副溶血弧菌ZJ2003株两种铁调外膜蛋白的克隆、表达和免疫原性

从浙江省象山港网箱养殖大黄鱼病鱼分离的一株副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)ZJ2003中克隆了两种铁调外膜蛋白psuA和pvuA的基因(GenBank登录号:DQ141607、DQ141608),经PCR的方法去除两基因的信号肽编码序列后亚克隆到原核表达载体pET30a( )中,经IPTG诱导获得大量表达。表达的重组蛋白以包涵体形式存在。包涵体蛋白经尿素法纯化及梯度透析法复性后以100μg/尾的剂量免疫大黄鱼,4周后经活菌攻毒获得80%的免疫保护率。免疫印迹分析表明,人工感染存活鱼的血清可以识别此两种重组蛋白。研究结果显示该两种铁调外膜蛋白具有良好的免疫原性,有可能作为高效疫苗成份。     

副溶血弧菌与肝素结合相关黏附蛋白的鉴定

黏附因子在病原菌的致病过程中发挥了重要作用,鉴定新的黏附因子是了解病原菌致病机制的重要手段。本研究中首次发现游离肝素能够竞争性抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,表明细胞外基质中的肝素可能是细菌重要的细胞表面黏附受体。进一步利用肝素亲和层析技术垂钓到6种副溶血弧菌的外膜蛋白,并通过基因克隆和原核表达技术成功获得重组的外膜蛋白并对其进行了深入研究。重组蛋白IMPDH、EF-Tu和Opp A可黏附Hela细胞,并可以显著抑制副溶血弧菌与Hela细胞的黏附,说明这3种蛋白可能是其重要的潜在黏附因子。     

副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性研究↑（*）

本文对１３株不同来源的副溶血弧菌的外膜蛋白及其抗原性进行了比较研究。１３株副溶血弧菌的外膜蛋白有相似的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ图谱。大多数菌株有五条主要的蛋白质，其大致分子量分别为：ａ、６９ｋＤａ；ｂ、６３ｋＤａ；ｃ、４０ｋＤａ；ｄ、３０ｋＤａ；ｅ、２８ｋＤａ。其中蛋白质ｂ是所有菌株共有的。与吸附后的兔抗副溶血弧菌血清Ｗｅｓｔｅｒｎ印迹法结果显示抗血清与多数副溶血弧菌菌株的外膜蛋白有一条共同的免疫反应带，其大致分子量为４４ｋＤａ。     

副溶血弧菌对文蛤的致病性及其防治

八十年代以来,江苏南部沿海屡次发生文蛤大批死亡现象,使文蛤资源量急剧下降,生产遭受重大损失。关于文蛤大批死亡的原因研究,目前已有几篇报道。郑国兴等[1991]从病文蛤体内分离到溶藻弧菌并证实其致病性。王广和等(1991)研究证实弗尼斯弧菌是引起文蛤大批死亡的病原菌。杨美桂等(1978)报道了1977年引起台湾新竹区养殖丽文蛤大量死亡的病原菌——副溶血弧菌。但有关文蛤病     

副溶血弧菌的致病性及其检验和测定

副溶血弧菌（ＶｉｂｒｉｏＰａｒａｈａｅｍｏｌｙｔｉｃｕｓ）通常存在于海湾和海岸线区域以及海产品中,其致病性很强,常引起人类食物中毒,而且比例很高,目前主要侧重于预防。商检检验和测定采用的是ＳＮ０１７３－９２标准,５ｄ－６ｄ才能出阳性结果,方法繁琐,费时费力,采用《北欧食品分析委员会方法》（ＮＭＫＬＮＯ１５６－１９９７,第二版）,既可以快速定性定量,又可以同时检验霍乱弧菌、创伤弧菌、溶藻性弧菌,使我国水产品及其它食品出口欧盟更具有方法上的针对性。     

一株副溶血弧菌的分离和鉴定

从患病的凡纳滨对虾体内分离了一株致病菌。对该菌进行了常规的生理生化鉴定,确认该菌为副溶血弧菌;该菌在第6 h就进入对数早期,对数期一直持续到22 h;用该菌腹腔注射小白鼠,对小白鼠半数致死量LD50为7.6×106cfu/g。     

副溶血弧菌对养殖大菱鲆致病性研究

从患出血症的大菱鲆体内分离到5株菌,编号为L-0603314、L-0603442、L-0603431、L-0603121、L-0603241。采用肌肉注射的方法进行人工感染,每尾注射0.05 ml,菌浓度为108cfu/ml和109cfu/ml;采用K-B法用青霉素、环丙沙星、四环素、呋喃妥因、红霉素、庆大霉素、链霉素7种药敏纸片对确定病原性的菌株进行抗生素敏感试验,同时进行生理生化特性研究。结果显示,L-0603121菌株为3.0×108cell/ml时只引起个别试验个体轻微症状,1.0×109cell/ml可造成100%感染率,40%死亡率,可确定L-0603121菌株为引起大菱鲆出血症的致病菌株。药敏试验表明,L-0603121株菌对庆大霉素、红霉素、链霉素、呋喃妥因敏感。根据形态观察、生理生化特征等试验结果,确定L-0603121株菌为副溶血弧菌。     

抗哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联卵黄抗体的制备及体外抑菌效果的研究

为研究三联特异性卵黄抗体对哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌的体外抑菌效果,通过制备哈维氏弧菌、溶藻弧菌与副溶血弧菌三联灭活疫苗,免疫蛋鸡。收集鸡蛋制备卵黄抗体并检测其效价、纯度和特异性。通过免疫荧光、扫描电镜和体外抑菌实验初步探究其制备的三联特异性卵黄抗体对三种弧菌的体外抑菌效果。结果显示,ELISA检测特异性卵黄抗体效价高达1:51200,并维持5周;SDS-PAGE对分离纯化的卵黄抗体分析显示,随着纯化步骤的进行,卵黄抗体中的蛋白杂带逐渐减少,纯度变高。免疫荧光和免疫印迹实验表明,特异性卵黄抗体与抗原的结合具有较高的特异性。扫描电镜进一步观察发现,相比非特异性卵黄抗体,特异性卵黄抗体处理过的弧菌,菌体互相黏附在一起,菌体细胞表面粗糙,细胞壁破损。在体外抑菌实验中,特异性卵黄抗体对弧菌具有明显的抑制效果,且抑制作用呈现剂量依赖性。综上所述,本研究制备的三联特异性卵黄抗体能够与哈维氏弧菌、溶藻弧菌和副溶血弧菌发生特异性结合,通过体外实验发现,卵黄抗体通过凝集和黏附,破坏菌体细胞的完整性,从而发挥抑菌作用。     

常用抗菌渔药对副溶血弧菌的作用效果比较

测定市场上8种常用抗菌渔药对副溶血弧菌的最低抑菌浓度(MIC)以及比较这8种常用抗菌渔药单独用药与联合用药对副溶血弧菌的抑杀菌效果.采用2倍稀释法及抑菌圈法测定.8种常用抗菌渔药对副溶血弧菌的MIC分别为:甲砜霉素、氟哌酸为3.2 μg/mL,氟甲砜霉素6.4 μg/mL,土霉素12.8 μg/mL,庆大霉索、盐酸诺氟沙星和链霉素为25.6 μg/mL,而新诺明在25.6μg/mL时仍无抑杀菌效果;8种常用抗菌渔药在10倍MIC下,抑菌圈直径分别为氟甲砜霉素2.05 cm,氟哌酸1.75 cm,盐酸诺氟沙星1.35 cm,土霉素1.23 cm,甲砜霉素1.17 cm,链霉素1.10 cm,庆大霉素1.00 cm;联合用药的抑菌圈直径分别为:氟甲砜霉素与氟哌酸1.55 cm,氟甲砜霉素与土霉素1.43 cm,氟甲砜霉素与盐酸诺氟沙星1.42 cm,盐酸诺氟沙星与甲砜霉素1.30 cm,链霉素与庆大霉素1.23 cm,氟甲砜霉素与链霉素1.18 cm,土霉素与氟哌酸1.12 cm,链霉素与土霉素1.00 cm.通过对抗菌渔药筛选中最佳参数的探讨以及临床用药量与药物的负荷量的关系探讨,结论是抑杀副溶血弧菌氟哌酸为首选,其次为土霉素和甲砜霉素;3组联合用药效果与单独用药相比敏感度不变,5组联合用药则敏感度变低.     

副溶血弧菌致病因子与耐热直接溶血毒素的研究进展

副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)是一种革兰氏阴性嗜盐菌,作为人类致病菌它能够在很广的范围内造成由食物中毒引起的肠胃炎和败血症[1-2].该菌最早是由Fujino等[3]在日本发生的一次爆发性食物中毒中发现并成功分离的一种多形态杆菌,其在不含盐的培养基内不能繁殖,而在含盐浓度较高(超过3%)的培养基中生长旺盛,并广泛存在于海岸和海水中.     

霍乱弧菌TcpA蛋白的表达及其免疫活性分析

采用PCR方法从鱼源霍乱弧菌Y1株（Vibrio cholerae Y1）扩增毒素共调菌毛蛋白A(toxin-corcgulated pilin A,TcpA)基因并克隆至pMD 18-T载体.序列分析显示tcpA基因ORF长675 bp,编码224个氨基酸(GenBank登录号EU649677).同源性比对发现,该基因与GenBank中登录的7个霍乱弧菌参考株相应基因序列的核苷酸同源性和氨基酸同源性均很高,分别为99.6％～ 99.7％和98.7％～ 99.1％,表明TcpA蛋白相当保守.将tcpA基因亚克隆到表达载体pGEX-4T-1,并进行IPTG诱导表达,SDS-PAGE分析发现分子量约为47.0 kD的重组TcpA融合蛋白主要以包涵体形式表达.Western blot检测结果显示,重组TcpA融合蛋白可与鼠抗Vc Y1菌株菌毛蛋白抗血清发生特异性结合反应.用纯化的重组TcpA融合蛋白免疫草鱼(Ctenopharyngodon idellus)制备抗血清,双相免疫扩散试验检测抗体效价达1:16,且该抗血清能够明显抑制Vc Y1菌株对HEp-2细胞的黏附.草鱼免疫后第25天用Vc Y1菌株攻毒,结果相对免疫保护率达到73.33％.研究结果表明,组TcpA蛋白仍保留着天然菌毛蛋白的免疫原性、免疫反应性和免疫保护性,重组TcpA蛋白可作为霍乱弧菌的候选诊断抗原和疫苗抗原.     

Occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar

ABSTRACT

Fishing is among the main economic activities of the people of Zanzibar. Few fish dealers are transforming this sector into mariculture. Among the farmed fish is milkfish. Diseases are among the limiting factors in the development of the mariculture industry. Among other zoonotic diseases, vibriosis is caused by bacteria from the genus Vibrio. This study aimed to establish the occurrence of Vibrio cholerae and Vibrio parahaemolyticus among milkfish farms in Zanzibar. A total of 380 milkfish were sampled. Swabs were collected from gills, intestine, and kidney of each sampled milkfish. Preliminary identification of V. cholerae and V. parahaemolyticus was done by biochemical tests. PCR was run on 16S rRNA, outer membrane protein W, and collagenase genes to confirm Vibrio species, V. cholerae, and V. parahaemolyticus respectively. Almost one-third (32.1%) of all sampled milkfish were found to contain targeted Vibrio; 18% and 29.5% of the sampled milkfish were positive for V. cholerae and V. parahaemolyticus respectively.     

云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗对斜带石斑鱼免疫功能的影响

采用注射云芝多糖和副溶血弧菌灭活苗的方法免疫斜带石斑鱼后,测定了受免鱼的吞噬细胞的吞噬活性、杀菌功能和免疫保护率。结果表明,云芝多糖组在第3天,吞噬细胞的吞噬百分比(PP)达到峰值(90%),显著高于对照组(P0.05),然后开始下降,到第7天即与对照组相当(P0.05);30 m in和60 m in的杀菌率显著提高(P0.05)。灭活苗组和云芝多糖+灭活苗组的PP值和杀菌率显著高于对照组(P0.05),并维持在较高水平,但2组之间差异不显著(P0.05);用副溶血弧菌攻毒后,斜带石斑鱼的免疫保护率达87.6%。由此可见,灭活苗不仅能提高斜带石斑鱼的特异性免疫力,而且也能增强吞噬细胞的吞噬和杀菌活性等非特异性免疫力。     

一株副溶血弧菌噬菌体的分离与鉴定

分离到2株副溶血弧菌噬菌体,筛选出其中具有强裂解性的1株.该噬菌体的噬菌斑中心清亮,边缘有晕环.12 h观察,噬菌斑直径约3 mm,效价为1011pfu/ml.该噬菌体的核酸为线型双链DNA,大小约4 kb.电镜观察显示,头部为正二十面体,直径约110 nm,有尾,尾长约270 nm,底部有3个刺突.按国际病毒分类委员会第五次报告的分类标准,该噬菌体具肌尾噬菌体科的特征,与其他副溶血弧菌噬菌体比较显示,该噬菌体可能是一种新型的副溶血弧菌噬菌体.     

乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌抑制作用的研究

分离到对副溶血弧菌有抑制作用的3株乳酸菌,命名为A-1、A-2、A-3。对其胞外产物的抑制作用进行研究,结果表明:3株乳酸菌胞外产物对副溶血弧菌有较强抑制作用,抑菌环直径分别可达18.6mm、20.3 mm1、9.5 mm;抑菌物质对热处理不敏感:在60℃、80℃抑菌活性基本不变,在121℃处理20min条件下抑菌效果分别是原液的67%,83%,74%,蛋白酶K处理对其活性有较大影响,抑菌成分可能是细菌素。进一步研究了细菌素抑菌活性与乳酸菌培养时间的关系。根据形态特征和常规生理生化反应进行鉴定,A-1、A-2鉴定为嗜热链球菌,A-3鉴定为嗜酸乳杆菌。     

Identification of Vibrio parahaemolyticus in Seafood by Multiplex PCR

ABSTRACT

Vibrio parahaemolyticus is a human pathogen frequently found in seafood. Once the seafood is contaminated by V. parahaemolyticus, it can become a vehicle for foodborne illness. The conventional culture methods for detection of V. parahaemolyticus are time-consuming and cannot differentiate pathogenic strains from nonpathogenic ones. In this study, a multiplex polymerase chain reaction (PCR) technique was investigated for detecting tdh, chiA, and toxR of V. parahaemolyticus. The sensitivity of the multiplex PCR was determined by testing 28 strains of V. parahaemolyticus, 15 non-V. parahaemolyticus strains, and fresh seafood spiked with cells of V. parahaemolyticus. All the strains were analyzed for production of thermostable direct hemolysin (TDH) and chitinase. This study showed that both the chiA and toxR are excellent markers for detecting V. parahaemolyticus strains, and a multiplex PCR targeting chiA and tdh genes can be applied to simultaneously detect environmental and pathogenic V. parahaemolyticus.     

Changes in Biochemical Constituents and Energy Levels of Flower Shrimp,Penaeus semisulcatus,Infected with Vibrio parahaemolyticus

Abstract

During the present investigation, laboratory experiments were conducted to study the changes in biochemical contents such as carbohydrates, proteins, lipids, and energy levels after 96-hour exposure to Vibrio parahaemolyticus, in flower shrimp, Penaeus semisulcatus, post-larvae. The sampling was done at intervals of 24-hours, 48-hours, 72-hours, and 96-hours. The caloric concentrations as well as biochemical constituents except protein showed a decrease in infected post-larvae. In contrast, protein showed an increase in infected post-larvae. A decrease in the ratios of carbohydrate/protein and carbohydrate/lipid was observed in infected post-larvae. The differential responses of biochemical constituents might be due to triggering of compensatory mechanism under stress conditions due to V. parahaemolyticusinfection.