中华绒螯蟹蜕皮周期中肝胰腺细胞组成的变化

取一年生未成熟中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis)幼蟹, 甲壳宽度在15~40 mm, 暂养在75 cm×50 cm×45 cm的玻璃缸内, 24 h充气, 自然光照, 每天换水1/3, 每次换水后投喂土豆、杂鱼等食物, 动物适应实验室条件1周后进行实验。为得到蜕皮后的样本, 将处于蜕皮前晚期的个体在相同条件下单独饲养。根据已报道方法, 将中华绒螯蟹的蜕皮周期分为蜕皮间期C期、蜕皮前D₀、D₁和D_3–4期、蜕皮后A-B期等5个时期。采用细胞学和组织学方法观察中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化, 结果显示, R细胞数量在蜕皮间期和蜕皮前期都占绝对优势, 虽然在蜕皮前早期D₀期数量显著下降(P<0.05), 但从D₁期开始上升, 于蜕皮前晚期D_3–4期达到最高(62.06 ± 3.92)%, 而在蜕皮后A-B期又显著降低(P<0.05)。F细胞的数量除在D₁期显著增加外(P<0.05), 其余时期的变化无统计学差异(P>0.05)。B细胞数量在蜕皮前早期D₀期显著增高(P<0.05), 随后开始下降, 直到蜕皮前晚期D_3–4期恢复到间期水平, 而蜕皮后A-B期数量又显著增高(P<0.05)。E细胞数量除在蜕皮前早期D₀期稍微上升外, 其余时期基本稳定(P>0.05)。饥饿对处于不同蜕皮时期的中华绒螯蟹肝胰腺细胞组成的影响不同, 饥饿48 h后, 处于D₀时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞数量无显著变化, B细胞和E细胞数量显著下降, F细胞数量上升。处于D₁时期的中华绒螯蟹与正常组相比, 肝胰腺R细胞、B细胞、F细胞和E细胞数量均无显著变化。说明中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺细胞组成的变化和蜕皮周期密切相关。本研究通过探讨中华绒螯蟹蜕皮过程中肝胰腺组织结构及细胞组成变化, 了解甲壳动物蜕皮过程的基础生物学现象, 并为其健康养殖提供理论基础。

     

中华绒螯蟹幼蟹蜕皮周期中肝胰腺和肌肉脂类的动态变化

以越冬后即将进入蜕皮的中华绒螯蟹幼蟹为实验对象,采用生化分析方法,研究其蜕皮周期肝胰腺及肌肉脂类的动态变化。本实验将其幼蟹蜕皮周期分为蜕皮前期(D期)、蜕皮期(E期)、蜕皮后期(AB期)和蜕皮间期(C1期和C2期)。结果发现,(1)蜕皮各期肝胰腺总脂含量变化显著,呈现为"高-低-高"的趋势,其中D期最高,AB期最低,C1、C2期开始回升;而肌肉总脂含量变化趋势与肝胰腺相反,为先上升后再下降趋势,在D期最低,AB期含量最高。(2)肝胰腺脂类中以甘油三酰(TG)为主,其次是磷脂(PL);而肌肉脂类主要是PL,其次是TG和胆固醇(CHO)。肝胰腺中TG含量为先下降后上升趋势,其中C1期含量最低,肝胰腺中的PL含量变化趋势与TC相反,AB期含量最高;肌肉中TG含量在E期最高,而此期的PL含量最低。(3)肝胰腺和肌肉的主要脂肪酸为C16∶0、C18∶1n9、C18∶1n7、C18∶2n6(LOA)、C20∶5n3(EPA)和C22∶6n3(DHA)(相对含量4%)。蜕皮周期内,肝胰腺中的饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和高度不饱和脂肪酸(HUFA)均表现为下降趋势,其中D期肝胰腺中的DHA和EPA含量最高;肌肉中的SFA和MUFA呈现为先上升后下降趋势,而肌肉中的PUFA和HUFA表现为先下降后上升趋势。研究表明,中华绒螯蟹幼蟹蜕皮周期中,肝胰腺和肌肉中的脂类成分发生了显著变化,肝胰腺中脂类可能是其蜕皮期间的主要能量来源物质之一。     

中华绒螯蟹Y-器官在蜕皮周期中的超微结构

以光镜和电镜观察处于蜕皮周期不同阶段的中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis),结果显示,中华绒螯蟹具Y-器官(YO)1对,卵圆形,直径1 5～2 0mm,苍黄色,位于头胸部鳃腔前端,大颚外侧内收肌腹缘,邻近头胸甲内侧上皮。YO细胞排列成索状,细胞索之间为血窦,YO的细胞索由一种细胞构成,细胞核质比高。YO细胞具有类似脊椎动物合成类固醇激素的典型超微结构特征,蜕皮前期YO细胞的光面内质网、管嵴状线粒体和游离核糖体丰富;蜕皮后期和蜕皮间期的内质网、线粒体和游离核糖体明显减少;青春蜕皮后的YO出现大面积细胞凋亡,YO趋向退化。     

中华绒螯蟹肝胰腺白化症的病因研究

2002年10月以来,通过逐户访问及调查问卷的形式对2001～2002年东太湖中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)养殖区"白膏症"发病症状、扣蟹的来源、投饵模式、水草覆盖率、螺蛳投入量、底泥状况、回捕率、产量等进行较为系统的调查。同时对病蟹进行寄生虫检查、病原微生物分离、回接攻毒及病变组织的电镜观察等病原学研究,结果未发现致病性生物。调查结果表明,中华绒螯蟹"白膏症"的发病率雄蟹显著高于雌蟹,其症状为甲壳发黄,头胸甲腹面下肝区发白色或青黑色,肝胰腺由正常的橘黄色变成淡黄或白色;症状严重的病蟹胸腔积水,肌肉松驰萎缩,肝胰腺呈糜烂状,鳃丝发黑。调查结果显示,"白膏症"的发生与饵料的投喂量、动植物饵料之比及水环境有着密切的联系。根据该病的主要症状及发病原因,认为该病应命名为中华绒螯蟹肝胰腺白化症。     

中华绒螯蟹肝胰腺白化症组织病理变化

采用常规石蜡切片技术和透射电镜技术,对患有肝胰腺白化症的中华绒螯蟹病变组织和细胞进行观察。发现病蟹肝胰腺、鳃、肌肉等组织细胞发生了不同程度的病变,其病理特征为肝细胞水肿、变性、坏死,细胞中脂肪颗粒锐减,线粒体水肿、嵴消失、形成空泡,内质网、溶酶体解体成小泡。鳃组织增厚,上皮细胞微绒毛排列疏松、不规则,部分线粒体嵴消失,出现膜性退化。坏死的肝细胞和鳃上皮细胞中出现细菌颗粒。肌细胞的病变主要表现为细胞核固缩,肌丝松驰、水肿、断裂、肌质网溶解形成小泡。中华绒螯蟹具有重要生理功能的肝胰腺、鳃组织发生了严重病变,使其功能损伤,不耐运输;而肌肉的松驰、肝胰腺脂肪的锐减影响了中华绒螯蟹的品质。同时,病变组织和细胞中未见病毒等生物病原,表明该病为非生物性疾病。图2表0参12     

早熟期间中华绒螯蟹肝胰腺指数、肝脂含量及脂肪酸组成的变化

实验采用称量法和气相色谱法分别测定了性早熟前后中华绒螯蟹的肝胰腺指数(HI)、肝脂含量(LC)和肝胰腺脂肪酸组成。雌雄蟹的HI和LC在早熟前后的变化趋势一致,都是早熟个体低于未成熟个体。在性早熟前,雌雄蟹的肝胰腺脂肪酸组成基本一致,只是雌蟹中C20∶5n-3较高(P<0.05)。然而,对早熟前后的个体作比较时,发现雌雄蟹变化情况有很大差异:(1)早熟雌蟹中C16∶1n-7、C16∶0和C18∶0高于未成熟雌蟹(P<0.01),而C20∶5n-3、C20∶4n-6和C22∶6n-3则低于后者(P<0.01);(2)早熟雄蟹中C18∶1高于未成熟雄蟹(P<0.05),而C14∶0(P<0.05)、C16∶1n-7(P<0.05)和C20∶5n-3(P<0.01)皆低于后者。以上结果表明:雌雄蟹在性早熟前后存在肝胰腺脂肪酸组成变化的差异,且C20∶5n-3可能主要参与成熟蜕壳和膜的构建,而C22∶6n-3可能主要参与卵巢发育和卵黄的发生。     

中华绒螯蟹蜕皮过程中肌肉、肝胰脏和甲壳中钙和磷含量的变动

对中华绒螯蟹蜕皮间期和蜕皮后24h、48h和96h肌肉、肝胰脏及甲壳中钙和磷的含量进行了测定。蜕皮后肌肉中钙的含量较间期低，但从24h到48h有所增加。肝胰脏中钙的含量在蜕皮后各时间内无显著变化，甲壳中钙的含量在蜕皮后24h到96h呈增加趋势。甲壳的矿化作用在蜕皮后96h已接近完成。蜕皮后肌肉中磷的含量较间期高，以后变化不明显。蜕皮后肝胰脏中磷的含量高于间期，甲壳中含量较间期低。蜕皮后肌肉中钙磷比迅速降低，肝胰脏中钙磷比在蜕皮后24h无明显变化，但在蜕皮后24h至96h迅速降低。中华绒螯蟹蜕皮后外表皮对钙的矿化速度显著快于磷的矿化速度。     

饥饿对中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段的脂类与肝胰腺脂类的影响

在中华绒螯蟹卵巢快速发育阶段（9-12月初），经三个月饥饿后，卵巢指数从平均3．23增加到8．19，卵巢总脂含量略有增加，绝对脂肪含量每只蟹从开始的191mg增加到513mg。但饥饿后的卵巢与正常的成熟卵巢指数及脂肪含量相比，显著降低，这说明饥饿较大影响了卵巢的正常发育和成熟；肝胰腺指数从5．85～7．48降为0．75～4．13，其绝对含量也显著降低，每只蟹平均降低1270mg，大大高于卵巢在饥饿时增加积累的脂肪，说明肝胰腺的脂肪除了转运到发育的卵巢中去以外，大部分脂肪应作为能量被消耗。饥饿期间卵巢对来源于肝胰腺长链多不饱和脂肪酸，尤其C20：5和C20：4优先选择利用，暗示这些脂肪酸是卵巢发育必需的脂肪酸，但对来源于肝胰腺的C18：3利用最低，显示C18：3不是卵巢发育的必需脂肪酸。     

莠去津对中华绒螯蟹蜕皮抑制激素表达的影响

用RT-PCR方法检测了中华绒螯蟹暴露于不同质量浓度[0(DMSO对照)、0.001、0.01、0.1、1、10 mg/L]莠去津后蜕皮抑制激素在眼柄视神经节中的表达。结果表明,低质量浓度的莠去津可诱导蜕皮抑制激素的合成分泌,其中0.1 mg/L处理组作用明显。莠去津对中华绒螯蟹的蜕皮活动有一定影响。     

中华绒螯蟹“六月黄”与成蟹肝胰腺营养成分比较

对同一年度、同一饲养环境下的中华绒螯蟹"六月黄"和后期成蟹雌、雄个体肝胰腺组织的营养成分进行了测定和比较分析。结果显示,"六月黄"的肥满度与雌性成蟹间没有显著性差异(P0.05),但肝胰腺指数极显著高于成蟹(P0.01)。"六月黄"肝胰腺中水分和灰分的含量极显著高于成蟹(P0.01),而粗脂肪含量极显著低于成蟹(P0.01),两种蟹的粗蛋白质含量没有显著差异(P0.05)。在检测到的17种氨基酸中,除"六月黄"雄蟹肝胰腺中丙氨酸的含量显著低于其雌蟹及雌、雄成蟹外(P0.05),其他16种氨基酸在"六月黄"与成蟹间均不存在显著差异(P0.05)。"六月黄"和成蟹的肝胰腺中含量最高的4种脂肪酸均为C18:1n9c、C18:2n6c、C16:0和C16:1,其总和分别占"六月黄"和成蟹肝胰腺中总脂肪酸的72.13%和69.02%(雌、雄蟹平均值)。"六月黄"的饱和脂肪酸总量显著低于成蟹(P0.05),但其单不饱和脂肪酸总量(ΣMUFA)和多不饱和脂肪酸总量(ΣPUFA)均显著高于成蟹(P0.05)。"六月黄"肝胰腺中Σn-6 PUFA的含量也极显著高于成蟹(P0.01),而Σn-3 PUFA含量二者不存在显著差异,因此"六月黄"的Σn-6/Σn-3 PUFA比率(1.42～1.44)低于成蟹(0.85～0.92)。结果表明,从总体上看,"六月黄"的营养价值较高,其肝胰腺的营养品质好于成蟹,"六月黄"养殖具有一定的产业发展前景。     

不同脂肪源饲料对中华绒螯蟹幼蟹生长、消化酶活力和脂肪酸组成的影响

选用初始体重为(2.15±0.10)g的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)雄性幼蟹,随机分为5组(每组12只幼蟹),饲喂100%鱼油组(简称F1组)、100%豆油组(F2组)、100%亚麻油组(F3组)、50%鱼油+50%豆油组(F4组)、50%鱼油+50%亚麻油组(F5组)不同脂肪源配制的5种等氮等能饲料。实验蟹单个体养殖,实验周期为112 d。结果表明,F5组体重、增重率和特定生长率都显著高于其他饲料组(P0.05),各组的蜕壳间隔和肝胰腺指数没有显著差异(P0.05)。肝胰腺组织消化酶活力测定结果表明,F1组幼蟹肝胰腺的类胰蛋白酶活力显著高于其他各组(P0.05);F3组的胃蛋白酶活力显著高于其他各组(P0.05);F1组、F2组和F4组的脂肪酶活力显著高于其他两组(P0.05);各组的淀粉酶活力差异不显著(P0.05)。脂肪酸测定结果表明,肝胰腺和肌肉中的亚油酸(LOA)(C18:2n-6)、亚麻酸(LNA)(C18:3n-3)、EPA(C20:5n-3)和DHA(C22:6n-3)等主要脂肪酸含量与饲料脂肪酸组成呈正相关关系,F1组的高度不饱和脂肪酸(HUFA)含量显著高于其余各组(P0.05),F2组的LOA含量显著高于其余各组(P0.05),F3组的LNA含量显著高于其余各组(P0.05)。本研究结果表明,以50%的豆油或亚麻油替代鱼油能促进中华绒螯蟹幼蟹的生长,但可能使幼蟹的成活率降低。以豆油或亚麻油替代鱼油会影响幼蟹胰蛋白酶、胃蛋白酶和脂肪酶的活力和肝胰腺、肌肉脂肪酸组成。     

渗透胁迫对中华绒螯蟹胚胎生化组成及消化酶活性的影响

研究了高渗与低渗胁迫对离体培养的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)不同发育期胚胎中生化成分含量及消化酶活性的影响。结果显示:从原肠期发育到出膜前期,对照组(盐度15)胚胎中蛋白含量降低(P<0.05)、胰蛋白酶与胃蛋白酶活性升高(P<0.05),脂类含量(P>0.05)和脂肪酶活性(P<0.05)降低,碳水化合物含量和淀粉酶活性均在眼点期升高(P<0.05)而在出膜前又降低(P<0.05);低渗胁迫引起胚胎蛋白含量降低(P<0.05),而高渗胁迫导致胚胎蛋白含量升高(P<0.05);高渗胁迫对胚胎脂类含量无显著影响(P>0.05),而低渗胁迫引起出膜前期胚胎中脂类含量显著降低(P<0.05);高、低渗胁迫对胚胎碳水化合物含量均无显著影响(P>0.05);除高、低渗胁迫均显著降低眼点期胚胎淀粉酶活性(P<0.05)而引起出膜前期胚胎胰蛋白酶活性略降低(P>0.05)外,低渗胁迫导致不同发育时期胚胎消化酶活性升高,而高渗胁迫导致酶活性降低;除脂肪酶外,渗透胁迫对原肠期胚胎消化酶活性的影响均具有显著性(P<0.05)。研究结果说明,蛋白质和脂类是中华绒螯蟹胚胎发育过程中重要的能源物质与结构物质,渗透胁迫通过改变中华绒螯蟹胚胎消化酶的活性进而影响胚胎对卵黄物质的分解与利用,最终影响胚胎的发育。本实验结果提示,河口盐度过高或过低均可能对中华绒螯蟹早期胚胎的发育及后期幼体的质量产生潜在的不利影响。     

Effects of dietary protein level on growth,feed utilization and digestive enzyme activity of the Chinese mitten crab,Eriocheir sinensis

A feeding trial was conducted using isoenergetic practical diets to evaluate the effects of the dietary protein level on growth performance, feed utilization and digestive enzyme activity of the Chinese mitten crab, Eriocheir sinensis. Four experimental diets were formulated containing 250, 300, 350 and 400 g kg^?1 protein and 16 kJ g^?1 gross energy. Each diet was randomly assigned to triplicate groups of juvenile crab with mean initial body weight 3.56 ± 0.16 g and mean shell width 15.31 ± 0.06 mm. Juvenile crab were reared in indoor flow‐through system consisting of 12 plastic tanks (1.0 m × 0.6 m × 0.5 m) and fed diets twice daily at 6–8% of body weight for 12 weeks. Performance was judged on the basis of growth (specific growth rate of weight, SGR_G; specific growth rate of shell width, SGR_SW), feed conversion ratio (FCR) and protein efficiency ratio (PER). A decreased FCR was observed with increasing dietary protein levels. Both SGR_G and SGR_SW significantly increased with increasing dietary protein levels up to 350 g kg^?1, whereas there were no significant differences for protein levels from 350–400 g kg^?1. Application of broken line regression analysis to SGR_G provided an estimate of 347.8 g kg^?1 dietary protein for maximal growth. The highest PER was observed in crab fed the diet containing 350 g kg^?1 protein (P < 0.05). The percent survival was not affected (P > 0.05) by the different dietary treatments. No significant differences were observed in the apparent digestibility coefficients of crude lipid and dry matter among dietary treatments (P > 0.05). However, the apparent digestibility coefficients of crude protein and energy in crab fed different protein levels significantly increased with increasing dietary protein level (P < 0.05). Both amylase and protease activities in the intestine of E. sinensis were studied. The amylase activity decreased significantly (P < 0.05) with increased dietary protein level and protease activity increased. Regression analysis showed a negative effect of inclusion of dietary protein level on amylase activity (P < 0.05). However, protease activities were found to be positively correlated (P < 0.05) with dietary protein level. The protein content of the crab significantly increased with dietary protein levels up to 350 g kg^?1 (P < 0.05), but no significant differences (P > 0.05) were founded with protein levels higher than 350 g kg^?1.     

中华绒螯蟹蜕壳过程中螯足肌肉组织学及主要蛋白质含量变化

为探讨中华绒鳌蟹(Eriocheir sinensis)蜕皮过程中肌肉生长机制,采用石蜡切片、电镜技术及生物化学方法,以中华绒鳌蟹幼蟹为对象,研究了其蜕壳过程中螯足闭螯肌肌肉的显微结构、超微结构及主要蛋白质含量的变化。结果显示,在蜕皮间期,螯足肌纤维充分伸展,多核,横截面呈不规则圆形或者多边形;肌原纤维排列有序,具有甲壳动物骨骼肌的典型特征,A带、I带及肌质网、二联体、线粒体等细胞器清晰可见。蜕皮前期,肌纤维降解以致其横截面大小不一;肌原纤维内部降解,出现腐蚀性空洞。蜕皮之后,在肌纤维末端的肌节处于超收缩状态,这些肌节长度缩短至正常长度的50%,肌纤维典型结构消失,A带、I带模糊不易区分,但肌质网、二联体、线粒体等结构仍然完整;肌纤维中间部分的肌节结构正常如蜕皮间期。生物化学研究发现,蜕皮前后螯足肌肉中肌原纤维蛋白和可溶性蛋白含量的变化同其结构特征的变化一致。本研究结果表明,中华绒螯蟹蜕皮后螯足肌肉可能的一种生长机制是通过增加新的肌节来伸长,动物刚蜕壳后,这些新形成的肌节以超收缩的形式存在,随着动物吸水身体膨大,外骨骼伸展、硬化,这些较短的肌节由于被拉伸而达到正常肌节的长度,从而完成肌肉的生长。     

PHB剂量和饲喂时间对中华绒螯蟹肝胰腺酶活力和肠道菌群多样性的影响

在配合饲料中添加不同剂量聚β-羟基丁酸酯(Poly-β-hydroxybutyrate,PHB)(0%、3%、5%和10%PHB)并饲喂不同时长(1 d、6 d、15 d和21 d),研究PHB对中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)幼蟹肝胰腺生化组成、酶活力和肠道菌群多样性的影响。结果表明,PHB对中华绒螯蟹幼蟹肝胰腺粗蛋白、粗脂肪、可溶性蛋白含量、总超氧化物歧化酶(T-SOD)和各种消化酶活力,以及肠道菌群多样性均产生一定影响,并且这种影响与饲料中PHB水平和饲喂时间有关。与对照组相比,投喂第1天,10%PHB使T-SOD、淀粉酶和脂肪酶活力显著提高(P0.05),5%和10%PHB使肠道菌群丰富度指数(Rr)显著提高(P0.05)。投喂第6天,10%PHB使淀粉酶活力显著降低(P0.05),3%和5%PHB使脂肪酶活力显著降低(P0.05),所有剂量PHB的添加均使Rr显著升高(P0.05)。投喂第15天,10%PHB使T-SOD降低(P0.05),5%和10%PHB使脂肪酶活力显著提高(P0.05),所有剂量PHB的添加使淀粉酶活力显著降低(P0.05),使Rr显著升高(P0.05)。投喂第21天,所有剂量PHB的添加使T-SOD、淀粉酶和胰蛋白酶活力显著降低(P0.05),而且降低幅度随PHB添加量增加而加大;10%PHB添加显著降低Rr(P0.05),3%和5%PHB添加对Rr无显著影响(P0.05)。因此,饲料中PHB剂量较低时,可饲喂较长时间;PHB剂量较高时,应适当缩短饲喂时间。