荧光定量PCR方法和标准曲线,并利用该方法对收集肺脏组织和人工感染组织材料进行APP核酸定量检测.结果表明,构建的实时荧光定量PCR检测方法具有良好敏感性、特异性、重复性和临床应用性.该方法的建立为APP的临床高效诊断和APP感染的发生、发展和转归研究提供了一种有效手段.     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅳ部分基因片段的体外表达与初步应用

参照GenBank中的猪胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropeumoniae，App）血清1和3型菌株序列设计了1对特异性引物，用PCR方法扩增毒素Ⅳ（ApxⅣ）基因3’端1096bp的目的片段，然后克隆到pMD 18-T载体中，转入大肠杆菌（Eschetichia coli）的宿主菌DH5a中，提取阳性克隆质粒进行双酶切和测序鉴定，将T-载体中切下目的片段定向克隆到pET32a（＋）中，转入E．coli BL2I（DE3），经IPTG诱导可表达分子量约60kD的蛋白，免疫转印鉴定呈阳性，ApxⅣ基因体外成功表达。以纯化的表达产物包被ELISA板，初步检测了一些血清样品，结果预示表达的蛋白可用于区分灭活疫苗免疫和野毒感染。     

抗胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ的单克隆抗体的制备

分别用大肠杆菌(Escherichia coli)表达的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae)外毒素(Apx)Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ为抗原,免疫Balb/c小鼠,经细胞融合、克隆与筛选,分别获得能稳定分泌ApxⅠ、ApxⅡ和ApxⅢ单克隆抗体的杂交瘤2株(4、16)、3株(14、3Fll、16G10)和2株(44、53).这7株杂交瘤细胞的染色体数分别为87(81～94)、84(81～88)、90(85～94)、87(80～94)、82(79～85)、93(88～99)和85(82～87),其腹水ELISA效价分别为100×210、100×29、100×210、100×27、100×214、100×214和100×212.间接ELISA和Westernblot分析结果证明,所有单克隆抗体均具有与相应天然毒素的反应活性,且特异性良好.     

猪胸膜肺炎放线杆菌ApxⅣ-ELISA鉴别诊断试剂盒的研制与应用

胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniae,APP)是一种严重危害世界养猪业的重要病原菌,至少有15种血清型,根据所有血清型菌株仅在感染猪体内产生外毒素ApxⅣ的特点,建立了一种能够区分感染猪与免疫猪的鉴别诊断方法ApxⅣ-ELISA。研究在反应条件方面加以优化,将该诊断方法进一步研制成试剂盒,对其特异性、敏感性、重复性和稳定性进行了测试,与间接血凝试验及IDEXX公司的CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒进行了对比研究,并用该试剂盒检测了来自中国、英国、丹麦、美国、加拿大、澳大利亚等国的临床猪血清1453份。结果表明,ApxⅣ-ELISA试剂盒具有很高的特异性和敏感性,与CHEKIT-APP-APXⅣ试剂盒的检测符合率为91.37%;3批试剂盒的批内和批间重复性良好(变异系数均<15%);试剂盒在2～8℃保存9个月内稳定性良好。所检种猪血样中,来自中国猪场1、中国猪场2、美国、加拿大、丹麦、澳大利亚和英国的ApxⅣ抗体阳性率分别为30.05%、70.69%、39.72%、0.64%、42.22%、1.85%和93.94%;所检我国2个规模化猪场的仔猪ApxIV抗体阳性率分别为21.77%和27.15%,育肥猪的阳性率分别为5.51%和11.07%。研究表明,ApxⅣ-ELISA试剂盒能够有效区分APP感染猪与三价灭活疫苗或亚单位疫苗免疫猪。     

猪胸膜肺炎放线杆菌毒素Ⅱ基因的克隆、表达及其免疫原性

以本实验室分离的猪胸膜肺炎放线杆菌血清2型(Actinobacilluspleuropneumoniaeserotype2,APP-2)菌株HB08的基因组为模板,扩增了2871bp的APP毒素Ⅱ的结构基因apxIIA,并克隆到pET-28a原核表达载体中构建重组表达质粒pET28aIIA,转化到大肠杆菌(Escherichiacoli)BL21(DE3),经SDS-PAGE和Westernblot分析表明,表达的重组蛋白具有良好的反应活性。将表达的蛋白经或不经复性处理,与纯化的天然毒素Ⅱ分别免疫昆明小鼠,同时设PBS空白对照组,每组12只,间隔2周免疫2次,采血检测其抗体效价,二免后2周用致死剂量的APP血清7型(APP-7)菌株(1.08×108CFU(菌落形成单位,colonyformunit)/只)腹腔攻击。结果显示,复性蛋白组的保护率为83.3%,非复性蛋白组的保护率为58.3%,天然毒素蛋白对照组保护率为91.7%,空白对照组小鼠全部死亡,说明复性的重组毒素Ⅱ具有良好的免疫原性。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌毒素apxⅡA基因的真核表达及其核酸疫苗

利用PCR从自行分离鉴定的猪传染性胸膜肺炎放线杆菌（Actinobacillus pleuropneuromoniae,APP）血清7型菌株基因组DNA中扩增apxⅡA基因，构建了一个利用人类巨细胞病毒（Human cytomegalo virus，HCMV）启动子表达apxⅡA基因的真核表达质粒pCDapxⅡA，体外转染PK-15细胞，处理后的样品进行SDS-PAGE和Western blot分析，证实了免疫原性蛋白apxⅡA在细胞中表达。用表达质粒pCDapxⅡA作为核酸疫苗免疫BALB／c小鼠酶联免疫吸附试验，ELISA检测小鼠血清中特异性抗猪胸膜肺炎放线杆菌的抗体，结果第2次免疫后其抗体滴度都在1：128以上。初步证实，用apxⅡA作为核酸疫苗免疫动物可以激活机体产生免疫应答反应。     

猪传染性胸膜肺炎放线杆菌转铁结合蛋白2基因克隆、序列分析及表达

参照猪传染性胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacillus pleuropneumoniac)血清5型菌株序列ZA6774设计1对特异性引物，用PCR方法扩增转铁结合蛋白2(Tbp2)基因，得到1条1624bp的片段，然后克隆到pMD18-T载体中，经测序比较，与参考序列的核苷酸同源性达99．8％，从T-载体中切下目的片段后，定向克隆到pET32a( )中，转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)，经诱导后，SDS-PAGE电泳，Tbp2高效表达，Western-blotting鉴定呈阳性。     

中华绒螯蟹MIH基因的原核表达及其外源重组蛋白对内源性基因表达的影响

蜕皮抑制激素(molt inhibiting hormone,MIH)对甲壳动物的蜕壳生长起着至关重要的调控作用.本研究通过优化MIH基因的原核表达条件,获得其外源重组蛋白,研究了外源重组蛋白注射到中华绒螯蟹(Eriocheir sienesis)体内后,对眼柄中内源性MIH基因表达的影响.结果发现,构建的重组表达质粒(pET-28a-MIH)在27℃条件下用1.0 mmol/L的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropy-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)诱导6h,目的蛋白表达量最高,此为该基因的原核表达优化条件.进而将MIH重组蛋白注射到活体中华绒螯蟹,发现注射4h后在眼柄中的内源MIH表达水平显著高于8、24h和空白对照组,表明外源性MIH重组蛋白只能在短时期内对内源性MIH表达有促进作用,从而会在一定程度上抑制中华绒螯蟹的蜕壳.研究结果为中华绒螯蟹的蜕壳机制研究和后续的抗体制备提供了基础资料.     

用于药用蛋白生产的外源表达系统

利用外源蛋白表达系统生产具有重要价值的药用蛋白是现代生物技术产业的核心内容和研究热点,也是各国政府和制药企业竞相巨额资助的研究领域之一。本文综合分析了目前用于重组药用蛋白生产的原核表达系统、酵母表达系统、昆虫表达系统、哺乳动物表达系统和植物表达系统在表达产量、翻译后加工能力、生产周期、生产成本、适用范围等方面的优劣以及研究现状和最新研究进展,揭示出植物表达系统将在未来重组蛋白大规模生产中占据重要地位。但是现有的各种表达系统都无法单独实现各种重组蛋白高活性、低成本、安全系数高的大规模生产。在相当长时间里,各种表达系统在重组蛋白生产上将长期共存。而通过遗传改造、基因组学、蛋白质组学等研究方法不断改进各种外源蛋白表达系统的性能,不断建立更加优越的外源蛋白表达系统则是大家共同努力的目标。     

Preparation of Bioactive Recombinant Chicken Leptin Fusion Protein

将鸡Leptin成熟肽的cDNA片段插入表达载体pRSET A的Nhe Ⅰ和Hind Ⅲ两位点之间，构建重组表达质粒pLep -SCAU2并转化大肠杆菌(Escherichia coli )菌株BL21（DE3）, 将重组菌在含氨苄青霉素100 μg/mL 的LB培养基中培养至OD600大于0.6之后，经IPTG 0.05 mol/L诱导表达出分子量约为17.5 kD的含6×His标记的重组鸡Leptin，诱导4 h后表达量达最高，占总菌体蛋白的25％左右,且以包涵体形式存在。该重组鸡Leptin经50％Ni-NTA树脂纯化和透析复性折叠后分离出可溶性部分。对35日龄的矮脚黄鸡腹腔注射该可溶性重组鸡Leptin（2 mg/kg 体重）；注射后60 min内的采食量与对照组差异不显著 （P > 0.05），但在注射后80~120 min都显著低于对照组（P < 0.05）。Leptin处理公鸡的采食量在注射2 h后逐渐上升并在5.5 h时与对照组公鸡相同。但Leptin处理母鸡的采食量持续受到抑制，在注射后5.5 h时仍然显著低于对照组母鸡（P <0.01）。表明所表达的重组鸡Leptin能显著抑制鸡的采食量（母鸡比公鸡效果更为明显），证明所制备的重组鸡Leptin融合蛋白具有生物学活性。     

中慢生型天山根瘤菌中MrtR蛋白的融合表达研究及鉴定

通过PCR扩增出中慢生型天山根瘤菌中群体感应调控蛋白MrtR的基因片段,克隆至表达载体pALEX中,从而构建了原核表达质粒pALEX-mrtR.将pALEX-mrtR转化至大肠杆菌BL2/DE3菌株感受态细胞中,经IPTG诱导,表达出58 kD的GST-MnR融合蛋白.用纯化好的GST-MrtR制备多克隆抗体.经Westem blot检测,该血清可与目的蛋白发生特异性反应,证明其具有良好的免疫原性.MrtR融合蛋白的成功表达及其多克隆抗体的制备为进一步研究MrtR蛋白的功能奠定了基础.     

小鼠抗病毒基因viperin的原核表达及其抗原性探索

Viperin是一种由Ⅰ型和Ⅱ型干扰素诱导的宿主蛋白,在进化上高度保守。本研究以小鼠脑组织为原材料,通过RT-PCR扩增得到包括完整open reading frame（ORF）的1 155 bp的viperin基因序列,成功亚克隆并构建了原核表达载体pET-32a-vip,将其转化到大肠杆菌Rosetta中进行原核表达。结果表明：原核表达的重组蛋白viperin主要以包涵体的形式表达,用镍离子亲和层析法获得纯度较高的viperin蛋白,为探讨原核表达的viperin抗原特性,将纯化的viperin蛋白免疫4周龄昆明小鼠,制备得到抗viperin多克隆抗体。经Western blot和IFA检测,该抗体能与真核细胞自然表达的viperin反应,特异性良好且效价高,表明原核表达的viperin具有良好的抗原性。获得的多克隆抗体为进一步研究viperin的抗病毒生物学功能奠定了良好的基础。     

中慢生型天山根瘤菌胞外多糖相关基因exo5及其在根毛吸附和生物膜形成中作用的研究

用质粒pKGL 3上的转座子随机插入失活的方法得到两个中慢生型天山根瘤菌胞外多糖缺失菌株,并通过随机引物PCR的方法确定了转座子插入的基因位点,该基因与豌豆根瘤菌的UDP-葡萄糖脱氢酶基因有高度的同源性.根毛吸附实验发现该基因缺失,导致胞外多糖缺失突变菌株在其宿主植物甘草上的根毛吸附量大大降低,同时生物膜的形成实验发现中慢生型天山根瘤菌的exo5-菌株不能像野生型菌株一样形成丰富的生物膜,也从侧面证明了根毛吸附实验的结果,初步推测胞外多糖可能通过影响中慢生型天山根瘤菌的根毛吸附过程来影响其与豆科植物的共生固氮.     

小反刍兽疫病毒重组抗原间接ELISA检测及初步应用

为了建立一种快速、特异、敏感的小反刍兽疫病毒（peste des petits ruminants virus,PPRV）血清学检测方法,本研究将PPRV血凝蛋白（H）和核蛋白（N）克隆至pET28a（＋）载体进行诱导表达,并将2种蛋白Ni柱纯化后包被ELISA反应板,建立起检测PPRV特异性抗体的间接ELISA法。结果表明在E.coli BL21（DE3）中表达出2种PPRV蛋白,将2种重组蛋白纯化后按照1：1比例混合,制备PPRV鸡尾酒抗原,成功建立了特异性强、敏感性高的PPRV间接ELISA法;最后用建立的方法对新疆伊犁、塔城、阿勒泰和喀什边境地区采集的325份山羊、789份绵羊和132份牛血清进行了抗体检测,检测结果显示均为阴性,提示在我国新疆边境地区反刍动物尚未发生PPRV感染,但需要及时进行免疫接种以建立预防PPRV从国外传入的免疫带。本研究建立的PPRV间接ELISA法为该病毒的检测提供基础,也为该病的科学防控提供参考。