猪繁殖与呼吸综合征病毒柳州地方株NSP2和ORF5基因变异分析

为了给广西柳州预防和控制猪繁殖与呼吸综合症提供理论数据,本研究对利用RT-PCR方法扩增了该地区流行株LZ5和LZ6的NSP2和ORF5基因并进行测序分析,然后与GenBank中已发表的PRRSV毒株的NSP2和ORF5基因序列进行比较。结果显示,2株柳州地方流行株均属于美洲型,在NSP2基因第483位和535~563位氨基酸均存在30个氨基酸的不连续缺失,其NSP2和ORF5基因的核苷酸同源性分别为99.5%和99.7%,推导的氨基酸同源性分别为100%和99.5%;与近几年国内流行的高致病性蓝耳病代表性毒株之间的NSP2、ORF5基因核苷酸同源性分别为94.7%~96.2%和97.2%~98.0%,其推导的氨基酸同源性分别为92.0%~95.5%和94.5%~97.0%。序列分析结果表明此次柳州流行的PRRSV与2006年夏高热病引起的基因序列高度同源,在基因序列上并未显示出新的特性,在国内也缺乏明显的地域性差异。     

2015-2016年北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因遗传变异分析

为了解北方某省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,本研究对2015-2016年省内各地163家养殖场的874份PRRS疑似病料进行RT-PCR检测,并对PRRSV阳性样品的ORF5基因进行测序及变异分析.结果显示,PRRSV阳性样品共209份,阳性率为23.9%.扩增阳性样品的ORF5基因序列,并选取44条有代表性的基因序列,遗传进化分析表明,北方某省PRRSV流行毒株为美洲型毒株,其ORF5基因核苷酸同源性为82.6%~99.5%,与VR-2332、CH-1a、HuN4和JXA1、CHsx1401和NADC30株的核苷酸同源性分别为83.5%~99.3%、85.1%~95.2%、83.5%~99.3%和82.4%~96.8%.基于ORF5基因核苷酸序列绘制的遗传进化树显示,目前北方某省流行的美洲型PRRSV可分为4个亚群,其中24株属于以CHsx1401和NADC30为代表的Ⅱ亚群,19株属于以HuN4和JXA1为代表的Ⅳ亚群,1株属于以VR2332为代表的Ⅰ亚群.各毒株ORF5基因序列之间存在一定差异,但无明显地域性.本研究结果可为北方某省PRRSV遗传进化研究和疫病防控提供参考.     

2016年-2017年广东省部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为研究广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行株ORF5基因的遗传演化情况,采用RT-PCR方法对2016年-2017年采自广东省地区猪场疑似PRRS猪肺脏组织样品中的PRRSV ORF5基因进行了扩增,并对这些毒株的核苷酸和氨基酸序列进行了生物信息学分析.结果表明,成功扩增出12株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段.遗传演化分析表明,扩增出的毒株有10株与国内高致病性毒株亲缘关系较近,属于同一分支;2株与广东地区新报道的毒株QYYZ和GM2亲缘关系较近,属于同一分支.氨基酸序列比对结果表明,新分离的毒株在GP5抗原表位上存在广泛的变异.结果表明,该地区PRRSV毒株已经发生广泛变异.研究结果不仅揭示了广东地区流行的PRRSV ORF5基因的遗传演化特性,也为该地区PRRS的防控提供了科学依据.     

2016-2017年江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查及ORF5基因变异分析

为了解近年来江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）分子流行病学和其遗传变异情况,本次调查于2016-2017年从江西省各地区规模化猪场采集453份疑似猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）的病料,采用RT-PCR方法对所有病料进行检测。结果发现,其中321份病料为PRRSV阳性,阳性率为70.86%,各地区的阳性率在19.15%~84.85%之间。挑选14份阳性样品测序后,经ORF5基因序列分析,江西地区各PRRSV毒株ORF5基因的核苷酸同源性为83%~100%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性在59.9%~98.5%之间。基于ORF5基因的进化树分析表明,14个测序毒株均为美洲型毒株,其中有4株为基因亚型Ⅰ,即高致病性毒株（HP-PRRSV）;3株为基因亚型Ⅱ,即经典毒株;3株为基因亚型Ⅲ,即NADC30-like毒株;4株为新出现的基因亚型Ⅳ。氨基酸序列比对分析表明,基因亚型Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ毒株ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸在3个表位及2个重要的抗原相关区域存在较大变异,其中以NADC30毒株为代表的基因亚型Ⅲ毒株和以GD1404毒株为代表的基因亚型Ⅳ毒株均表现出独有的氨基酸变异,这些变异可能会影响GP5蛋白的免疫原性。本次调查结果表明,2016-2017年江西地区PRRSV流行出现了新形势,美洲型毒株出现了多基因亚型共同存在的局面,以高致病性毒株（HP-PRRSV）为主,NADC30-like毒株和新基因亚型等新毒株的比例较高,同时还存在经典毒株;持续实时监测PRRSV的毒株流行和变异情况,可为临床诊断、药物和疫苗开发及PRRS的科学防控提供依据。     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2004-2009年猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况,从浙江省各个地区采集了109份临床疑似病料,共检测到61份ORF5基因阳性,经序列测定得到可比序列11 7个.在核苷酸序列分析中,发现2004-2005年PRRSV ORF5序列之间同源性为83.6％～99.3％,2006年同源性最高达98.3～99.2％,2008-2009年同源性又有所降低.在氨基酸主要位点分析中,分离毒株的非中和表位27～～30位点与美洲株相比,2004-2006年大部分毒株的29 aa由A29-V29,而2007-2009年大部分毒株的29 aa又由V29-A29;在表位37～45 aa中,所有39位点处由L39”一I39;在表位80～197 aa中,从2004-2009年185 aa大部分都发生了变异,由V185-A185,第189位点由I189-L189.在蛋白生化特性分析中,发现与参考株VR2332 (AY150564)和CH la(AY032626)相比,浙江省PRRSV-GP5蛋白的第100～106位亲水性、表面可及性明显增加,抗原性指数也有所提高,而与参考毒株JX-06-2-EU480750相似.该试验结果说明随着时间的推移,PRRSV ORF5基因发生明显的变异.     

浙江省猪繁殖与呼吸综合征病毒ORF5基因的遗传变异分析

为了解2014-2016年浙江地区猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）ORF5基因变异情况,试验通过RT-PCR方法对从浙江省各地区采集的PRRSV阳性病料进行ORF5基因扩增,应用DNAStar和Mega 5.1软件对所测序列进行同源性和遗传变异分析。结果显示,54株2014-2016年浙江分离株ORF5序列之间核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.1%~100%和80.6%~100%,与经典株VR2332核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.8%~90.4%和81.6%~90.0%,与高致病PRRSV毒株JXA1核苷酸和氨基酸序列同源性分别为83.5%~99.5%和83.1%~99.0%。系统进化分析表明,54个毒株均为美洲型毒株,属于Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ 3个不同的基因亚型,其中基因亚型Ⅲ和Ⅳ毒株是浙江省近年来新出现的毒株。氨基酸序列分析结果显示,54个毒株在GP5蛋白的信号肽区域、非中和抗体表位的氨基酸序列变异较大,而在中和表位氨基酸序列变异较小。本研究结果表明,浙江地区PRRSV流行出现了新形势,多种基因亚型共同存在,其中以基因亚型Ⅰ毒株为主。     

2018年广东部分地区猪繁殖与呼吸综合征病毒流行毒株ORF5基因变异分析

为了解广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株ORF5基因遗传变异情况,采用RT-PCR对2018年采自广东部分地区疑似患有PRRS的猪肺组织样品进行PRRSV ORF5基因扩增以及克隆测序,并进行生物信息学分析。结果表明,成功扩增出18株PRRSV流行毒株的ORF5基因片段。ORF5基因序列分析表明,18株PRRSV流行毒株ORF5基因核苷酸同源性为83.7%~99.8%,PRRSV流行毒株与参考毒株的同源性为62.1%~99.8%。基于ORF5基因的遗传进化树分析表明,18株PRRSV流行株均为美洲型毒株。其中,10株与以JXA1为代表的高致病性毒株亲缘较近,2株与新型高致病性毒株FZ16A相似;1株与以NT1为代表的疫苗返强毒株亲缘较近,1株与以R98为代表的疫苗毒株亲缘性较近,4株与广东新报道的GM2和QYYZ毒株亲缘性较近。DNA推导氨基酸序列分析表明,18株流行株的氨基酸序列与国内已报道的代表株相比发生不同程度的变异,GP5抗原表位上存在着差异。研究结果揭示了广东地区PRRSV有新型强毒株、重组毒株以及疫苗返强毒株的流行,提示养殖者谨慎、合理使用疫苗,防止疫苗毒株返强和毒株重组,为该地区防控PRRS提供参考。     

2016-2020年华北地区猪繁殖与呼吸综合征病毒分子流行病学调查

利用RT-PCR方法对2016-2020年华北地区692份疑似猪繁殖与呼吸综合征(PRRS)临床样本进行检测,获得368份阳性样品,阳性率为53.18%,并对其进行了ORF5基因扩增和测序,开展遗传变异和分子流行病学分析。结果显示,共获得33条完整的ORF5基因序列,除了HB-XT株为600 bp,其余全长均为603 bp。ORF5基因遗传进化分析表明33株均为Ⅱ型,其中有9株分布在Lineage 8,24株分布在Lineage 1。33株之间的氨基酸序列同源性为80.1%～99.5%,与JX-A1株和NADC30株的同源性分别为81.1%～99.5%和85.6%～94.5%。氨基酸分析结果表明,33株均在诱骗表位和中和表位发现了突变;在33株中共发现7个N-糖基化位点,其中包括相对保守的N44和N51位点,以及主要位于抗原表位的N30,N32,N33,N34和N35位点。结果表明,2016-2020年华北地区HP-PRRSV毒株逐渐被类NADC30毒株所取代,成为优势毒株,且ORF5基因变异差异较大,使PRRSV流行变得更加复杂。因此,本研究对PRRS分子流行病学以及疫苗的选择和防控...     

2013年-2014年江西地区PRRSV分离株NSP2及ORF5基因的遗传变异分析

为研究江西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV) ORF5基因的变异情况及NSP2基因的结构特征,采用RT-PCR方法扩增了12份江西地区猪场疑似患PRRS的猪肺脏样品中的ORF5全序列和NSP2部分序列,应用DNAStar和Mega 6.0等软件对所得序列进行同源性比对及遗传变异分析。12株PRRSV ORF5核苷酸同源性为83.7%~99.8%,氨基酸同源性为82.1%~99.5%;与参考毒株JXA1、VR-2332和LV的核苷酸同源性分别为84.9%~99.7%、85.2%~91.0%和62.4%~64.8%。对阳性病料进行了NSP2基因部分序列的扩增,测序结果显示12株PRRSV均属于美洲型毒株,12株PRRSV的NSP2部分序列均存在30个氨基酸的不连续缺失,与高致病性PRRSV有相同的缺失特征。12株PRRSV的ORF5遗传进化树分析显示,10株与高致病性PRRSV处在同一进化分支,进一步说明高致病性PRRSV已成为江西地区的优势流行毒株。     

2014年-2016年广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒Nsp2和ORF5基因的遗传多样性分析

为了解广西地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传进化情况,对2014年-2016年来自广西各地的部分PRRSV阳性病料进行Nsp2和ORF5基因的扩增和测序分析.结果获得34个Nsp2基因序列和45个ORF5基因序列,均属于美洲型毒株.Nsp2基因间核苷酸序列的同源性为91.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为81.3％~84.3％、88.9％~92.1％、94.3％~99.3％和73.5％~75.1％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为51.5％~53.2％.ORF5基因间核苷酸序列的同源性为82.8％~100％,与PRRSV美洲型毒株VR-2332、CH-1a、JXA1及NADC30株核苷酸序列的同源性分别为83.7％~99.5％、85％~95％、83.8％~99.7％和83.2％~86.4％,而与PRRSV欧洲型毒株LV株核苷酸序列的同源性为62.4％~64.5％.基于Nsp2和ORF5基因推导的氨基酸序列绘制的遗传进化树中,广西地区的毒株主要分布在以JXA1为代表的Ⅳ亚群.表明当前广西PRRSV流行毒株以JXA1株为代表的高致病性美洲型毒株为主,各毒株Nsp2和ORF5基因序列存在一定的差异,尚未发现欧洲型毒株和美洲型NADC30类毒株.     

PRRSV SC-GY变异株Nsp2、ORF5、ORF3基因遗传变异分析

为了监测PRRSV流行毒株的基因变异情况,采用RT-PCR方法对四川省广元市某疑似猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)发病猪场病料进行分子鉴定,获得1株PRRSV命名为SC-GY株,并对SC-GY株的Nsp2、ORF5及ORF3基因进行测序比对和系统进化树构建。结果表明,SC-GY株为Nsp2基因发生30个氨基酸不连续缺失、ORF3基因第17位插入1个丝氨酸(S)的美洲型高致病性PRRSV变异毒株,其Nsp2、ORF5、ORF3基因与VR2332、SC2012、CH-1a、JXA1、HUN4、NADC30、HENAN-XINX等国内外代表毒株的核苷酸同源性分别为70.3%~97.9%,82.4%~97.6%,83.1%~98.2%,编码氨基酸同源性分别为62.3%~96.3%,78.0%~95.7%,81.6%~96.5%;而与LV等欧洲型毒株的核苷酸同源性分别为18.9%,60.8%,63.7%,编码氨基酸同源性分别为14.0%,54.9%,57.2%。基因遗传进化树分析表明,SC-GY株与JXA1、TJ、HUN4等前期分离的毒株以及近期在四川周边分离的SC2012、SCwhn09CD、SCwhn14DY等毒株都相距较远。由此表明,该地区PRRSV在当前高频度活疫苗免疫下,流行毒株基因仍在不断变异,猪场应减少PRRSV活疫苗的免疫并加强对临床PRRSV流行毒株的监测。     

PRRSV河北分离株ORF5与NSP2基因遗传变异分析

从河北省新乐市某猪场采集疑似感染猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的病料,通过Marc-145细胞培养,RT-PCR检测等方法鉴定,确认分离到1株PRRSV,暂命名为HB-XL株。进一步对其ORF5与NSP2基因克隆测序,经同源性比较及系统进化树等分析,表明该毒株ORF5与NSP2基因与国内流行的缺失变异株遗传关系较近,与国内外经典美洲型毒株及基因重组毒株QYYZ遗传关系较远且与欧洲型LV毒株处于不同分支;ORF5基因编码的200个氨基酸的第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R),第137位为具有野毒特性的丝氨酸(S);与经典美洲株相比,该毒株NSP2基因分别发生3个碱基和87个碱基的不连续缺失。说明HB-XL株属于美洲型PRRSV并存在不断变异的趋势。     

3株PRRSV变异株理化特性研究及NSP2、ORF5基因序列分析

用Marc-145细胞从广东省3个发病猪群分离到3株病毒,经RT-PCR方法鉴定为PRRSV变异株(NSP21594～1680bp缺失)。3株分离株第1代均对Marc-145细胞适应性不强,第2代可致典型病变,第3代TCID50分别为103.67、104.20、104.75mL-1;在透射电镜下观察主要为40～70nm大小的圆形、椭圆形具有囊膜的病毒粒子;均对氯仿、酸、碱和热敏感。3株分离株NSP2基因与CH-1a、VR-2332等经典PRRSV相比均存在2个位点30个氨基酸缺失,与JXA1、HUN4、HPDEBV等变异株具有相同缺失特性且高度相似,相似性为98.1%～98.3%。ORF5基因均由200个氨基酸组成,与JX-A1、HUN4、HPDEBV等变异株高度相似,相似性为98.5%～99.0%,且第13、151位均为具有强毒特性的精氨酸(R)。本研究进一步证实在广东省内出现以NSP2缺失30个氨基酸为特征PRRSV变异株的流行,也为科学监测和综合防控该毒株感染引起的PRRS奠定了基础。     

广东省PRRSV流行株的分离鉴定及其Nsp2、ORF3、ORF5基因的遗传变异分析

为了探究广东省猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)的流行情况,分析所分离毒株的分子遗传进化特征,本研究用RT-PCR方法对广东11个地区66个养殖场的189份病料进行了PRRSV的检测,结果表明,样本的PRRSV总阳性率为48.7%(92/189),其中变异株占63.0%(58/92);阳性病例样本经处理后接种Marc-145细胞,成功分离到9株PRRSV。对分离到的9个毒株进行ORF3、ORF5基因和Nsp2主要变异区基因的扩增、克隆、测序和遗传变异分析。序列分析结果发现,其中2株Nsp2基因没有缺失,7株病毒的Nsp2基因发生了与高致病性PRRSV毒株相同的缺失,即第481位有一个氨基酸缺失,第532-560位有连续29个氨基酸缺失。同源性分析表明,分离毒株GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2与国内的HB-1(sh)/2002毒株及其它高致病性PRRSV同源性较高;GDX071108和GDSH1则与VR2332、RespPRRSVMLV、CH-1a的同源性较高,分离株之间的同源性为60.3%-100.0%。系统进化分析发现,GDX071108与PA8和RespPRRSVMLV的亲缘关系很近,与VR2332亲缘关系较近;而GDYF、GDZC、GDEP、GDSD、GDSH2、GDTH1、GDTH2则与JXA1、GD、HUB1、HUB2、HN2、HUN1、HNyz、HEB1、HUN4都在HB-1(sh)/2002的同一分支上。     

2014-2015年河南省猪瘟野毒E2、E0基因变异分析

为了解河南省猪瘟病毒近2年的分子特征及变异情况,本试验使RT-PCR方法从猪瘟病料中获得了5株猪瘟病毒的E2基因全序列和其中10株E0基因全序列,并对猪瘟病毒阳性样品的E2和E0基因进行测序及变异分析。结果显示:扩增的河南省5株猪瘟病毒的E2基因,其中4株猪瘟病毒E2基因与石门株E2基因相比存在14个氨基酸的变化,1株和石门株E2基因存在4个氨基酸变化。与Shimen株相比,河南省猪瘟病毒的E2基因有1个糖基化位点的突变。扩增的10株猪瘟病毒的E0基因,发现河南省的猪瘟病毒之间E0基因同源性高,且其E0基因从密码子程度上一直在向远离经典毒株Shimen株和疫苗株HCLV的方向发展。对E2基因和E0基因进行进化分析发现河南省猪瘟病毒承受净化选择压力。以E2基因为基础进行分型,发现河南省共同存在猪瘟病毒1.1型和2.1b型;提示河南省猪瘟病毒变异种类更加多样化。     

2010年-2011年广东地区PRRSV Nsp2和ORF5基因的遗传变异分析

为了解2010年-2011年广东地区猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)流行毒株的遗传变异情况,采用RT-PCR方法扩增所分离的16株PRRSV的Nsp2和ORF5的基因,应用DNA Star、ClustalX2和MEGA5等对所得序列进行比对及遗传变异分析。16株PRRSV的Nsp2和ORF5基因的推导氨基酸序列同源性分别为75.3%～100%和87.5%～100%,与国内高致病性PRRSV代表毒株JXA1的氨基酸同源性分别为74.2%～98.2%和87.5%～99%。Nsp2遗传进化分析显示,这16株PRRSV均属于美洲型毒株,其中15株病毒与以JXA1为代表的国内流行毒株处于同一分支,属美洲亚群Ⅰ;另外1株病毒与VR-2332和疫苗株MLV处在同一分支,属美洲亚群Ⅱ。2010年-2011年广东地区流行毒株仍为高致病性PRRSV,且存在经典疫苗毒株MLV。     

PRRSV NSP2基因在重组杆状病毒中的表达与鉴定

为研究猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)非结构蛋白2(NSP2)之间的差异和生物学特性,本研究根据PRRSV、S1、SY0608株NSP2基因序列保守区设计引物,通过RT-PCR扩增出两毒株的NSP2基因,克隆到pFastBacTM HTB杆状病毒载体中,将筛选的阳性重组载体pF-SI-NSP2和pF-SY-NSP2,分别转化至含有杆状病毒穿梭载体的DH10Bac感受态大肠杆菌中,经蓝白菌落筛选和PCR鉴定,获得重组表达载体rBac-S1-NSP2和rBac-SY-NSP2.在脂质体介导下转染Sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒rAc-S1-NSP2和rAe-SY-NSP2,Westernblot和间接免疫荧光实验结果表明,本研究成功构建了表达PRRSV S1和SY0608株NSP2蛋白的重组杆状病毒,表达的蛋白与自然感染PRRSV的猪血清均具有良好的反应原性,为进一步研究NSP2蛋白的功能及生物学和免疫学特性奠定了基础.     

多重RT-PCR检测PRRSV和CSFV及PRRSV ORF5基因遗传变异分析

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)和猪瘟病毒(CSFV)的基因组序列设计了2对特异性引物,建立了同时检测PRRSV和CSFV的多重RT-PCR方法.2008年1月至2009年12月期间,采集山东各地71个不同规模猪场及农村散养户212份病料,采用建立的多重RT-PCR技术同时检测PRRSV和CSFV的感染状况.检测结果显示,病料中高致病性PRRSV占57.1%(121/212),CSFV占29.2%(62/212).应用RT-PCR方法扩增山东不同地区16株PRRSV的ORF5基因,并进行了序列分析.结果表明,16株PRRSV的ORF5基因核苷酸同源性为97.0%～100.0%;与参考变异毒株JXA1、传统毒株VR2332核苷酸同源性分别为98.0%～99.5%和86.4%～87.7%.推导的氨基酸序列分析表明,16株毒株GP5蛋白氨基酸不存在缺失,但存在位点突变.12株在非中和表位29位点与准种进化34位点发生了突变,分别由V→A和N→S;1株在非中和表位185位点发生突变,由A→V;这与2007年流行的PRRSV毒株JXA1、HUN等不同.