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1.
用DNA合成仪合成了编码ST1肠毒素第58到72位氨基酸残基的DNA片段,并将其与表达融合蛋白的载体PGEMEX-1重组,转化受体菌JM109(DE-3)筛选出重组克隆经过1PTG4小时诱导,ST1融合蛋白的产量超过细菌蛋白总量的40%,最高达59.9%。 相似文献
2.
大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的高效表达 总被引:13,自引:0,他引:13
用限制性核酸内切酶EcoRⅠ和HindⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的质粒pXSLT1,回收084kb的ST1—LTB融合基因,再将载体pET—28b(+)用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后将其与ST1—LTB融合基因连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经EcoRⅠ、HindⅢ、BamHⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒pXETSLT1。重组菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS—PAGE和ELISA检测,结果表明重组菌株可以高效表达ST1—LTB融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的3321%,而且无天然ST1生物毒性。 相似文献
3.
表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合蛋白双价基因工程菌株的构建 总被引:4,自引:0,他引:4
重组菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)经IPTG诱导后,其表达产物经SDS-PAGE和ELISA检测,结果表明重组菌株可以高效表达大肠杆菌肠毒素ST1-LTB 融合蛋白,该融合蛋白占菌体总蛋白的33.21% ,而且已失去天然ST1肠毒素生物毒性。用从IPTG 诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗1.5MLD 的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+ ,LT+ )的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ST1肠毒素的毒性。这表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株 相似文献
4.
利用DNA重组技术,将用PCR扩增来的VP4-ST融合基因分别克隆到原核表达载体pThioHisB及植物表达载体pBin438中,成功构建了重组表达质粒pTh—VP4-ST和pB—VP4ST。将pTh—VP4-ST进行SDS-PAGE分析,结果表明,表达的目的蛋白以包涵体形式存在,大小约40ku;同时将pB—VP4一ST转化了农杆菌EHA105。 相似文献
5.
大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的高效表达 总被引:3,自引:0,他引:3
用限制性核酸内切酶Eco RⅠ和HindⅢ双酶切含大肠杆菌肠毒素ST1-LTB融合基因的质粒pXSLT1,回收0.84kb的ST1-LTB融合基因,再将载体pET-28b(+)用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切,然后将其与ST1-LTB融合基因连接,转化至受体菌BL21(DE3)中。经EcoRⅠ,HindⅢ,BamHⅠ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组质粒pXET-SLT1。 相似文献
6.
将构建的pBST2~6工程菌质粒用限制性内切酶BamHI/BglⅡ酶切,经琼脂糖凝胶电泳和电洗脱,回收147bp的目的ST1基因。随之将该基因分别重组到能有效表达K99菌毛抗原和LacZ酶的pGK99之K99基因BglⅡ位点和pUC18的BamHI位点中。通过ST1基因探针菌落原位杂交、特定酶切分析及DNA序列分析,筛选并鉴定出了理想重组子,从而构建出了能分别表达ST1融合基因产物的工程菌株pSK219和pXST1。 相似文献
7.
用SephadexG150凝胶和DE32离子交换层析,从重组菌PGEMST2株内分离、纯化ST1肠毒素融合蛋白,回收的ST1肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白量的315%。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ST1肠毒素融合蛋白不溶于甲醇、乳鼠试验阴性。对小鼠皮下注射使用安全,对K99强毒菌攻击贩保护率达60%。PGEMST2菌株可以做为预防仔猪腹泻疫苗的候备菌株 相似文献
8.
9.
大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合基因的构建 总被引:13,自引:0,他引:13
用BamHI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌不耐热肠毒素(LTB)基因的质粒pXLT1-1,回收505bp的LTB基因片段,再用BamHI和HindⅢ双酶切含大肠杆菌耐热肠毒素(ST1)基因的质粒pXST1,与上述回收的LTB基因片段连接,转化至受体菌JM109中。经EcoRI、BamHI、HindⅢ酶切反应鉴定重组子质粒,得到了理想重组子质粒pXSLT1。ELISA检测到了ST1-LTB融合蛋白,而且该融合蛋白无天然ST1生物毒性。 相似文献
10.
为表达和纯化金黄色葡萄球菌(金葡菌)超抗原毒素,本研究从金葡菌中克隆葡萄球菌肠毒素C2(sec2)基因,构建了表达葡萄球菌肠毒素C与谷胱甘肽硫转移酶(GST-SEC)融合蛋白的重组质粒(pGEMSEC),通过大肠杆菌表达、亲和纯化、酶切、再亲和纯化,建立了便于大量制备高纯度的重组SEC(rSEC)的简便方法.此外,通过酶联免疫试验及双向琼脂扩散试验检测了rSEC免疫反应性,并通过测定rSEC刺激鼠脾细胞产炎性因子来检测了rSEC的超抗原活性.结果表明,rSEC与野生型SEC具有相同的免疫反应性和超抗原活性,为在今后对该超抗原进行进一步应用性开发和构建定点减毒诱变奠定了工作基础. 相似文献
11.
ST1肠毒素融合蛋白的纯化及部分特性分析 总被引:1,自引:0,他引:1
用SAephadex G-150凝胶和ED-32离子交换层析,从重组菌PGEMST2株内分离,纯化ST1,肠毒素融合蛋白,回收的ST1肠毒素融合蛋白占细菌总蛋白的31.5%。SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳条件呈一条蛋白带。ST1肠毒素融合蛋白不溶于甲醇,乳鼠试验阴性。 相似文献
12.
大肠杆菌耐热性肠毒素ST1—LacZ融合基因的构建 总被引:5,自引:1,他引:4
利用含大肠杆菌耐热性肠毒素ST1基因的质粒pBST2-6和含LacZ基因(编码β-半乳糖苷酶)的载体PUC18,构建成ST1-LACZ融合基因。将质粒pBST2-6用限制性内切酶BamHI和BgIII消化、碱性磷酸酶处理,最后将处理好的PUC18 DNA与147 bpST1 DNA通过T4DNA连接酶进行粘性末端连接,转化不受体菌DH5A中。通过菌落原位杂交筛选,共筛选出53个为ST1基因探针杂交 相似文献
13.
产肠毒素大肠杆菌肠毒素LTB、STI和STⅡ融合基因的构建与表达研究 总被引:6,自引:0,他引:6
PCR方法扩增产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxigenic Escherichia coli,FTEC)LTB、STI、STⅡ基因,将LTB、STI、STⅡ基因重组入pET32a质粒载体,对构建的重组质粒pBST进行酶切分析、PCR检测以及核苷酸序列分析,结果表明,插入片段LTB-STⅡ-STI的核苷酸序列与预期一致,且阅读框正确。pBST在宿主菌BL21(DE3)RIL中的表达产物经SDS-PAGE初步分析,显示重组融合蛋白的分子量约为40kD,其表达量约占菌体总蛋白的46%。 相似文献
14.
将含大肠杆菌耐热性肠毒素I(STI)结构基因的质粒PBST2-6用限制性内切酶BamHI和Bg1Ⅱ消化,经3%琼脂糖凝胶电泳分离、透析袋电洗脱法回收147bpSTI基因片段,再将含LacZ基因的载体PUC18用BamHI消化、碱性磷酸酶处理、然后将处理的PUC18DNA与147bpST1DNA通过T4DNA连接酶酶性进粘末端连接。 相似文献
15.
HIV—1gag基因重组痘苗病毒的构建的高效表达 总被引:4,自引:1,他引:3
Gag蛋白是2 I型免疫缺陷病毒(HIV-1)重要的结构蛋白,可诱导机体产生体液和细胞免疫应答。本试验将HIV-1不同长度的长末端重复序列(LTR)和全长的gagORF置于痘病毒启动子控制下,经过同源重组、红细胞吸附试验筛选和间接免疫荧光试验鉴定,分离了6株重组痘苗病毒。免疫印迹(Western blot)和免疫酶试验检测表明,6株病毒有表达gag基因,其中以v161.G△2的Gag蛋白表达量最高 相似文献
16.
大肠杆菌肠毒素ST1—LTB融合蛋白工程菌株的免疫原性研究 总被引:9,自引:1,他引:8
已构建的能表达大肠杆菌肠毒素ST1LTB融合蛋白的工程菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)及其表达产物经动物试验证实没有毒性反应。用从IPTG诱导的工程菌中提取的包涵体或经甲醛灭活的工程菌制成抗原,免疫小鼠,结果免疫小鼠至少能抵抗15MLD的大肠杆菌强毒株C83902(K88ac,ST+,LT+)的攻击。用提取的包涵体免疫家兔后,采集的血清能够中和天然ST1的毒性。这表明构建的工程菌株BL21(DE3)(pXETSLT1)可以作为预防幼畜大肠杆菌性腹泻基因工程菌苗的候选株。 相似文献
17.
为有效预防肠毒素性大肠杆菌(ETEC)引起的犊牛和羔羊腹泻,将PCR扩增获得的ETECK99菌毛抗原基因和人工合成的ST1基因片段,借助pUCm—T载体,构建了重组质粒pUCm-K99-ST1,从而获得了融合基因K99-ST1;使用EcoRⅠ+SalⅠ双酶切将该融合基因定向插入表达载体pET-30a中,成功构建了表达载体pET—K99-ST1,将其转入表达菌株BL21(DE3)中,经IPTG诱导,获得31ku的蛋白;Western—blotting结果显示,该融合蛋白可与K99阳性血清发生特异性反应。 相似文献
18.
采用PCR技术从产肠毒素大肠杆菌C83922质粒中扩增出耐热性肠毒素(ST Ⅰ)和黏附素K99基因片段,进一步结合基因重组技术成功构建了含有融合基因ST Ⅰ-Linker-K99的重组质粒pMSLK;通过PCR和寡核苷酸定点突变技术将ST Ⅰ毒素中心的6个Cys分别突变成Ser和Gly,经亚克隆后将含有突变位点的融合基因插入到pET-20b表达栽体中,获得了重组质粒pES(S)LK和pES(G)LK;将以上2种质粒分别导入到BL21(DE3)菌株中,成功构建BL21(DE3)(pES(S)LK)和BL21(DE3)(pES(G)LK)2种重组菌株,对其表达产物进行SDS-PAGE和免疫印迹分析.结果表明:这两种重组菌株都能高效表达ST Ⅰ突变体与K99的重组蛋白,而且表达的融合蛋白能够被产肠毒素性大肠杆菌强毒株C83922抗血清特异性识别. 相似文献
19.
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大肠杆菌肠毒素ST1b基因的亚克隆及其核苷酸序列分析 总被引:3,自引:1,他引:2
以大肠杆菌pSLM004菌株为始发菌株,利用合成的一对与ST_1基因特定序列相匹配的引物,通过PCR扩增出了ST_(1b)基因。该基因片段扩增物经适当纯化,与克隆载体pUC18的HincⅡ切点平端连接,转化到受体菌JM101中。利用Ap抗性作为压力选择标志以及LacZ基因插入失活显色反应,在Ap/Xgal-IPTG培养基上,筛选出转化子。将白色菌落转化子经酚/氯仿法抽提重组质粒,利用所扩增ST_(1b)基因片段上所设计的BglⅡ位点及pUC18载体具有的PvuⅡ切点,经酶切反应鉴定重组子,得到了理想重组子pBST2-6。该重组质粒经双脱氧法双向核苷酸序列分析,确定了插入的ST_(1b)基因与载体的连接向位及其全部核苷酸序列。 相似文献