小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段.Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene (GenBank NO:EU719611.1)同源.通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intronl (GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-Bl aIR.从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础.     

小麦wx-B1a基因片段的克隆及其RNAi载体构建

为了获得小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体,以小麦品种‘京花1号’开花12天的籽粒为材料,用天根公司植物总RNA提取试剂盒提取总RNA,以wx-B1a基因(GenBank NO:AB019623)的cDNA序列设计一对特异性引物,利用RT-PCR克隆了wx-B1a基因部分cDNA片段。Blastn结果显示,它与GenBank上报道的Triticum aestivum wx-1 gene(GenBank NO:EU719611.1)同源。通过酶切连接将此片段分别置于拟南芥FAD2的Intron1(GenBank NO:AJ271841)的上、下游,然后将此发夹结构置于小麦HMW-GS 1Dx5启动子的下游,从而构建了小麦wx-B1a基因的特异RNAi表达载体pBAC47p-wx-B1aIR。从而为下一步转化高产强筋小麦品种培育优质面条专用小麦奠定基础。     

普通小麦春化基因VRN3的表达分析及过表达载体构建

通过实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析了不同发育特性的普通小麦品种VRN3基因的表达,结果表明：VRN3基因在春性品种新春2号叶片中表达呈上升趋势,在雌雄蕊分化期达到最大值,在强冬性品种京841中表达量很低;VRN3在新春2号和京841茎尖中的表达量均极低。以京841的cDNA为模板扩增VRN3基因全长,连接到pCAMBIA3301载体上,构建VRN3基因过表达载体,通过农杆菌茎尖转化法获得了转基因植株,研究结果为春化基因VRN3对小麦春化发育调控的进一步研究提供依据。     

普通小麦春化基因VRN1 RNA干扰载体构建及转基因小麦获得

为进一步探究春化基因VRN1在小麦发育进程中的功能,利用荧光定量PCR分析了VRN1基因在不同发育特性小麦品种新春2号、京841中的表达情况。结果表明,随着生育进程的推进,VRN1基因在新春2号叶片和茎尖中表达量均呈上升趋势,VRN1基因在京841叶片中呈波动上升趋势,在茎尖中表达量趋于0;以p FGC5941载体为基础构建含有VRN1反向重复序列的RNA干扰载体,利用农杆菌介导的茎尖转化法转化新春2号获得了再生植株,并通过PCR法检测获得了转基因阳性植株,为从分子水平上实现小麦发育特性遗传改良和创育小麦新种质奠定了基础。     

Pina~m-Pinb~m-Gsp~m串联三基因表达载体的构建及其在普通小麦中的转化

籽粒硬度是小麦品质改良的重要目标性状之一,主要由5D短臂上的Hardness(Ha)位点的两个主效基因,即Puroindoline a(Pina-D1)和Puroindoline b(Pinb-D1)控制,同时受基因Grain Softness Protein-1(Gsp-1)的影响。本研究以一粒小麦(T.monococcum)DV92作为Pinam、Pinbm和Gspm基因的供体,将三基因各自完整的表达盒串联连接到载体pGEM-TEasy上,构建Pinam-Pinbm-Gspm三基因串联的表达载体。利用基因枪介导的转化方法转化普通小麦科农199幼胚,共轰击5608个小麦幼胚愈伤,经Biolaphos(化学除草剂)筛选,获得933株再生植株,经PCR检测,鉴定出11株阳性植株,有关转基因小麦的籽粒硬度还需进一步实验验证;本实验实现了串联三基因在普通小麦中的遗传转化,为利用基因枪介导的遗传转化方法改善小麦籽粒硬度提供了可行性。     

山丁子CBF1基因表达载体的构建

CBF1转录因子能调控一组抗干旱、抗低温基因的表达,更有效地提高植物抗干旱、抗低温的能力。以抗寒性较强的长白山野生山丁子(耐-42℃低温)为材料,通过RT-PCR扩增出山丁子CBF1基因,随后亚克隆到pMD18-T载体,序列分析表明与基因数据库中山丁子CBF1对应区域相似性为100%,将该片段亚克隆到原核表达载体pBI121中构建原核表达质粒,转化大肠杆菌E.coli DH5α,在AMP抗性的LB平板上挑取重组质粒,进行PCR并测序结果与预期一致。     

小麦puroindoline基因高效植物表达载体的构建

籽粒硬度是决定小麦品质优劣的重要性状,控制硬度的主效基因为pinA和pinB(统称为puroindoline基因)。本研究利用含有能促进外源基因高效表达的Ω序列、Kozak序列和poly(A)序列的pG4AB及含有Ubi启动子和筛选基因bar的pAHC25,成功构建了含有puroindoline基因的单子叶植物高效表达载体pUBPa和pUBPb。目的是将来通过转基因植物研究,进一步明确pinA和pinB的功能,为通过基因工程方法快速改良我国现有小麦优良品种的籽粒硬度奠定基础。     

抗草甘膦基因表达载体的构建及对玉米的遗传转化

以pCambia3301载体为基础,以玉米Ubiquitin(Ubi)启动子、拟南芥叶绿素转运肽(Chloroplast transit peptide,Ctp)基因、抗草甘膦Epsps基因为元件,构建了玉米高效双元表达载体,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404,并通过农杆菌介导法转化玉米幼胚,获得了抗草甘膦无抗生素标记的转基因玉米植株.经田间初步检测转化玉米植株具有一定的草甘膦抗性.     

Pinam、Pinbm和Gsp-1m基因表达载体构建及遗传转化

子粒硬度是小麦重要的品质性状之一,对小麦的磨粉及加工品质有重要影响。子粒硬度主要受位于染色体5D短臂上Hardness(Ha)的两个主效基因Puroindoline a(Pina)和Puroindoline b(Pinb)的调控及基因GrainSoftness Protein-1(Gsp1)的影响。从一粒小麦(Triticum monococcum)DV92中克隆基因Pinam,Pinbm和Gsp-1m,并构建以Bar基因为筛选标记的重组质粒PC186-Pinam,PC186-Pinbm,PC186-Gsp-1m,通过基因枪介导法将它们分别转入普通小麦科农199中。经过PCR和RT-PCR鉴定,Pinam,Pinbm和Gsp-1m基因分别获得2株转基因阳性苗,结果表明转入基因能在小麦中表达,但有关转基因小麦的子拉硬度还需进一步验证。本研究完成了单基因在普通小麦中的遗传转化。     

小麦淀粉GBSSII基因的克隆、反义和RNAi载体的构建

采用RT-PCR方法从小麦品种豫教2号籽粒中克隆出颗粒型淀粉合成酶II基因(Granule bound starch syn-thase,GBSSII)部分cDNA片段(1 069 bp)(GenBank登录号:EF221764),同源性比较结果显示,它与GenBank上已报道的GBSSII基因有高度的同源性。以pWM101质粒为基础,构建了由35 S启动子调控的GBSSII基因的反义表达载体pWM101GBSSIIA;另外,还以pFGC5941质粒为基础,构建了GBSSII基因的RNAi载体pFGC5941GBSSIIsa,这些载体的构建为研究GBSSII基因的功能打下了很好的基础。     

去穗和萘乙酸涂切口对小麦体内光合产物和磷分配的影响

采用石英砂和营养液相结合的培养方法,对小麦CA9325进行去除部分小穗及在切口处涂萘乙酸（NAA）处理。结果表明,成熟期籽粒干物质和磷分配最多,旗叶最少。供磷处理中,除去1/3穗的各器官干重低于对照外,去1/4和1/5穗的各器官干重高于对照,各去穗处理的根干重、根/冠比、千粒重和籽粒磷均补偿性增加,去1/4穗的植株和籽粒重及磷含量最高。植株磷素吸收量与籽粒磷利用效率呈极显著线性负相关。NAA增加去穗处理的籽粒重及磷含量,说明NAA对小麦籽粒的建成、库的潜力、同化物和磷在体内的运输及向籽粒的积累有正调控作用。     

四个春小麦分蘖成穗规律的比较研究

对四个春小麦品种—川农19、川农17、绵阳11和川麦107进行田间种植研究,旨在从形态学、解剖学的角度来探讨不同生长发育时期小麦分蘖的生长发育与小麦有效成穗的内在关系。研究结果表明：在生长过程中,单棱期持续时间较长有助于小穗数增加;拔节后较长的生殖阶段可以增加子粒数;分蘖的营养生长持续时间相对较短,一级分蘖、二级分蘖生长锥之间呈一定秩序性排列,是产生更多有效分蘖的主要原因,如川农17。     

小麦花粉管途径转化及高效筛选体系的建立

本文报道了一种从大量花粉管途径转化处理后代中快速有效地筛选到转基因植株的方法。转化质粒为含bar筛选标记基因的天麻抗真菌蛋白(GAFP)与兔防御素(NP-1)双价抗病基因植物表达载体(pBI35S-gafp-NP1-bar),受体小麦品种为扬麦158和Alondra。对花粉管途径转化处理获得的种子分3步进行筛选鉴定：首先,转化处理种子密播于塑料盘中,待小苗长到3叶期时,用浓度为120mg／L的Basta除草剂弥雾喷施筛选,约10d后绝大部分小苗变黄枯死,只有约1％的高抗Basta除草剂的T0小苗存活;然后对其Basta抗性植株用gafp基因引物进行PCR检测,其中62．5％的Basta抗性植株为PCR阳性;最后将T0代PCR阳性植株后代种子(T1)分别发芽并按株系混合取样提取DNA,分别用gafp和bar基因引物进行PCR检测验证,结果均为阳性。表明外源基因已整合入小麦基因组并由T0代植株稳定遗传到T1代,同时证明该筛选方法是可靠有效的。     

小麦突变体D51抗秆锈性遗传分析及其抗性基因SSR标记

D51是优良品系龙6239经辐射诱变和组织培养相结合获得的高产优质抗秆锈突变体材料,对我国优势秆锈病21C3CPH、21C3CKH和21C3CTR小种均表现免疫。利用来自D51/龙6239、D51/中国春的2个F₂群体和来自D51/龙6239的1个F₂群体分别在苗期和成株期进行21C3CPH小种接种,抗病反应型鉴定表明,3个F₂群体中抗感分离比例均为3∶1,说明D51抗秆锈性受一对显性基因控制,全生育期表达,部分D51/龙6239 F₂植株的F₃株系的抗病鉴定进一步验证F₂鉴定的可靠性。利用675对小麦SSR引物和185株D51/龙6239 F₂分离群体对SrD51基因进行标记定位,将SrD51定位在5D染色体的短臂上。其中SSR标记Xgwm190和Xwmc150与SrD51基因的遗传距离分别为18.58和21.33 cM,并分别位于目的基因的两侧。由于已知的秆锈抗性基因仅有Sr30被定位在小麦5DL上,且Sr30不抗34C2MKK和34C2MFK,而突变体D51的原亲本龙6239不抗21C3CPH、21C3CKH和21C3CTR,却对34C2MKK和34C2MFK表现免疫抗性。因而推断此突变体的秆锈抗性基因可能是一个新基因,暂命名为SrD51。     

不同小麦品种籽粒淀粉理化特性的差异及其相关

选用非糯性强筋、中筋、弱筋小麦品种和糯性小麦品种（系）,研究淀粉理化特性的差异。结果表明,糯性与非糯性小麦RVA图谱有着明显的差异。峰值黏度、低谷黏度、最终黏度、峰值时间、糊化温度等黏度特征值,糯小麦均显著低于非糯性品种,同一类型不同品种间RVA图谱差异主要是在峰值黏度之后的曲线变化;破损淀粉含量为强筋＞中筋＞弱筋＞糯小麦。糯性与非糯性小麦品种面粉的X-衍射图谱均呈现A型特征,晶体结构差异主要表现在峰值的大小,结晶度变化范围为28.97%~36.97%。相关分析表明,直链淀粉含量、直/支比、破损淀粉含量对淀粉黏度特性有重要的影响,而结晶度对黏度特性影响不显著。     

120份小麦品种(系)重要性状功能基因的KASP检测

为了解120份小麦品种(系)重要性状功能基因的组成,本研究利用高通量的KASP标记技术对株高、抗叶锈病、抗条锈病、抗赤霉病、抗穗发芽和加工品质等性状相关的基因进行了检测。结果表明,供试材料的株高基因组成包含5种类型,分别是Rht-B1a/Rht-D1a (1份)、Rht-B1a/Rht-D1b (58份)、Rht-B1a+160/Rht-D1a (2份)、Rht-B1a+160/Rht-D1b (30份)和Rht-D1a/Rht-B1b (29份)。在抗病性方面,有69份材料含抗叶锈病基因Lr14a,3份材料含Lr68基因;抗叶锈病基因Lr21和Lr34、抗赤霉病基因Fhb1、抗条锈病基因Yr15在供试材料中均未发现。在抗穗发芽方面,68份材料为TaMFT-A1基因的Jagger-type抗穗发芽单倍型,21份材料为TaMoc-A1基因的Hap-H抗穗发芽单倍型,22份材料为TaSdr-D1基因的TaSdr-D1a抗穗发芽单倍型,84份材料为TaPHS1基因的Rio Blanco type抗穗发芽单倍型。在品质方面,83份材料为非1B/1R易位系,20份材料含高分子量麦谷蛋白亚基5+10,供试材料均不含Bx7OE。上述结果表明,对常规育种手段育成的高代品系进行KASP标记辅助选择可作为一种重要的分子育种策略,能显著地提高小麦育种效率。     

小麦转基因再生植株培养体系的优化

以5个基因型不同的小麦幼胚，幼穗作为供试材料，探讨了品种基因型、ABA咱生根条件等对小麦离体培养的影响。结果表明，小麦品种豫麦18－64为遗传转化的良好受体材料；0．2mg/L NAA和0．8mg/L IAA可促进幼苗生根；在幼胚愈伤组织诱导前14d，用0．5mg/L ABA处理可有效抑制出芽率，并有利于促进胚愈伤组织形成和再生能力的保持.