紫椴ISSR-PCR反应体系的建立与优化

分别采用单因子试验和正交设计2种方法对影响紫椴ISSR-PCR反应体系的4个因素(Taq酶,Mg2 ,dNTP,引物)在3个水平上进行优化试验.正交设计选用L9(34)方案,采用直观分析法获得影响因素最佳反应水平.单因子试验分别研究各因素对ISSR-PCR反应的影响情况,找出最佳反应水平.2种方法所得影响因素最佳水平存在差异,通过综合比较与分析,最终建立了紫椴ISSR-PCR的最佳反应体系:在20μL的反应体系中,Taq酶1.0U,Mg2 2.0 mmol·L-1,dNTP 0.20 mmol·L-1,引物0.4μmol·L-1,1×PCR buffer,30 ng模板DNA.在此基础上筛选出14个扩增稳定、多态性丰富的ISSR引物,并通过梯度PCR试验,确定引物最佳退火温度.     

刚竹ISSR反应体系的正交优化

采用正交设计的方法,对刚竹ISSR-PCR反应体系中的5因素(Taq酶、Mg2 、dNTP、模板DNA和引物)4个水平进行优化筛选,建立了刚竹ISSR-PCR反应的最佳体系,即20μL反应体系中含有1×buffer、Taq酶1.5 U、Mg2 2.5 mmol.L-1、模板DNA 80 ng、dNTP 0.15 mmol.L-1、引物0.4μmol.L-1;通过梯度PCR试验筛选得到相应引物的最佳退火温度。     

云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系优化研究

采用交互正交设计L64(421)对濒危植物云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应体系分别进行了5因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP;DNA及引物)4水平的优化筛选,SAS软件统计分析表明:3个单因素(Taq酶;Mg2 ;dNTP)和2个交互作用(Taq×Mg2 ,Mg2 ×dNTP)对此反应体系有显著影响作用.云南红豆杉简并锚定微卫星-PCR反应的优化体系是:在20μL反应体系中含有1×PCR buffer,Taq酶4 U,Mg2 (2.0 mmol·L-1),dNTP(0.4 mmol·L-1),DNA 75 ng,引物(1.0 μmol·L-1),退火温度(54℃).交互正交设计既能快捷有效地筛选出最佳PCR反应体系,又能揭示试验因素及其交互作用对扩增的影响程度,分析结果更客观、准确,具有一定的应用价值.     

萱草属植物ISSR-PCR反应体系的优化

以萱草属的3种植物为材料,对影响ISSR-PCR扩增效果的因素Taq酶用量、Mg2 浓度、dNTP用量、引物用量、模板DNA浓度以及退火温度等指标进行单因子筛选和优化,建立了适合萱草属植物ISSR-PCR分析的最佳PCR反应体系:20μL反应体系中Taq酶0.6U、Mg2 1.8 mmol/L、1×Buffer 2 μL、dNTP0.2 mmol/L、引物0.6mmol/L、DNA模板10 ng/μL.扩增程序为94℃预变性5 min,94℃变性40 s,52℃退火45 s,72℃延伸1.50 min,共39个循环;72℃完全延伸5 min,4℃保持.该反应体系及扩增程序扩增谱带清晰,产物量多,为利用ISSR-PCR分子标记研究萱草属植物的遗传多样性提供标准反应条件.     

适用于厚朴的SRAP反应体系的建立与优化

利用正交试验L16(45),结合单因素试验对厚朴相关序列扩增多态性(Sequence-related amplified polymorphism,SRAP)标记反应体系的5个因素(Mg2+,dNTPs,引物,Taq酶和模板DNA)进行优化试验,结果表明:各因素水平变化对PCR反应的影响从大到小依次为:dNTPsTaq酶模板DNAMg2+引物;筛选出各反应因素的最佳水平,建立厚朴SRAP-PCR反应的最佳体系(25μL)为:Taq酶1.5 U,Mg2+1.8 mmol.L-1,模板DNA100 ng,dNTP 0.24 mmol.L-1,引物0.40μL。试验表明,该体系重复性好、稳定性强。     

构树ISSR反应体系的优化与建立

利用正交试验对Taq酶浓度、引物浓度、dNTPs浓度、Mg2+浓度和模板DNA浓度5个因素进行优化,从而建立了一套适宜构树的ISSR-PCR反应体系.在20 μL的反应体系中,各反应物的最适宜含量为:0.07 U·μL-1 TaqDNA聚合酶、0.35 μmol·L-1ISSR引物、0.3 mmol·L-dNTPs,2.0 mmol·L-Mg2+、1.2 ng· μL-1模板DNA.PCR扩增程序为:94℃预变性5min,94℃变性30 s,46℃退火45 s,72℃延伸2 min,40个循环.     

用正交设计法优化枣树ISSR-PCR反应体系

采用正交设计的方法对枣ISSR-PCR反应体系的5因素(Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTPs、引物的浓度)在4水平上进行优化试验,PCR结果用DPS数据处理软件分析。实验结果表明:各因素的不同水平对PCR反应结果都有显著的影响,其中Mg2+影响最大;筛选出了各反应因素的最佳水平,建立枣ISSR-PCR的最佳反应体系(25μL)为:Taq酶1.0 U、Mg2+1.0 mmol/L模板DNA 1.0μL、dNTPs 0.25 mmol/L、引物0.3μmol/L。     

药用半枫荷基因组总DNA提取及ISSR-PCR反应体系优化

利用正交试验设计方法,对影响ISSR-PCR反应的Mg2＋、dNTPs、引物和Taq DNA聚合酶等因素进行优化的结果表明：在20μL PCR反应体系中含10×PCR Buffer,0.018μmol/L引物,4.0 mmol/L Mg2＋,15 ng/μL模板DNA,1.5 U Taq DNA聚合酶,4种dNTPs各0.15 mmol/L为半枫荷ISSR-PCR最适反应体系。     

野扁桃ISSR-PCR反应体系的优化

以野扁桃为材料,对影响ISSR-PCR扩增结果的Mg2 、dNTPs、Taq酶、模板DNA、引物等因素进行筛选和优化,确立了适合野扁桃ISSR分析的最佳反应体系:25μL PCR反应体系中包含1×Buffer,2.0 mmol.L-1Mg2 ,160μmol.L-1dNTPs,模板DNA30 ng,Taq聚合酶1 U,引物15 pmol。     

红花石蒜 ISSR-PCR反应体系的建立

以红花石蒜叶片基因组DNA为模板,分析了模板DNA、引物、dNTPs、Mg2 的浓度及Taq DNA聚合酶的用量对ISSR-PCR扩增结果的影响.建立了石蒜ISSR分析最优化的反应体系及应用程序:即25 μL反应体系中,有20 ng模板DNA、0.5 μmol·L-1随机引物、150 μmol·L-1 dNTPs、2.0 mmol·L-1 Mg2 、1.0 U Taq DNA聚合酶.反应程序为:94 ℃预变性5 min;然后45个循环:每个循环94 ℃变性45 s,55 ℃退火60 s,72 ℃延伸2 min;循环结束后72 ℃延伸7 min.